Abstract
Whole-mount imunofluorescência para detectar ativado Caspase 3 (ensaio CASP3) é útil para identificar células em apoptose ou intrínseca ou extrínseca em embriões de peixe-zebra. A análise de todo o monte fornece informação espacial em relação à especificidade do tecido de células apoptosing, embora o corte e / ou colabeling é finalmente obrigado a identificar os tipos de células em apoptose exatas. O ensaio todo-mount CASP3 é otimizado para análise de embriões fixadas entre o estágio de 4 células e 32 horas pós-fecundação e é útil para uma série de aplicações, incluindo a análise de mutantes peixe-zebra e morphants, superexpressão de tipo selvagem e mutante mRNAs, e exposição a substâncias químicas. Comparado com coloração laranja de acridina, que pode identificar células em apoptose em embriões vivos em uma questão de horas, CASP3 e TUNEL ensaios levar muito mais tempo para ser concluído (2-4 dias). No entanto, devido ao carácter dinâmico da formação de células apoptóticas e de apuramento, análise de correcçãoembriões ed assegura comparação precisa de células apoptóticas através de múltiplas amostras em pontos de tempo específicos. Descobrimos também o ensaio CASP3 ser superior à análise de células em apoptose pelo ensaio todo-mount TUNEL em relação ao custo e confiabilidade. Em geral, o ensaio CASP3 representa, um ensaio altamente reprodutível robusto, em que a análise de células em apoptose em embriões de peixe-zebra iniciais.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 ml tubes | Denville Scientific | c2170 | Nonhazardous. Any similar 1.5 m plastic tubes will suffice. |
10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | Nonhazardous. |
a-activated-human-Caspase-3 antibody | Fisher Scientific | BDB559565 | May be harmful if inhaled or swallowed. |
a-GFP monoclonal antibody (mouse) | Life Technologies | 33-2600 | May be harmful if inhaled or swallowed. |
a-HuC/HuD human neuronal protein, mouse IgG2b, monoclonal 16A11 - UNCONJ | Life Technologies | A21271 | May be harmful if inhaled or swallowed. |
Albumin, Bovine BSA Heat Shock Isolation | Amresco | CAS 9048-46-8 | Nonhazardous. Can also be purchased through Bioexpress: 0332-1006 |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | Use at 1:200 dilution. May be harmful if inhaled or swallowed. |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21206 | Use at 1:200 dilution. May be harmful if inhaled or swallowed. |
Alexa Fluor 568 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A10042 | Use at 1:200 dilution. May be harmful if inhaled or swallowed. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418 | Flammable. |
Dumont #5 Inox Forceps (standard tips/straight) | Fine Science Tools | 11251-20 | Sharp! |
FBS HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | SH3091003 | Nonhazardous. |
Fisher Scientific Ocelot Rotator | Fisher Scientific | 05-450-21 | Any rotator with manual speed control is suitable. |
Instant Ocean Aquarium Salt | Petco | 1373684 | Nonhazardous. |
Methanol (acetone-free) | Sigma Aldrich | M1775 | Flammable: toxic by inhalation, ingestion and contact. |
Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0387-1006 | Nonhazardous. |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Flammable: toxic by inhalation, ingestion and contact. |
Probe (Angled 80 Short/15.5cm/0.15mm tip diameter) | Fine Science Tools | 10140-02 | Sharp! |
Pronase | Roche | 11459643001 | Nonhazardous. |
Pyrex Spot Plate | Fisher Scientific | 13-748B | Nonhazardous. |
Transfer Pipets, Samco general purpose | Thermo-Scientific | 204 | Nonhazardous. |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Irritant: harmful by ingestion or contact. |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P7949 | Nonhazardous. Other brands include VWR #97063-872. |
References
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