Simulation von Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität:<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zwei-Neuron-Plastizität Assay

Zusammenfassung

Neuronale Plastizität ist eine zunehmend erkannt, aber unzureichend verstanden Funktion des Magen-Darm (GI-Trakt). Hier im Beispiel der menschlichen Bauchspeicheldrüse, stellen wir einen in vitro-Assay Neuroplastizität für die Untersuchung der neuronalen Plastizität im GI-Trakt sowohl morphologischen und funktionellen Niveau.

Zusammenfassung

Neuroplastizität ist ein inhärentes Merkmal des enterischen Nervensystem und Magen-Darm-(GI) Innervation unter pathologischen Bedingungen. Allerdings bleibt die pathophysiologische Rolle der Neuroplastizität in GI-Erkrankungen bekannt. Neuartige experimentelle Modelle, die Simulation und Modulation der Neuroplastizität GI erlauben kann verbesserte Wertschätzung des Beitrags der Neuroplastizität insbesondere GI Krankheiten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs (PCA) und chronischer Pankreatitis (CP) zu ermöglichen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Simulation von Bauchspeicheldrüsen neuroplasticity unter in vitro Bedingungen mit neugeborenen Rattenhinterwurzelganglien (DRG) und Plexus myentericus (MP) Neuronen. Diese Dual-Neuron-Ansatz ermöglicht nicht nur die Überwachung der beiden Orgel intrinsische und extrinsische-Neuroplastizität, sondern auch ein wertvolles Werkzeug, um neuronale und gliale Morphologie und Elektrophysiologie zu beurteilen. Darüber hinaus ermöglicht es funktions Modulation der mitgelieferten Mikroumgebungs Inhalte für das Studium ihrer impact auf Neuroplastizität. Einmal eingerichtet, ist die vorliegende Neuroplastizität Assay trägt das Potenzial, für das Studium der Neuroplastizität in jedem GI Orgel.

Einleitung

Veränderungen im Magen-Darm-(GI) Nerven Morphologie und Dichte haben die Aufmerksamkeit der Gastroenterologen und Pathologen für eine lange Zeit gefangen, aber ihre Bedeutung für die Pathophysiologie der GI-Erkrankungen ist unbekannt ^03.01. Tatsächlich sind mehrere hoch gemeinsamen GI-Erkrankungen wie Gastritis, Reflux-Ösophagitis, Kolitis, Divertikulitis, Appendizitis und mit erhöhter Innervationsdichte in entzündeten Gewebebereiche ¹ zugeordnet. Es wurde jedoch keine echte Aufmerksamkeit bisher auf die Mechanismen und Bedeutung der Neuroplastizität im GI-Trakt bezahlt. Sie morphologisch veränderten GI Nerven unterscheiden sich von normalen GI Nerven, also der Normalzustand des enterischen Nervensystems, in ihrer Funktion? Was sind die Auswirkungen von veränderten Neuropeptid / Neurotransmitter Gehalt in magensaftresistenten Kunststoff Nerven? Hat peripheren Neuroplastizität immer bringen veränderte Signalisierung an das zentrale Nervensystem? Und wo sind die zentralen Projektionen der Kunststoff ExtriNSIC GI Nervenbahnen? Eine lange Reihe von Schlüsselfragen wie leicht, wenn man den Mangel an unserer Kenntnisse über die funktionalen Aspekte der Neuroplastizität GI erzeugt werden.

Die Studie von GI Neuroplastizität bei Funktionsebene erfordert gültige, reproduzierbare und noch leicht anwendbar experimentellen Modellen. In einer Zeit zunehmender Beliebtheit und Akzeptanz von gentechnisch bedingte Mausmodellen (GECoMM), wie in vivo-Einstellungen tragen das Potenzial, bisher unbekannte Facetten der GI Neuroplastizität in einer realistischen Art und Weise ^ein aufzuklären. Jedoch bleibt die Konstruktion und Produktion von GECoMM teuer, arbeitsintensiv und vor allem zeitaufwendig ist. Darüber hinaus erfordern sie die a-priori-Auswahl des Ziel bedingt in der genetisch veränderten Maus (z. B. transgene Überexpression von Nervenwachstumsfaktor / NGF in enterischen Epithelzellen) moduliert werden. Daher ist für die DESign einer erfolgreichen GECoMM, brauchen die Forscher einige Indikatoren (z. B. früheren experimentellen Daten) einer lohnendes Ziel, das heißt, dass das Molekül von Interesse (hier NGF) zumindest erwartet, dass einige biologisch relevante Auswirkungen auf die GI Nerven auszuüben.

Solche Indikatoren können leicht von in-vitro-Modellen, in denen ausreichende isolierten Zelltypen aus der komplexen Mikroumgebung eines In-vivo-System kann wahlweise in einem hetero Weise ^4-7 kokultiviert werden, abgeleitet werden. Die Modulation des molekularen Targets in einer solchen heteroKulturEinstellung beträgt durchschnittlich technisch weniger aufwändig, schneller, und kann daher in der Vorfilterung lohnenswertes Ziel unterstützen zur Überprüfung in in vivo-Studien.

Kürzlich haben wir eine in-vitro-Assay Neuroplastizität, die entworfen wurde, um die erhöhte neuronale Dichte und Hypertrophie der intrapankreatischen ne simulierenRVE im menschlichen Pankreas-Krebs (PCa) und chronischer Pankreatitis (CP) Gewebe. Hier wurden Neuronen aus neugeborenen Ratten dorsalen Wurzelganglien (DRG) und Plexus myentericus (MP) abgeleitet wird, um Gewebeextrakten von chirurgisch entfernten PCa oder CP Geweben Proben belichtet und im Vergleich zu denen in normalen menschlichen Bauchspeicheldrüse (NP) Gewebeextrakte ⁵ kultiviert. Anstelle von Gewebeextrakten, kann man auch Zelllinie Stände, die Auswirkungen der ausgewählten Zelltypen auf Neuroplastizität zu studieren. Wenn eine standardisierte morphometrische Messungen kombiniert werden, kann der Test gültig präsentiert Neuroplastizität und reproduzierbaren Beurteilung von neuronaler Plastizität in Reaktion auf verschiedene pankreatischen Mikroumgebungen. Insbesondere ermöglicht es die Simulation 1) morphologische Neuroplastizität, dh die Änderungen in der Neuritenwachstum, Verzweigungsmuster und neuronalen Größe und 2) funktionelle Neuroplastizität, dh Veränderungen in der Erregbarkeit von peripheren Neuronen. Darüber hinaus sind nicht nur Peripheriegerät ( Ente), aber auch zentral (zB DRG oder zweiter Ordnung Rücken) Neuronen können in der vorliegenden Assay auf ihre morphologischen und funktionellen Reaktion auf verschiedene Gewebe GI Inhalt bewerten einbezogen werden. In dem vorliegenden Video-Tutorial zeigen wir, das technische Protokoll für die Durchführung dieses Tests und diskutieren seine Vorteile und Schwächen. Darüber hinaus weisen wir auf die Anwendbarkeit der Grundgedanke dieses Assays zum Studium der Neuroplastizität in jedem GI Orgel.

Protokoll

Alle Tierversuchsverfahren im Protokoll befolgen Sie die Tierpflege-Richtlinien der Technischen Universität München, Deutschland.

1. Medien / Auszug Vorbereitung

1. Gewebehomogenisierung
   Die Qualität der Homogenisierung Gewebe ist für den nachfolgenden Nachweis von neuroplastischen Veränderungen in kultivierten Neuronen. Hier wird empfohlen, die ein Homogenisator Gewebedissoziation ermöglicht ohne große Erhöhung der Gewebetemperatur.
   1. Über 5 mm x 5 mm x 5 mm große Würfel von Pankreasgewebe direkt von -80 ° C bis flüssigem Stickstoff und in einer festen Phase im Gewebe homogenator. Die ideale homogenator würde das Gewebe schnell genug distanzieren, ohne dass es um aufzutauen.
   2. Unmittelbar nach der Dissoziation, resuspendieren festen, pulverförmigen Homogenat in 300-500 ul 0,1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Hier verwenden Sie keine Lyse-Puffer (wie RIPA), da dies die Nervenzellen zu lysieren.
   3. Zentrifugieren der Homogenate für mindestens 15 min bei maximaler Geschwindigkeit der Tischzentrifuge (z. B. 21.130 xg). Sammeln Sie die klare Überstand, der die Gewebeextrakt darstellt.
2. Zelllinie Stände
   1. Lassen Sie die Zellen von Interesse zu erreichen mindestens zu 70 - 80% Konfluenz in normalem Wachstumsmedium.
   2. Normalerweise werden diese Medien enthalten Serumkomponenten und können unkontrollierbare Auswirkungen auf die neuronale Wachstum ausüben. Deshalb wird nach Erreichen der gewünschten Zelldichte, waschen Sie Ihre Zellen mindestens 3x mit Zellkultur-Grade-PBS und legen Sie sie in Serum-freien Medium (SFM) für bis zu 48 Stunden.
      Hinweis: Hier berücksichtigen, dass bestimmte Zellen (wie Pankreassternzellen) Serum müssen in ihrem Wachstumsmedium, um ihre normalen Zustand und die Struktur aufrecht zu erhalten. In solchen Fällen führen serielle Verdünnungen Serum im Medium der Zelle von Interesse, um die bestmöglichen Serumgehalt für intakte Zelle notwendig funk findenn.
   3. Messung der Proteinkonzentration der Gewebehomogenat oder Zellüberständen mittels Bradford-Proteintest. Obwohl diese Werte abhängig von der Gewebe-und Zelltyp variieren, Pankreasgewebeextrakte, würde man einen Konzentrationsbereich von 5-12 ug / ul zu erwarten, und für die Zelllinie Stände zwischen 3-8 ug / ul.

2. Aliquot Extrakte und Zellüberständen

Abhängig von der Konzentration in dem Assay verwendet werden, sollte die Endkonzentration des Extrakts oder der Überstand in der neuronalen Medium 100 ug / ml ^5,8 sein.

Anmerkung: Für einen Test mit Neuronen in 500 ul Medium wachsen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen benötigt man 50 &mgr; g Protein von jedem Extrakt oder Überstand pro Vertiefung. Bei einer typischen Extrakt-Konzentration von etwa 10 ug / ul, ein 5 ul Extrakt / Stand müssten für jeden gut. In jedem setting als dreifach durchgeführt, würde dies zu 15 ul Extrakt / Stand entsprechen. Für verschiedene Gewebe oder Zelltypen, führen serielle Verdünnungen der endgültigen Extrakt oder Überstand Konzentration und vergleichen Sie die beobachteten Effekte zwischen verschiedenen neurotrophen Extrakt / Stand Konzentrationen.

3. Isolierung von Neuronen

Wenn der Extrakt / Stand Sammlung abgeschlossen ist, weiter mit Isolierung von Nervenzellen.

1. Für DRG-Neuronen, sammeln die Hals zu neugeborener Ratten zwischen postnatalen Tag (P) 12.2 nach Enthauptung und stereomikroskopische Präparation der DRG (Abbildung 1A) lumbalen DRG. Um eine ausreichende DRG-Neuronen für eine 24-Well-Platte haben, sammeln sie alle Gebärmutterhalskrebs zu einer neugeborenen Ratte (entspricht 52 DRG) pro Platte lumbalen DRG.
   1. Schneiden Sie den peripheren (neuronalen) und Zentralprojektionen (Wurzeln) der DRG mittels Mikroschere.
      Lässt man die Projektionen in Verreiben Ort behindert und erhöht ter Kontaminationsrisiko der Kultur von Fibroblasten.
2. Für MP Neuronen, schneiden Sie das Gekröse aus dem Dünndarm und von Hand vorsichtig abstreifen seromuskuläre Schicht des Dünndarms (für eine detaillierte Protokoll über MP Isolation, siehe Schäfer et al. ^9, Abbildung 1B). Für MP, sammeln die Plexus aus zwei Ratten pro 24-Well-Platte.
   Hinweis: Versuchen Sie, so sanft wie möglich zu sein, um Risse in der seromuskuläre Schicht zu vermeiden, da sie die erfolgreiche Trennung von der Dünndarm behindern.
3. Sammeln Sie die DRG und seromuskuläre Schicht in eiskaltem Minimalmedium (MEM) mit Gentamicin (20 mg in 500 ml Medium) und Metronidazol (2,5 mg in 500 ml Medium) geliefert.
4. Nach Sammlung von DRG, inkubieren in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit Collagenase Typ II für 20-30 min zugeführt. Für MP Isolation, Inkubation in Collagenase Typ zwischen 1-3 Stunden, je nach Alterdes Tieres (Abbildung 1C).
5. Für MP, sammeln die netzartige MP Stücke unter Stereomikroskop und Transfer zum eiskalten MEM.
6. Dann verreiben Sie die DRG und MP durch Spritzen mit abnehmendem Durchmesser.
   Hinweis: Überhöhte Verreiben können die Neuronen weniger die Gliazellen zu zerstören, aber.
7. Sobald das Medium, das die DRG oder MP hat sich bewölkt, Zentrifuge die Suspension bei 93,9 g für 5 min, entsorgen Sie die mittel-und resuspendieren in Neurobasal Medium (mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 2% B-27).
8. Zählen der Gesamtzahl der Zellen (dh Neuronen und Gliazellen) mittels einem Hämozytometer.
   Anmerkung: Die Anzahl der benötigten Zellen ist abhängig von der Messgröße. Für die Quantifizierung von Neuriten Dichte, dichter Kulturen und somit eine größere Anzahl von Zellen als für die Messung von Neuritenwachstum, perikaryonal Größe benötigt manund Verzweigungsmuster einzelner Neuronen. Für Neuriten Dichtemessungen, verwenden Sie zB 10.000 Zellen (Neuron + Glia) / gut oder 1500 Neuronen / gut. Für Morphometrie von einzelnen Neuronen, kurz (1 Minute lang) Trypsinierung der Zellen und der Aussaat von 2500 Zellen / Well oder 400 Neuronen / Vertiefung wird empfohlen. Die typische Ausbeute an Zellen aus einer Ratte erhalten etwa 300.000-500.000 Zellen.
9. Samen der Zellen auf 13 mm Deckgläschen, die wurden in der Nacht überzogen haben, bevor die Brunnen und oben mit Neurobasal Medium (mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 2% B-27) (Abbildung 1D).
   Hinweis: Verwenden Poly-D-Lysin (40 mg / m ²⁾ oder Ornithin-und Laminin-beschichtete (1 mg / ml) beschichteten Deckgläschen. Zellen zu befestigen, um Poly-D-Lysin extrem schnell, so dass es für Experimente, in denen viele Zellen benötigt werden (dh Neuriten Dichtemessungen) geeignet. Anbau an Laminin ist in der Regel einigewas schwächer, aber Laminin ist ein starker Förderer der Neuritenwachstum. Daher ist für Messungen an Nervenverzweigungen und Neuritenlänge bevorzugen Ornithin / Laminin-Beschichtung.
10. Damit die Zellen heften sich an die Brunnen über Nacht. Am nächsten Tag, bereiten die Extrakt-ergänzten Medium (zu einer endgültigen Extrakt / Überstand Konzentration von 100 ug / ml).
11. Saugen Sie den Aussaatmedium und führen Sie eine optionale, sehr sanft mit PBS gewaschen, und dann langsam pipettieren den Extrakt / Stand-Medien ergänzt (1E).
12. Lassen Sie die Zellen wachsen für 48 Stunden. Saugen Sie die Medien und fix in 4% Paraformaldehyd für Immunfärbung (1F).
13. Führen Doppelimmunfluoreszenzfärbung mit Neuronen-spezifischen (z. B. beta-Tubulin-III) und Glia-spezifisch (zB Gliazellen fibriallary sauren Protein / GFAP) Marker (1G).
14. Für Morphometrie, verwenden Sie einen invertierten Lichtmikroskop mit einer CCD-Kamera in Kombination wi ausgestattetth automatisierte Software, die die Messung von Neuriten Dichte ermöglicht (siehe Tabelle).
15. Die Neuriten Dichte von neuronalen Kulturen auf 4-5 Vertreter mikroskopische Aufnahmen bei 200-facher Vergrößerung aus 4 verschiedenen Regionen der dichtesten Wachstum auf jedem Deckglas durch Überlagerung ein 50 um x 50 um Netz und Zählen der Faserdichte pro Quadratmeter in den Schnittfasern gemessen. Neuritenwachstum, mittlere Anzahl der Filialen pro Neuron kann die mittlere Zweig Länge und perikaryonal der Größe von 30 zufällig ausgewählten Einzelneuronen von jedem Deckglas durch Markieren der Neuriten und Perikarya (1H) gemessen werden.

Ergebnisse

Morphologische Neuroplastizität

In der angegebenen Altersbereich von neugeborenen Ratten (P2-12) und den Einsaatdichten, MP und DRG-Neuronen bereits dichte neuronale Netze bauen nach 48 h (Abbildung 2A). Vergleich von Neuriten Dichte zwischen Neuronen in PCa, CP kultiviert und NP Extrakte zeigt größere Dichte von Neuriten-DRG-Neuronen in PCa-oder CP-Extrakte als NP-Extrakte (2A) ^5. Wir bevorzugen insbesondere MP Neuronen für Messungen an ...

Diskussion

Das vorliegende Protokoll soll die Methodik hinter der in-vitro-Assay Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität, die kürzlich von unserer Arbeitsgruppe entwickelt wurde, um die Mechanismen der Neuroplastizität bei PCa und CP ⁵ studieren zu veranschaulichen. Das Protokoll beinhaltet einen dreitägigen Prozedur, die leicht angewendet werden können, sobald die Darsteller hat ausreichende Erfahrung bei der Isolierung und Kultur von DRG-und MP-Neuronen gewonnen werden. Darüber hinaus stellt es ein wertvolles Wer...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Poly-D-Lysinhydrobromid	Sigma-Aldrich	P1149
Ornithin/Laminin	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Deckgläser	Merck		Zur Verwendung in 24-Well-Platten
Dismembranator S	Sartorius
Anti-Beta-III-Tubulin-Antikörper	Millipore	MAB1637	1:200
Anti-GFAP-Antikörper	DAKO	M0761	1:400 Konzentration
RIPA Puffer + Proteaseinhibitor			Beliebiger Lieferant
Neurobasales Medium	Gibco/Life Sciences	21103-049
B-27 Supplement	Gibco/Life Sciences	17504044	Qualität von B-27 hängt bekanntlich von der Chargennummer
ab Gentamicin/Metronidazol			Beliebig Lieferant
Minimal Essential Medium	Gibco/Life Sciences	31095-029
Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco/Life Sciences	24020133	Verbessert die Kollagenase-Aktivität bei Gehalt an Ca/Mg-Kollagenase
Typ II	Worthington Biochemical	CLS-2	Erhalten Sie Chargen mit mindestens 200 U/mg Aktivität
Trypsin-EDTA 0,25 %	Gibco/Life Sciences	25200056
4 % Paraformaldehyd			Jeder Lieferant
analySIS docu Software	Olympus

Konzentration