In-vitro-Assays können verwendet werden, um die Einhaltung der Befestigung von Streptococcus pneumoniae zu untersuchen, um die Zellmonoschichten epithelialen und mögliche Maßnahmen wie der Einsatz von Probiotika zur Hemmung Pneumokokken-Kolonisierung zu untersuchen.
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Methodenartikel
Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Anhaften von Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) an die epitheliale Auskleidung der Nasenrachenraum kann in Kolonisierung führen und wird als eine Voraussetzung für Pneumokokken-Infektionen wie Lungenentzündung und Mittelohrentzündung. In vitro Adhärenz-Assays können verwendet werden, um die Befestigung von Pneumokokken studieren zu Zelle epithelialen werden Monoschichten und mögliche Maßnahmen, wie der Einsatz von Probiotika untersuchen, um Pneumokokken-Kolonisierung zu verhindern. Das hier beschriebene Protokoll verwendet wird, um die Auswirkungen des probiotischen Streptococcus salivarius auf die Einhaltung von Pneumokokken an menschlichen Zelllinie CCL-23 zu untersuchen (manchmal als HEp-2-Zellen). Der Test besteht aus drei Stufen: 1) Vorbereitung der Epithel-und Bakterienzellen, 2) Zugabe von Bakterien epithelialen Zellmonoschichten, und 3) Detektion von anhaftenden Pneumokokken durch Keimzahl (serielle Verdünnung und Beschichtung) oder quantitative Echtzeit-PCR (qPCR ). Diese technique ist relativ einfach und keine Spezialgeräte außer einer Gewebekultur-Setup benötigen. Der Test kann verwendet werden, um andere probiotische Spezies und / oder potentiellen Inhibitoren der Pneumokokken-Kolonisation zu testen und können leicht geändert werden, um andere wissenschaftliche Fragen zur Pneumokokken-Adhärenz und Invasion zu adressieren.
Einleitung
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist ein Gram-positive Bakterien, die Infektionen, einschließlich Lungenentzündung, Mittelohrentzündung und Hirnhautentzündung führen kann. Es ist eine der Hauptursachen der Erkrankung bei Kindern in Ländern mit niedrigem Einkommen und für geschätzte 800.000 Todesfälle von Kindern unter fünf Jahren jährlich 1 verantwortlich. Pneumokokken sind häufig in den Nasenrachenraum von Kindern durchgeführt. Obwohl dieser Kolonisation ist allgemein als asymptomatisch, sie Pneumokokkeninfektion voran und dient als Reservoir für die Bakterien in menschlichen Populationen 2. Pneumokokken-Konjugat-Impfung verring....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Epithelial-und Bakterienzellen
- Auftauen von CCL-23 Epithelzellen
- Vorwärmen Minimum Essential Medium (MEM), enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS) in einem 37 ° C Wasserbad für ~ 30 min.
- Sterilisieren Sie die Gewebekultur-zugelassenen biologischen Sicherheitsschrank mit UV-Licht für mindestens 10 min vor der Verwendung, und wischen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Flasche erwärmt Medien mit 70% Ethanol und in Biosicherheitswerkbank.
- Mit einer 25 ml Pipette 14 ml Medium in eine T-75-Kolben. Zeigen Kolben in 37 ° C-Inkubator, während Zellen Auftauen (Abschnitt 1.1.4). <....
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Ergebnisse
Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, bei dem Pneumokokken (S. pneumoniae PMP843 eine Kolonisierung 19F Isolat) wurden in CCL-23-Zellen 1 h nach der Zugabe von S. hinzugefügt salivarius und Pneumokokken-Adhärenz wurde sowohl Keimzahl und lytA qPCR quantifiziert werden in Tabelle 2 gezeigt. Ergebnisse waren konsistent zwischen den beiden Methoden für sowohl die absolute Anzahl von Bakterien (wie CFU / ml dargestellt) und die Einhaltung%, normiert auf die Anzahl.......
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Diskussion
Ein wichtiger Teil dieses Assays wird um die entsprechende Konzentrationen von S. salivarius und Pneumokokken in den Abschnitten 3.1.7 und 3.1.12. Die Konzentrationen werden mit OD-Werten geschätzt, aber die genaue Inokula sind nicht bestimmt, bis Platten gezählt werden am folgenden Tag. Aus diesem Grund empfehlen wir die Durchführung von Wachstumskurven auf OD und Keimzahl (CFU / ml) über die Zeit für alle Bakterienstämme im Assay verwendet, um den mittleren log-Phase zu identifizieren und helfen bei der Schät.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Murdoch Childrens Research Institute und betriebliche Infrastruktur-Support-Programm der Regierung von Victoria unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Minimum an essentiellen Medien (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | |
| Fötales Kälberserum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | |
| T-75 Flasche | Nunc | 156472 | |
| CCL-23 Zellen | ATCC | CCL-23& | nbsp; |
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | |
| 24-Well-Zellkulturplatte | Nunc | 142475 | |
| Pferdeblut-Agar-Platten (HBA) | Oxoid | PP2001 | Schafblut-Agar-Platten auch akzeptabel |
| Todd-Hewitt Bouillon | Oxoid CM0189 | ||
| Hefe-Extrakt | Beckton Dickinson | 212750 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Einwegküvetten | Kartell | 1938 | |
| Heparin | Pfizer | 2112105 | wird in sterilen Ampullen mit 5.000 I.E./5 m/ |
| Steriler Spreader | Technoplas | S10805050 | alternativ kann ein Glasspreader vor jedem Gebrauch in 96%iges Ethanol getaucht und flammensterilisiert werden |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| SDS 20% Lösung | Ambion | AM9820 | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| QIAamp DNA-Mini-Kit (250) | Qiagen | 51306 | |
| LytA F Primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' Sequenz ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA |
| LytA R Primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' Sequenz TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT |
| LytA-Sonde | Eurogentec | Sonderanfertigung | 5' -> 3' Sequenz Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative Fluorophore können verwendet werden |
| Nukleasefreies Wasser | Ambion | AM9906 | |
| Brilliant III Ultraschneller QPCR-Mastermix | Agilent Technologies | 600880 | |
| Thermo-Fast 96 Detektionsplatte | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | |
| Ultraklare qPCR-Kappenstreifen | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | |
| Mx3005 QPCR-System | Agilent Technologies | 401449 | |
| *Alternative Quellen sind für die meisten/alle aufgeführten |
Referenzen
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colo....
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Nachdrucke und Genehmigungen
