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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

Listeria monocytogenes ist ein Gram-positiven bakteriellen Erreger häufig als ein Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus verwendet. Imaging späten L. monocytogenes-Infektion Stufen im Rahmen der kleinen interferierenden RNA Bildschirme ermöglicht die globale Untersuchung von zellulären Wege für die bakterielle Infektion von Zielwirtszellen erforderlich.

Abstract

Bakterienintrazelluläre Pathogene können als molekulare Werkzeuge zur zellulären Signalkaskaden auf Grund ihrer Fähigkeit, vorzüglich zu manipulieren und zu untergraben Zellfunktionen, die für die Infektion von Wirtszielgewebe erforderlich sezieren konzipiert werden. Unter diesen bakteriellen Erreger ist Listeria monocytogenes eine Gram-positiven Mikroorganismus, der als Paradigma für den intrazellulären Parasitismus in der Charakterisierung der zellulären Immunantworten verwendet wurde, und die instrumentelle Rolle in der Entdeckung der molekularen Signalwege steuern Zytoskelett-und Membrantransport Dynamik gespielt hat. In diesem Artikel beschreiben wir einen robusten mikroskopischen Assay zum Nachweis von zellulären Infektion späten Stadien von L. monocytogenes auf der Basis der Fluoreszenzmarkierung InlC, eine sekretierte bakterielle Protein, das im Cytoplasma von infizierten Zellen akkumuliert, dieser Assay für automatisierte Hochdurchsatz-small interfering RNA-Bildschirme, um char gekoppelt werdenacterize zelluläre Signalwege in der Auf-oder Abwärtsregulierung der Infektion beteiligt.

Introduction

Die Gram-positiven Bakterium Listeria monocytogenes ist ein Lebensmittel übertragbaren Krankheitserreger, der Wirtszellen eindringt, stört seine Internalisierung Vakuole und repliziert im Zytoplasma der Wirtszellen ein. L. monocytogenes Leichtigkeit der Manipulation im Labor Kontext (schnelles Wachstum, geringe Toxizität für gesunde Personen) mit dem Fortbestehen der in Zell-und Tiermodellen beobachtet bakteriellen Virulenz assoziiert (hämolytische Aktivität, Leukozytose) erlaubt seinen ersten Einsatz in den 1960er Jahren als Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus und für die Errichtung der theoretischen Grundlagen der zellulären Immunität gegen eine Infektion 2. In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren, die Präparation der bakteriellen intrazellulären Zyklus 3 sowie die molekulare Charakterisierung der wichtigsten bakteriellen Virulenzfaktoren 4-7 begünstigt die Verwendung von L. monocytogenes als Schlüssel molekulares Werkzeug für die Manipulation und Gestüty von Wirtszellfunktionen. Die Anwesenheit von avirulenten (L. innocua) und virulent (L. monocytogenes) Arten in der Gattung Listeria ebnete den Weg für die vergleichende Genomstudien 8, die zusammen mit der jüngsten Gründung der komplette L. monocytogenes Transkriptom 9, haben unser Verständnis der Evolution von L. erhöht monocytogenes als menschliche Krankheitserreger und als Modellsystem für die Infektion untersucht 10.

L. monocytogenes induziert seine Internalisierung in Wirtszellen bei Wechselwirkung der bakteriellen Oberflächenproteinen InlA und InlB mit ihren Wirtszellrezeptoren E-Cadherin und Met, jeweils 11-12. Anfängliche Kandidat-basierten Untersuchungen führten zur Identifizierung der α / β-Actin Cateninen Verbindung als wesentliche Komponente der InlA-Invasion Kanal 13 und der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3-K) als kritischer Effektor des InlB- abhängig Invasion cascade 14-15. Proteom-und Funktionsbasierte Assays anschließend erlaubt die Identifizierung neuer Zytoskelett-Elemente 16 und Lipid-Second Messenger 17 für Wirtszellinvasion erforderlich. Transkriptions-Studien 18 und Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik 19 haben vor kurzem ein neues Licht über die Aktivierung von Signalkaskaden und Gastgeber der Unterdrückung von Immunreaktionen während L. monocytogenes-Infektion. Auf der Grundlage der Inaktivierung von großen Gruppen von Genen (kinomes, komplette Genome) von small interfering RNA Systembiologie (siRNA) Silencing haben vor kurzem neue Wege für die Analyse der globalen Wirt-Signalkaskaden im Kontext der spezifischen zellulären Funktionen, einschließlich Phagozytose geöffnet und Erreger Internalisierung 20. Genomweite siRNA-Bildschirme haben bereits durchgeführt worden, um zelluläre Kaskaden zur Infektion von L. erforderlich untersuchen monocytogenes in phagocytic Drosophila 21-22, doch diese Art der Analyse nicht in nicht-phagozytische Zellen durchgeführt wurde, die kritische Ziele für die Infektion in vivo darstellen.

Wir haben ein Protokoll für die mikroskopische Detektion der späten Stadien der Infektion durch L. optimiert monocytogenes, die für die Hochdurchsatz-siRNA-Studien von Bakterieneintrag in Epithelzellen geeignet ist. Unser Assay nutzt ein hochinvasiven L. monocytogenes-Stamm, der eine Punktmutation in PrfA, der Haupttranskriptionsregulator von L. präsentiert monocytogenes Virulenzfaktoren 6: diese Mutation (benannt PrfA *) macht PrfA konstitutiv aktiven 23 und führt zu einer erhöhten Expression der Proteine ​​Invasion InlA und InlB daher begünstigt bakterielle Eintrag in sonst schlecht nicht-infizierten Fresszellen. Unsere Auslese zur Infektion beruht auf dem Nachweis der Akkumulation des cytosolischen sezernierte bakterielle Protein InlC zugrunde: dieses Molekül isteine pleiotrope Effektor, der vorzugsweise durch intrazytoplasmatische L. exprimiert wird monocytogenes 9 und welche nimmt nicht nur in der bakteriellen Zelle-zu-Zelle verteilt 24 aber auch Wirtsimmunantwort moduliert 25. Die Fluoreszenzmarkierung InlC Sekretion von intrazellulären Bakterien ermöglicht nicht nur eine klare Unterscheidung infizierter von nicht-infizierten Zellen, sondern stellt auch eine Endpunktanzeige, die verwendet werden kann, um anschließend zu sezieren Infektion in verschiedenen Schritten: Eingabe vakuolären Flucht cytosolischen Bakterien Proliferation und Zell-zu-Zell-Ausbreitung. Dieses Mikroskopie-basiertes Protokoll kann siRNA Bildschirme gekoppelt werden daher zelluläre Signalwege bei der Infektion von Wirtszellen von L. beteiligt studieren monocytogenes.

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Protocol

1. Herstellung von Zell-und Bakterienkulturen, Transfektion Werkzeuge und Primäre Antikörper

  1. Eine frische Agar-Platte, einzelne L. isolieren monocytogenes Kolonien aus einer bakteriellen Glycerin Lager (50% glycerol/50% gesättigte Flüssigkeit Bakterienübernachtkultur), der bei -80 ° C
    1. Mit einem Aluminiumgestell (bei -80 ° C gehalten), um eine gefrorene Bakterien Glycerin Lager, Streifen Bakterien auf einer Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Platte zu transportieren.
    2. Die Platte bei 37 ° C während 48 Stunden (oder bis einzelne Bakterienkolonien isoliert werden kann).
    3. Bewahren Sie diese Arbeitsplatte danach bei 4 ° C während einer Zeit von maximal 1 Monat (es wird verwendet, um Flüssigkulturen zu impfen).
    4. In unserem Protokoll, verwenden wir die L. monocytogenes-Serotyp 1/2a EGDe.PrfA * Stamm, aber wie in Fig. 1, die veranschaulicht L. monocytogenes Serotyp 4b P14.PrfA * Belastung führt zu ähnlichen Ergebnissen.
  2. ErLa ATCC CCL2 Zellen werden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in Abwesenheit von Antibiotika, gezüchtet.
  3. Unabhängige Pools von verschlüsselten (Kontrolle) und Anti-Met siRNAs sind in schwarz 384er-Mikroskopie Zellkulturplatten geladen.
    1. Verdünnen Sie 160 pmol siRNA in 500 ul RNase-freies Wasser und mit 5 ul dieser Lösung pro Well (Endkonzentration: 1,6 pmol).
    2. Bewahren Sie diese Platte bei -20 ° C für einen Zeitraum von 1 Jahr.
  4. Polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen das bakterielle Protein InlC mit einem InlC-GST rekombinantes Protein, wie zuvor beschrieben, 25 durch Immunisierung gewonnen wurden.

2. Reverse-siRNA Zelltransfektion

  1. 72 Stunden vor der Infektion auf Raumtemperatur bringen eine schwarze 384-Well-Mikroskopie Zellkulturplatte, die 1,6 pmol siRNA in 5 ul RNase-freies Wasser in jede Vertiefung.
  2. Zentrifugieren Sie die Platte für 3 min bei 300RCF bei Raumtemperatur bis siRNA, die in den Wänden der Vertiefungen abgelagert worden sein könnte senken.
  3. Bereiten Raumtemperatur DMEM mit 0,4% Lipofectamine RNAiMAX ergänzt.
  4. In 25 ul des DMEM / RNAiMAX Transfektionsmediums in jede Vertiefung (nicht die Transfektion Medium länger als 20 min inkubiert, bevor es an die siRNA).
  5. Bewegen Sie die Platte hin und her, um die siRNA-Transfektion mit der Lösung zu mischen, dann halten Sie die Platte für 1 h bei Raumtemperatur zu ermöglichen siRNA-Lipofectamin-Komplexe zu bilden.
  6. Wasch HeLa-Zellen aus einem konfluenten oder subkonfluenten Zellkulturflasche einmal mit 10 ml 37 ° C vorgewärmtes PBS.
  7. Lösen HeLa-Zellen durch Zugabe von 1 ml 37 ° C vorgewärmt Trypsin zu dem Zellkulturkolben und Inkubation für 3 bis 5 min bei 37 ° C.
  8. Re-suspend-Zellen in 10 ml 37 ° C vorgewärmten DMEM mit 16% FBS.
  9. Zählen von Zellen und bereiten eine Zellsuspension von 12.000 Zellen pro ml in DMEM, ergänzt mit16% FBS.
  10. Dann werden 50 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung in der 384-Well-Platte.
  11. Bewegen Sie die Platte schnell hin und her, um Zellen zu verteilen und lassen Zellen richten sich für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  12. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und halten Sie sie für 72 Stunden in einem befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre bei 37 ° C

3. Zelluläre Infektion und Färbung

  1. Der Tag vor der Infektion, nehmen Sie eine einzelne Kolonie von L. monocytogenes von BHI-Agar-Platte und Resuspendieren in 5 ml BHI-Flüssigmedium in einem 15 ml-Polystyrolröhrchen.
  2. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einem shacking Vorrichtung für Bakterienwachstum zu ermöglichen.
  3. Der Tag der Infektion, waschen 1 ml der über Nacht L. monocytogenes Kultur durch Zentrifugation 2 min bei 10.600 rcf auf einer Tischzentrifuge.
  4. Verwerfen des Überstandes (der das sezernierte Cytotoxin Listeriolysin O enthält) und Resuspendieren des Pellets in 1 ml PBS (repeaT Die Waschschritt 3 mal).
  5. Lesen des bakteriellen optische Dichte bei 600 nm war und die Anzahl von Bakterien (OD = 1 entspricht 1E9 Bakterien / ml).
  6. Vorbereiten des angemessenen L. monocytogenes Verdünnung in DMEM mit 1% FBS: mit hochinvasiven Stämme wie EGDe.PrfA *, empfehlen wir die Verwendung von 5E4 Bakterien in 30 ul pro Well (die Vielzahl der Infektion als 25 für 2000 Zellen geschätzt).
  7. Entfernen Sie das Zellkulturmedium in jede Vertiefung (80 ul) und ersetzen Sie es durch Zugabe von 30 ul des L. monocytogenes-haltigem Medium.
  8. Zentrifugieren der Platte bei 200 RCF für 5 min bei Raumtemperatur auf den Infektionsprozess zu synchronisieren.
  9. Inkubiere die Platte für 1 Stunde in einem befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre bei 37 ° C auf eine vorgewärmte Aluminiumblock.
  10. Entfernen Sie die L. monocytogenes-enthaltenden Mediums aus jeder Vertiefung werden 30 &mgr; l vorgewärmtem DMEM mit 10% FBS und40 ug / ml Gentamicin auf extrazelluläre L. töten monocytogenes.
  11. Inkubation für 4 Stunden in einem 5% CO 2-Atmosphäre bei 37 ° C auf eine vorgewärmte Metallblock.
  12. Eine Lösung von PBS mit 8% Formaldehyd (diese Lösung frisch hergestellt werden, daß die Formaldehyd-Monomere anstelle der Paraformaldehyd-Polymere, verwendet werden) ergänzt.
  13. Ohne Verwerfen des Zellkulturmediums, füge 30 &mgr; l PBS mit 8% Formaldehyd (Endkonzentration 4%) ergänzt und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
  14. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen dreimal mit 80 ul PBS pro Vertiefung (halten die Zellen in einem Gesamtvolumen von 80 ul PBS pro Vertiefung).
  15. Bereiten Sie eine 1:250 Verdünnung des Kaninchen-Anti-InlC Serum in PBS, ergänzt mit 0,2% Saponin.
  16. Werden 10 &mgr; l des primären Antikörpers in jede Vertiefung nach dem Entfernen des PBS und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
  17. Entsorgen Sie die primärenAntikörperlösung und waschen viermal mit 40 ul PBS pro Vertiefung.
  18. Verdünnt das sekundäre Alexa Fluor 546-gekoppelten anti-Kaninchen-Antikörper (1:250), die DAPI-Lösung (1:1500) und Phalloidin-Dy647 (1:150) in PBS, ergänzt mit 0,2% Saponin.
  19. Werden 10 ul dieser Sekundärfärbungslösung in jede Vertiefung und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
  20. Entsorgen Sie die sekundäre Farblösung und waschen viermal mit 40 ul PBS pro Vertiefung (Kommentar Endvolumen von 40 ul in jede Vertiefung und Abdichtung der Platte).
  21. Die Platte kann sofort abgebildet werden oder können bei 4 ° C lichtgeschützt (mit Alufolie abdecken) für die spätere Analyse gespeichert werden.

4. Bild-Akquisition und Analyse

  1. Erwerben Sie Bilder in drei verschiedenen Kanälen (350 nm, 546 nm und 647 nm) mit einem 10X-Objektiv auf einem automatisierten Mikroskop montiert (bevorzugt erwerben 9 Bilder pro Vertiefung).
  2. Die InlC Signal kann mit Hilfe von Bild gemessen werdenAnalyse-Software wie CellProfiler, die automatische Segmentierung der Zellkerne und Zellkörper mit der DAPI-Färbung und die Phalloidin bzw. ermöglicht.

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Representative Results

Fluoreszenzmarkierung von zytoplasmatischen InlC bietet eine robuste Anzeige für Zellinfektion durch L. monocytogenes, wie in Fig. 1 veranschaulicht: die zentrale Zelle in dem Mikrobild wird von dem Stamm P14.PrfA * 23 infiziert, wie es in dem Phasenkontrastbild (Pfeilspitzen, Fig. 1A) beobachtet werden, und es wird durch das DAPI-Signal bestätigt wird, wo einzelne Bakterien deutlich unterscheiden (Abbildung 1B). Die InlC Färbung (DAPI zum Färben in 1C lagert) zeigt, wie diese dicht sezerniertes Protein akkumuliert im Cytosol von infizierten Zellen und ermöglicht eine eindeutige Erkennung der infizierten Wirtszellmorphologie. Die Färbung des Aktin-Zytoskeletts mit fluoreszierenden Phalloidin (1D) bietet Informationen über die Morphologie der komplette impften Zellmonolayer und zeigt ferner, wie benachbarten nicht-infizierten Zellen (Zellkerne mit einem Stern markiert) do keine InlC Kennzeichnung anzuzeigen. Es lohnt sich zu erwähnen, dass, da InlC cytosolischen Ebenen sind abhängig von der Anzahl der zytoplasmatischen Bakterien, wir haben eine Korrelation zwischen dem durch Immunfluoreszenz und die Anzahl der detektierten L. InlC Signal merkt monocytogenes pro Zelle: wie in Abbildung 1 beobachtet, benachbarte Zellen mit niedrigen Keimzahlen infiziert zeigen eine reduzierte InlC Färbung, die quantifiziert werden können. Interessanterweise ist es auch möglich, zu beobachten, dass InlC leicht in den durch die Bakterien in dem Verfahren der Zell-zu-Zell-Ausbreitung (Fig. 1C), wie auch mit der Actin-Färbung (Fig. 1D) beobachtet gefangen gebildeten Vorsprünge detektiert. Zu beachten ist, Bakterien nicht direkt in unserem Protokoll gefärbt aber da die 488-nm-Kanal wird nicht verwendet, L. monocytogenes unter Verwendung eines spezifischen anti-bakterielle Serum markiert werden, andernfalls kann GFP-exprimierenden Bakterien alternativ verwendet werden.

Verwendung von Bildanalyse-Tools wie ter öffentlich Software CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.org ), ist es möglich, Zellen-Segment und die InlC Signal in einzelnen infizierten Zellen, die benutzt werden können, um eine Infektion Index für einen bestimmten experimentellen Bedingungen schätzen messen. Wie in Fig. 2 gezeigt ist, die Markierung der Zellkerne mit DAPI (2A) und das Zytoskelett mit Phalloidin (2C) Bereitstellung der zellulären Segmentierung benötigten Informationen: die Kerne dienen als Referenzobjekte für die Identifikation von Einzelzellen (Abbildung verwendet 2B) und das Zytoplasma wird anschließend unter Verwendung eines Streufunktion aus den Kernen, die Berücksichtigung der Zytoskelett-Signal (2D) nimmt identifiziert. Schließlich kann die Intensität des InlC Signal für jeden identifizierten Zellobjekts (Fig. 2E und 2F) quantifiziert, um die Anzahl der zu schätzenwenn ein Schwellenwert für die InlC Intensität, die wir als negativ infizierten Zellen. Die Infektion Index wird als die Anzahl der infizierten Zellen in der Population, geteilt durch die Gesamtzahl der Zellen berechnet.

Unser Protokoll kann siRNA Bildschirme gekoppelt werden, um die Funktion der großen Platten von Zielmolekülen in der Infektion von Wirtszellen durch L. untersuchen monocytogenes. Kontrollen erforderlich, um die Effizienz der Transfektion zu validieren: beispielsweise siRNA Targeting KIF11 eine häufig verwendete Kontrolle für die Transfektionseffizienz, die zum Zelltod führt, und daher die Abwesenheit von Zellen am Ende des Tests ist ein Hinweis, dass die Transfektion effizient verlief. Um speziell auf die L. monocytogenes Invasionsprozess, siRNA Inaktivierung des zellulären Rezeptor Met in HeLa-Zellen führt zu einer bedeutenden Hemmung der bakteriellen Eintritt in Wirtszellen und führt zu sehr geringen InlC-positive Zellen in einem inokulierten Zellmonolayer (Abbildung3A) im Vergleich zu Zellen, die mit einem verwürfelten siRNA Steuerung (Fig. 3B) behandelt. Die Funktion der Kandidat unbekannte Moleküle können mit unserer Test unter Verwendung dieses bekannten Zellmolekül als Standard untersucht werden.

Figur 1
Fig. 1 ist. Nachweis von InlC Kennzeichnung in HeLa-Zellen mit L. infiziert monocytogenes Stamm P14.PrfA *. HeLa-Zellen CCL2 wurden infiziert, wie in unserem Protokoll beschrieben, Immunfluoreszenz verarbeitet und abgebildet mit einem 63X Ziel. (A) Phasenkontrastbild sind mehrere P14.PrfA * Bakterien durch Pfeilspitzen markiert. (B) DAPI-Färbung (blau), werden die gleichen einzelnen Bakterien, wie in (A) durch Pfeilspitzen markiert. (C) Überlagerung der DAPI-Färbung (blau) undInlC Färbung (rot) werden die Kerne von nicht-infizierten Zellen durch ein Sternchen gekennzeichnet. (D) Überlagerung der InlC (rot) und Aktin (grün)-Signale. Bar:. 5 um Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Figur 2
2. Segmentierungsanalyse von HeLa-Zellen, infiziert mit L. monocytogenes Stamm EGDe.PrfA *. CCL2 HeLa-Zellen wurden infiziert, wie in unserem Protokoll beschrieben, Immunfluoreszenz verarbeitet und abgebildet mit einem 10X-Objektiv. (A) DAPI-Signal. (B) Überlagerung der DAPI-Signal (blau) angezeigt in (A) und Aktin (rot) angezeigt, in (C), die die Segmentierung der Kerne (view vergrößert Kasten). (C) Actin-Signal. (D) dasselbe Bild wie (B), die die Segmentierung der Zellen. (E) InlC Signal. (F) gleiche Bild wie (D) mit Überlagerung der InlC Färbung (gelb). Bar:. Um 50 Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Fig. 3
3. . Variation der InlC Kennzeichnung zwischen den Zellen für Met und Kontrollzellen inaktiviert HeLa-Zellen wurden zunächst CCL2 Reverse-transfiziert mit einem Pool von vier siRNAs den Host-Zell-Rezeptor Met, 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen infiziert, wie beschrieben, für Immunfluoreszenz verarbeitet und abgebildet mit einem 10x-Objektive. (A) Überlagerung der DAPI (blau), Aktin (rot) und InlC (gelb) in den Zellen für Met inaktiviert. (B) Gleiche Kanäle wie in (A) über die Zellen mit einer verschlüsselten Steuer siRNA behandelt. Bar:. Um 50 Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

Mehrere Parameter sind kritisch für den Erfolg unserer InlC Erfassungsprotokoll, einschließlich der Verwendung von gesunden Zellinien Anzeigen einer ausreichend großen Zytoplasma eine eindeutige Erkennung der InlC Signals zu ermöglichen. Bei dem Test in diesem Artikel schlagen wir die Verwendung von HeLa CCL2-Zellen, die sich besonders gut für unseren Test geeignet aufgrund der Erweiterung ihrer zytosolischen Raum sind wir präsentieren, andere HeLa-Klone wie HeLa-Zellen Kyoto um einen kleineren Zytoplasma kann aber verwendet werden Infektion mit unserem Protokoll (Kyoto HeLa-Zellen sind besonders gut für die Segmentierungsanalyse angepasst werden, da Zellen nicht mit benachbarten Zellen, was oft der Fall ist für HeLa-Zellen überlappen CCL2). Zellen, die einen sehr kleinen Zytoplasma wie polymorphkernige Zellen oder Makrophagen sind nicht zu empfehlen, um Verbindung mit unseren in-Protokoll verwenden.

Eine Einschränkung einer Bildgebungsprotokoll wie die, die wir hier präsentieren, ist die Tatsache, dass eine minimale Menge der Zellen sollte InFE werdenCTED, in einer gegebenen Monolayer in Kontrollbedingungen, um das System mit ausreichend Strom zu versorgen auflösende: andernfalls, wenn wenige Zellen infiziert sind, wird es schwierig, Veränderungen in der Infektionsraten zu bestimmen, vor allem bei der Untersuchung der Funktion der potenzielle molekulare Kandidaten, die sind erwartet, um eine Infektion zu reduzieren. Diese Einschränkung stellt ein wirkliches Problem bei der Verwendung von HeLa-Zellen, die als das einzige Oberflächenrezeptor für die L. Met express monocytogenes Protein InlB und werden daher von den meisten schlecht L. fallen monocytogenes-Stämme. Eine Alternative ist es, einen sehr hohen Multiplizität der Infektion (MOI> 100) verwenden, der die Anzahl von invasiven Bakterien erhöhen können, erhöht aber das Risiko von Zellschäden durch höhere Niveaus in dem Zellkulturmedium von dem porenbildenden Bakterientoxin Listeriolysin O (auch LLO), die eine sehr starke zytotoxische Aktivität zeigt. Andere Alternative ist die Verwendung von Super-invasive Stämme, wie der Stamm EGDe.PrfA * im Protokoll vorge, Was die Verwendung einer niedrigen MOI (<25) und reduziert die Menge der LLO-abhängigen zytotoxischen Effekte, Ergebnisse mit einer L. gewonnen monocytogenes super-invasive Stamm kann anschließend mit anderen, weniger virulenten Bakterienstämme in anderen Arten von Tests validiert werden (siehe unten). Eine dritte Alternative ist es, eine andere Zelllinie, die sowohl die E-Cadherin-und Met Ausdruck verwenden: es der Fall für Zelllinien, wie den Trophoblasten artigen JEG3 oder BeWo-Zellen oder den LoVo-Kolonkarzinom-Zellen, die durch sowohl eingedrungen werden kann, die InlA-und die InlB abhängige Eintragspfade; in diesen Zelllinien, höhere Zellinfektion kann mit L. erreicht werden monocytogenes-Stämme wie EGDe, der Elternstamm von EGDe.PrfA *. Es sollte berücksichtigt werden, jedoch kann die Redundanz der Funktionen in beiden Wege zur Kompensation Effekte in einem Weg zu führen, wenn ein Effektor ist in dem anderen Pfad inaktiviert, wodurch die Analyse der Ergebnisse erschwert. Es ist auch wichtig zu erwähnen thaT-Zellen nicht sein sollte, um das System mit einer guten Dynamik, die den Nachweis von Ereignissen, die Infektion zu erhöhen over-infiziert: in unserem speziellen Protokoll, führt unsere MOI zu einem optimalen Infektionsrate von 30%.

Alternative Methoden, um die Invasion von Wirtszellen von L. studieren monocytogenes sind die klassischen Gentamicin Invasionstest 26, der auf dem extrazellulären Abtötung von Bakterien durch Zugabe von Gentamicin in das Zellkulturmedium nach einem anfänglichen Zeitraum von bakteriellen Infektionen (ähnlich der in den ersten Teil der Infektion Protokoll vorgestellt Verfahren) beruht und Invasion durch Plattieren überlebenden intrazellulären Bakterien auf Agar-Platten und Zählen der Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE), die auf diesen Platten wachsen erzielt. Dieses Verfahren bietet den Vorteil der Verwendung des direktesten Auslese für Infektion, die die genaue Zahl der invasiven Bakterien, die tatsächlich aus der Gentamicin treatme geschützt istnt im cytoplasmatischen Raum des Wirtszellen, jedoch stellt dieses Verfahren eine einzelne Ausgabe für Infektion und wenn die Wirtszellen lysiert werden, um intrazelluläre CFUs zu lösen, gibt es nicht länger eine Aufzeichnung, um Informationen zu erhalten über den tatsächlichen Status der Zellen, die an dem Endpunkt des Experiments. Unser Protokoll basiert auf einem indirekten Verfahren der Erfassung des sekretierten Proteins InlC basiert, aber wie zuvor erwähnt, die Pegel der zytoplasmatischen InlC korreliert mit der Anzahl der cytosolischen L. monocytogenes (Abb. 1). Darüber hinaus ist die innere Natur der Mikroskopie-Test erlaubt es, eindeutig festzulegen, den genauen Status der Zellen am Ende der Infektion: wir können daher Extraktion von Informationen über weltweite Zellmorphologie, Aktin-Zytoskelett Verteilung, Zellzyklus-Phase etc. und führen hohe Gehalt Analyse der Infektion. Eine wichtige Funktion, die von dieser Art der Analyse extrahiert werden kann, ist die Bevölkerung Kontext und dessen Einfluss auf die Infektion: Ja jüngste Arbeit von Pelkmans und Mitarbeiter zeigten, dass die 27 bestimmte Population Zusammenhang mit einer bestimmten Zelle (z. B. seine Position von der Peripherie in einer Gruppe von Zellen in einer Insel) betrifft mehrere Zellfunktionen einschließlich der Endozytose und die Anfälligkeit für Virusinfektion. Unser Test zeigt somit das Potenzial für die Gewinnung dieser Informationen.

Unsere Methode stellt einen zusätzlichen Vorteil: Seit InlC ist eine späte Auslesen der Infektion aufgrund der Sekretion von Zytoplasma-Bakterien, konnte Host Signalwege, die die Ebenen der InlC Akkumulation in Wirtszellen möglicherweise beeinflussen nicht nur Bakterien, sondern auch Vakuolen Eintrag Flucht, cytosolische Proliferation und schließlich von Zelle zu Zelle ausbreiten. Folglich kann unser Verfahren als Hauptanzeige für globale Infektion verwendet werden kann, um sekundäre Assays gekoppelt werden, um die spezifischen Infektionsschritt, der durch die Primär Hit durch siRNA Screens identifiziert gestört wurde sezieren. Schließlich ist es wichtig zu erwähnen, dass unser Verfahren können hochskaliert und voll automatisiert werden mit Plattenwaschvorrichtungen und erhöht daher die Anzahl der Proben in einem einzigen Experiment analysiert, während die Verringerung der Höhe der Ergebnisse Variation im Vergleich zu Versuchen erfolgt manuell.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Research in P. Cossart Labor ist vom Pasteur-Institut, dem Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, dem Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), der Agence Nationale de la Recherche (MIE-Zuschuss unterstützt SignRupVac), den Louis-Jeantet-Stiftung und der Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK ist ein Empfänger eines Stipendiums von den Pasteur-Universität Paris Internationale Promotionsprogramm / Institut Carnot Mala infectieuses. Wir danken Jason Mercer für die Optimierung der Zell Transfektionsprotokolls.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Tags

Immunologie HeLa-Zellen Listeria monocytogenes Gram-positive bakterielle Infektionen Fluoreszenz- High-Throughput Screening Assays RNA-Interferenz Listeria monocytogenes Infektion Mikroskopie small interfering RNA

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em
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Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

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