Methodenartikel

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein In-vitro- Einhaltung Assay

DOI:

10.3791/51069

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28. April 2014

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1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In-vitro-Assays können verwendet werden, um die Einhaltung der Befestigung von Streptococcus pneumoniae zu untersuchen, um die Zellmonoschichten epithelialen und mögliche Maßnahmen wie der Einsatz von Probiotika zur Hemmung Pneumokokken-Kolonisierung zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Anhaften von Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) an die epitheliale Auskleidung der Nasenrachenraum kann in Kolonisierung führen und wird als eine Voraussetzung für Pneumokokken-Infektionen wie Lungenentzündung und Mittelohrentzündung. In vitro Adhärenz-Assays können verwendet werden, um die Befestigung von Pneumokokken studieren zu Zelle epithelialen werden Monoschichten und mögliche Maßnahmen, wie der Einsatz von Probiotika untersuchen, um Pneumokokken-Kolonisierung zu verhindern. Das hier beschriebene Protokoll verwendet wird, um die Auswirkungen des probiotischen Streptococcus salivarius auf die Einhaltung von Pneumokokken an menschlichen Zelllinie CCL-23 zu untersuchen (manchmal als HEp-2-Zellen). Der Test besteht aus drei Stufen: 1) Vorbereitung der Epithel-und Bakterienzellen, 2) Zugabe von Bakterien epithelialen Zellmonoschichten, und 3) Detektion von anhaftenden Pneumokokken durch Keimzahl (serielle Verdünnung und Beschichtung) oder quantitative Echtzeit-PCR (qPCR ). Diese technique ist relativ einfach und keine Spezialgeräte außer einer Gewebekultur-Setup benötigen. Der Test kann verwendet werden, um andere probiotische Spezies und / oder potentiellen Inhibitoren der Pneumokokken-Kolonisation zu testen und können leicht geändert werden, um andere wissenschaftliche Fragen zur Pneumokokken-Adhärenz und Invasion zu adressieren.

Einleitung

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Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist ein Gram-positive Bakterien, die Infektionen, einschließlich Lungenentzündung, Mittelohrentzündung und Hirnhautentzündung führen kann. Es ist eine der Hauptursachen der Erkrankung bei Kindern in Ländern mit niedrigem Einkommen und für geschätzte 800.000 Todesfälle von Kindern unter fünf Jahren jährlich 1 verantwortlich. Pneumokokken sind häufig in den Nasenrachenraum von Kindern durchgeführt. Obwohl dieser Kolonisation ist allgemein als asymptomatisch, sie Pneumokokkeninfektion voran und dient als Reservoir für die Bakterien in menschlichen Populationen 2. Pneumokokken-Konjugat-Impfung verringert effektiv die Beförderung der im Impfstoff enthaltenen Serotypen. Allerdings gibt es über 90 Pneumokokken-Serotypen, und die Impfung kann Serotyp Ersatz, wobei die Beseitigung der Impfstoff-Serotypen wird von einem Anstieg der Wagen und Krankheit, die durch nonvaccine Serotypen 3 verursacht, gefolgt führen. Auch in einigen Hochrisikogruppen, PneumokokkenKolonisierung tritt oft sehr früh im Leben, vor der Verabreichung der ersten Impfstoffdosis 4,5. Kürzlich wurde die Verwendung von Probiotika als zusätzliche Strategie, um Pneumokokken-Kolonisierung 6,7 hemmen, vorgeschlagen. In vitro Adhärenz-Assays wurden verwendet, um Pneumokokken Einhaltung 8,9 untersuchen. Diese Tests wurden angepasst, um die Auswirkungen des probiotischen Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) auf die Einhaltung Pneumokokken 10 zu untersuchen.

Zusätzlich zu LGG und anderen Milchsäurebakterien, Streptococcus salivarius, eine gemeinsame Bewohner der Mundhöhle, wurde als potenzielle Probiotikum für die Atemwege aufgrund seiner Besiedelung Potential und die Fähigkeit, Pneumokokken und anderen respiratorischen Pathogenen in vitro hemmen, untersucht 11 - 13. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt ein Festhalten Assay verwendet, um die Effekte von S. untersuchen salivarius K12 auf Pneumokokken-Einhaltungauf den menschlichen Zelllinie CCL-23. Vor der Verwendung im Test wurden die Pneumokokken-Isolate für die Einhaltung Fähigkeiten ausgewertet, da Wachstum und Hafteigenschaften kann im Wesentlichen zwischen den Isolaten 10,14 variieren. Wachstumskurven von Pneumokokken und S. salivarius geführt wurden bis zur mittleren log-Phase und Schätzung Konzentration (koloniebildende Einheiten oder CFU / ml) durch die optische Dichte zu bestimmen (OD, Fig. 1). Es wird empfohlen, das Wachstum von Keimzahl und OD untersuchen für jedes Isolat vor der Verwendung im Test. Dieser Test kann in jedem Labor mit Standardgewebekultureinrichtungen und Anlagen durchgeführt werden. In diesem Protokoll werden die Wirkungen von drei Dosen von S. salivarius, verabreicht 1 Stunde vor der Zugabe von Pneumokokken auf die Einhaltung von S. pneumoniae PMP843 ein Serotyp 19F Wagen Isolat aus einem Nasen-Rachen-Abstrich gewonnen werden, untersucht. Zwei verschiedene Wege, um anhaftende Pneumokokken quantifizieren vorgestellt: Plattierung auf Blut-Agar zur AbschreckungMine Keimzahl und DNA-Extraktion und Nachweis von Pneumokokken lytA Gens durch qPCR 15. Die Grund Einhaltung Assayprotokoll können leicht modifiziert werden, um verschiedene Dosen oder Zeit der Verabreichung von Probiotika testen und kann auch mit anderen bakteriellen Stämmen oder Spezies verwendet werden.

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Epithelial-und Bakterienzellen

  1. Auftauen von CCL-23 Epithelzellen
    1. Vorwärmen Minimum Essential Medium (MEM), enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS) in einem 37 ° C Wasserbad für ~ 30 min.
    2. Sterilisieren Sie die Gewebekultur-zugelassenen biologischen Sicherheitsschrank mit UV-Licht für mindestens 10 min vor der Verwendung, und wischen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Flasche erwärmt Medien mit 70% Ethanol und in Biosicherheitswerkbank.
    3. Mit einer 25 ml Pipette 14 ml Medium in eine T-75-Kolben. Zeigen Kolben in 37 ° C-Inkubator, während Zellen Auftauen (Abschnitt 1.1.4).
    4. Entfernen Sie ein Fläschchen mit CCL-23-Zellen, die aus Lagerung in flüssigem Stickstoff mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen und warm in einem 37 ° C Wasserbad, bis ~ 80% aufgetaut.
    5. Bringen Sie den Kolben in Abschnitt 1.1.3 auf die Biosicherheitswerkbank vorbereitet. Wischaußenfläche Fläschchen CCL-23-Zellen mit 70% Ethanol und Transferinhalte (1 ml) in die T-75 Kolben mit einem P1000 Pipette.
    6. Der Kolben auf der Seite in einem 37 ° C, 5% CO 2, 95% relative Luftfeuchtigkeit Gewebekultur-Inkubator über Nacht (16-20 Stunden) inkubiert.
    7. Überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um eine gesunde Morphologie bestätigen, entfernen Medien, und ersetzen mit 15 ml frisches, vorgewärmtes MEM + 10% FBS.
  2. Wartung von CCL-23 Epithelzellen
    1. Sobald Zellen sind ~ 80% Konfluenz (1-2 Tage), Passage durch Entfernen von Medien unter Verwendung einer 25 ml Pipette und sanft die Zellen werden zweimal mit je 8-10 ml vorgewärmter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter Verwendung einer 10 ml Pipette.
    2. Entfernen PBS und 1 ml steriler 0,25% Trypsin-EDTA (0,25% (w / v) Trypsin, 0,1 mM EDTA). Drehen Kolben liegend, zu drehen, um sicherzustellen, Trypsin behandelt die konfluente Zellschicht und der Kolben für 2-3 min Inkubation in 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
    3. Zurück Kolben an die Biosicherheitswerkbank, fügen 9 ml vorgewärmten MEM + 10% FBS und Pipette auf und ab 6 -8x, um die Zellen zu resuspendieren, Ausstoßen von Flüssigkeit an der Seite des Kolbens, um Zellen zu entfernen.
    4. Split Zellen 1.15 (1 ml + 14 ml MEM + 10% FBS) oder 01.30 Uhr (0,5 ml + 14,5 ml MEM + 10% FBS), entsorgen Sie überschüssigen Zellen, und kehren Kolben an die 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
    5. Passage die Zellen mindestens zweimal vor dem Einsatz im Assay Einhaltung. Typischerweise Zellen alle 3-4 Tage aufgeteilt.
  3. Seeding von CCL-23 Epithelzellen (ein Tag vor dem Test, Protokoll Nr. 2 Einhaltung)
    1. Aufgeteilt konfluenten Zellen wie in den Abschnitten 1.2.1-1.2.3 beschrieben, Resuspendieren in vorgewärmtem MEM + 5% FBS (FBS-Konzentration gesenkt wird, um die Wahrscheinlichkeit von Serumkomponenten stören im Assay zu verringern). Entfernen Sie 20 ul Zellen und zählen mit Trypanblau-Färbung und einer Zählkammer.
    2. Verdünnte Zellen in vorgewärmtes MEM + 5% FBS in einer Konzentration von 1,5 x 10 5 Zellen / ml in ein steriles 50 ml-Röhrchen.
    3. Samen 1 ml Zellen / Vertiefung in einer GewebeKultur-behandelten 24-Well-Platte.
  4. Vorbereitung von Bakterien
    Dieses Verfahren kann zur Herstellung von Pneumokokken und S. folgen salivarius. Bakterielle Wachstumsmedien wird in der Regel in einem 37 ° C-Inkubator über Nacht auf vorgewärmte und Test auf Sterilität gehalten (in der Regel trübe erscheinen, wenn verschmutzt).
    1. Zwei Tage vor dem Test, streifen Bakterien auf Pferdeblut-Agar (HBA)-Platten Einhaltung und Inkubation bei 35-37 ° C und 5% CO 2 für 18-24 Std. Schafblut-Agar können als Alternative verwendet werden.
    2. Am folgenden Tag bereiten ein Nacht-Kultur für jeden Bakterienarten durch Pipettieren von 10 ml Todd-Hewitt-Bouillon mit 0,5% Hefeextrakt (THB + YE) Medium in ein steriles 30-ml-Tube. Mit einem 10 ul-Schleife, impfen ca. 10-12 gut getrennt Kolonien. Vortexen und Inkubation bei 35-37 ° C und 5% CO 2 für 14-16 Stunden. Beachten Sie, dass Pneumokokken wird autolysieren, wenn man zu lange in der Brühe Kultur.

2 Die Einhaltung Assay:. Zugabe von Bakterien zu epithelialen Zellmonoschichten

  1. Vorbereitung der Mitte-log Bakterienkulturen von Pneumokokken und S. salivarius
    1. Je 10 ml vorgewärmten THB + YE in jeweils zwei sterile 30-ml-Röhrchen, eine markierte Pneumokokken und anderen S. salivarius.
    2. Um mid-log-Phase erreichen, Pneumokokken erfordern ~ 3 Stunden und S. salivarius erfordern ~ 2 h Inkubation (siehe Abbildung 1). Starten Sie beide Kulturen in der gleichen Zeit. Vortex (3-5 sec) über Nacht Bakterienkulturen und 100 ul und 100 ul Pneumokokken S. salivarius in entsprechende Röhrchen.
    3. Vortexen und Inkubation der Kulturen bei 37 ° C für ca. 2 Stunden für S. salivarius und 3 h für Pneumokokken.
  2. Vorbereitung der CCL-23-Zellen, die für die Einhaltung Assay
    1. Mit einem inversen Mikroskop, überprüfen Sie die 24-Well-Platte für confluent-Monoschichten mit gesunden Zellmorphologie. Monoschichten sollte> 80% konfluent sein, ohne Anzeichen von Zellklumpen bzw. zytopathischen Effekte wie Zellabrundung oder ein Verlust an Haftung (siehe Abbildung 2).
    2. Entfernen Sie die Medien in jede Vertiefung mit einer Transferpipette, Kippen der Platte leicht zu vermeiden, die Zellschicht zu stören.
    3. Um die Zellen vorsichtig waschen, fügen ~ 500 ul vorgewärmtes PBS in jede Vertiefung mit einer serologischen Pipette und entfernen Sie sie mit einer Transferpipette, Kippen der Platte leicht. Entsorgen Sie die PBS. Wiederholen Waschschritt einmal.
    4. Add 500 ul der vorgewärmten MEM + 5% FBS in jede Vertiefung. Geben die 24-Well-Platte zu der CO 2-Inkubator während der Herstellung der Bakterienkulturen.
      Hinweis: Um Multiplizität der Infektion (MOI) bestimmen die genaue CCL-23-Zellzahl, zwei Vertiefungen mit Trypsin behandelt und am Tag der Infektion gezählt.

3. Adherence Assay

  1. In Pneumokokken zudie CCL-23-Zellen bei einer MOI ~ 10:1. Testen Sie die in Tabelle 1 in zwei Vertiefungen aufgeführten Bedingungen.
    1. Messung der optischen Dichte bei A 600 (OD) von 1 ml von S. salivarius Kultur. OD sollte zwischen 0,3-0,6 sein.
    2. Übertragen 5 ml S. salivarius Kultur in einen 10-ml-Röhrchen und Zentrifugieren bei 1.870 × g für 4 min.
    3. Überstand verwerfen und auf der Grundlage der OD-Wert in Abschnitt 3.1.1, S. resuspendieren salivarius in 200-1.000 &mgr; l 0,85% NaCl (Endkonzentration ~ 1,5 × 10 9 CFU / ml). Als allgemeine Richtlinie wird eine OD von 0,375 in 260 ul resuspendiert werden. Bereiten 1:10 und 1:100 Verdünnungen von S. salivarius mit 0,85% NaCl.
      Hinweis: Insgesamt drei Konzentrationen (die hohe, mittlere und niedrige Dosen) von S. salivarius in dem Assay getestet werden. Die hohe Dosis ein Verhältnis von ~ 10 S. salivarius: 1 Pneumokokken, das Medium ca. 1 S. salivarius: 1 Pneumokokken, und die niedrig ist ~ 1 S. salivarius: 10 Pneumokokken.
    4. Nehmen Sie die 24-Well-Platte aus dem Inkubator.
    5. Von den Heparin Kontrollvertiefungen, entfernen 40 ul Medium und 50 ul von Heparin (1.000 U / ml Stammkonzentration) für eine endgültige Konzentration von 100 U / ml.
    6. In 10 ul von 0,85% NaCl auf Vertiefungen, die CCL-23-Zellen, die nur und Vertiefungen, die CCL-23-Zellen und Pneumokokken (keine S. salivarius).
    7. In 10 ul unverdünnt, 1:10 und 1:100 von S. salivarius in die jeweiligen Vertiefungen.
      Hinweis: S. salivarius kann auch gleichzeitig als Pneumokokken (Koaddition) oder 1 h zugegeben werden, nachdem Pneumokokken (nachträgliche Zugabe), um die Wirkung der Zeit des probiotischen Verabreichung zu untersuchen.
    8. Zentrifugieren der 24-Well-Platte bei 114 × g für 3 min auf Bakterienkontakt mit der Zellschicht zu fördern und Inkubation für 1 h bei 37 ° C, 5% CO 2.
    9. Führen serielle Verdünnung des S. salivarius Lager in 0,85% NaCl und Platte auf doppelte HBAPlatten für die Keimzahl. Fügen Sie zuerst 50 ul Lager auf 450 ul von 0,85% NaCl, eine 10 -1 Verdünnung zu machen, dann Impulswirbel (5 sec), ändern Tipps, und 50 ul der 10 -1 Verdünnung auf 450 ul von 0,85% NaCl um eine 10 -2 Verdünnung zu machen und so weiter bis zu 10 -7.
    10. Platte 100 ul der 10 -5, 10 -6 und 10 -7 Verdünnungen in zweifacher Ausfertigung auf HBA-Platten und verbreiten mit einer sterilen Treuer. Inkubieren HBA Platten über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 invertiert.
    11. Gegen Ende der 1-stündigen Inkubation wiederholen Abschnitte 3.1.1-3.1.3 für Pneumokokken. OD sollte zwischen 0,2-0,7 sein. Zentrifugieren Sie 1 ml Pneumokokken Kultur und das Pellet in 300-2.000 &mgr; l 0,85% NaCl (bezogen auf das OD-Wert) auf eine Konzentration von ca. 1,5 x 10 8 CFU / ml. Als allgemeine Richtlinie wird eine OD von 0,3 in 500 ul resuspendiert werden.
    12. Nach 1 Stunde Inkubation mit S. salivarius, mit 10 μ, (Nur die Zellen enthalten) l unverdünnt Pneumokokken in alle Wells außer Negativkontrollen.
    13. Zentrifugieren der 24-Well-Platte bei 114 × g für 3 min und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 3 Stunden. Führen serielle Verdünnung der Pneumokokken Lager in 0,85% NaCl, wie in Abschnitt 3.1.9 und Platten Verdünnungen 10 -4, 10 -5, -6 und 10 auf doppelte HBA Platten für Keimzahl beschrieben.
  2. Nach 3 Stunden, überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass Monoschichten gesund (siehe Abbildung 2) zu suchen. Entfernen Sie die Medien aus jeder Vertiefung und vorsichtig waschen die Zellen 3x, wie in Abschnitt 2.2.3 beschrieben. mit einer anderen Pipette für jede Bedingung. Dieser Schritt ist wichtig, um nicht anhaftende Pneumokokken entfernen. Die Monoschichten sollten während des Waschprozesses nicht zerfällt; Dies kann durch erneutes Prüfen unter einem Mikroskop bestätigt werden.

Hinweis: Medien während dieses Schrittes entfernt werden bei -20 ° C für weitere Analysen aufbewahrt werden ( zB Messung der Zytokin-Ebenen).

  1. Geben Sie 200 ul 0,1% Digitonin (eine sanfte Reinigungsmittel) in jede Vertiefung und Inkubation für 7 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
  2. In 800 ul von THB Medien in jede Vertiefung. Lyse Zellen durch Pipettieren von oben und unten, und, wenn nötig, kratzen Wells 3-4x mit der Pipettenspitze um sicherzustellen, dass die Zellschicht vollständig entfernt wird. Ändern Sie Tipps, zwischen Brunnen.
  3. Entfernen Sie die Inhalte aus jede Vertiefung mit einer Pipette P1000 und übertragen in markierte Mikrozentrifugenröhrchen.

4. Quantifizierung von adhärenten Pneumokokken

Adherent Pneumokokken kann durch die Bestimmung Keimzahl (serielle Verdünnung und Plattierung auf Blut-Agar) oder durch quantitative Echtzeit-PCR quantifiziert werden.

  1. Lebendkeimzahl-Methode
    Diese Methode muss unmittelbar nach Schritt 3.5 der Einhaltung Test durchgeführt werden.
    1. Für jeden Test gut vorbereiten serielle Verdünnungen der Proben gesammeltSchritt 3.5 der Adhärenz-Assay durch Zugabe von 50 &mgr; l-Proben zu 450 ul 0,85% NaCl, Impuls Vortexen und seriell verdünnt, wie in Abschnitt 3.1.9 bis 10 -6-Verdünnung beschrieben.
    2. Platte 100 ul der 10 -3, 10 -4, 10 -5, und 10 -6 Verdünnungen in zweifacher Ausfertigung auf Blut-Agar, verbreiten mit einer sterilen Spreizer, und Inkubation umgekehrten Platten über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. Beachten Sie, dass die Vertiefungen, die CCL-23-Zellen allein sollten keine Bakterien enthalten und kann plattiert werden ordentlich (100 ul unverwässert) als Sterilitätskontrolle.
    3. Der folgende Tag, bestimmen die Pneumokokken-Inokula durch Zählen der Kolonien auf den entsprechenden Verdünnungsplatten (mit 30 bis 300 Kolonien) in Abschnitt 3.1.13 der Einhaltung Assay vorbereitet. Berechnen der CFU / ml des Inokulums mit dem Mittelwert von zwei Platten. Ebenso bestimmen die S. salivarius Inokula durch Auszählen der Kolonien auf den Platten vorbereitetin Abschnitt 3.1.10.
      Hinweis: Die Platten sollten nur Pneumokokken enthalten; das Vorhandensein von anderen Arten gibt an, dass der Test kontaminiert und die Ergebnisse ungültig sind.
    4. Um die Einhaltung Pneumokokken-Ebenen bestimmen, zählen die entsprechenden Verdünnungsplatte (mit 30-300 Pneumokokken-Kolonien) für jede Probe in Abschnitt 4.1.1 vorbereitet. Beachten Sie, dass S. salivarius Kolonien klein und weiß sein, während Pneumokokken wird flach und grünlich durch α-Hämolyse, wie in Abbildung 3 dargestellt. Zur Berechnung Pneumokokken-Adhärenz, normalisieren die Anzahl der adhärenten Pneumokokken aus Bedingung b. CCL-23-Zellen + Pneumokokken bis 100%, und vergleichen haft Pneumokokken von anderen Bedingungen für diese Bedingung.
  2. qPCR-Methode
    Proben, die in Einhaltung Assay gesammelt Schritt 3.5 kann bei -20 ° C bis zur DNA-Extraktion gelagert werden. DNA-Extraktion unter Verwendung eines kommerziellen Kits durchgeführt und in den Abschnitten 4.2.1-4.2.9 und der qPCR alssagen, in den Abschnitten 4.2.10-4.2.20.
    1. Das enzymatische Lyse-Puffer (50 mM Phosphatpuffer pH 6,7, enthaltend 1 mg / ml Lysozym, 0,075 mg / ml Mutanolysin und 2 mg / ml Proteinase K). Das folgende Rezept kann verwendet werden, machen 10 ml (ausreichend für 50 Extraktionen). Die enzymatische Lyse-Puffer sollte frisch zubereitet vor Gebrauch.

      7,25 ml 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,7)
      1,00 ml 10 mg / ml Lysozym Lager für eine endgültige [1 mg / ml]
      0,75 ml 1 mg / ml Lager für eine endgültige [0,075 mg / ml] Mutanolysin
      1,00 ml 20 mg / ml Proteinase K Lager für eine endgültige [2 mg / ml]
    2. Tauen Sie die Proben auf Eis oder bei 4 ° C Wirbel-und Transfer 100 ul Aliquots jeder Probe in markierte Mikrozentrifugenröhrchen. Zurück Originalmuster zurück in die -20 ° C Gefrierschrank.
    3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 6700 g für 10 min.
    4. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. In 200 ul der enzymatischen Lyse-Puffer zum Pellet-und Wirbel zu resuspendieren. Incubaß die Proben bei 56 ° C für 30 min. Kurz zentrifugieren (5 sec) bei 6.700 xg Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln.
    5. Werden 10 ul 20% SDS, die Zell-Lyse zu vervollständigen und vorsichtig bei Raumtemperatur für 2 min.
    6. In 4 ul RNase A (100 mg / ml Stamm) und vorsichtig mischen (auf einer Wippe oder durch Umdrehen der Röhrchen) bei Raumtemperatur für 2 min.
    7. Geben Sie 200 ul Puffer AL (aus dem Kit) und Vortex für 15 Sekunden. Proben inkubieren bei 70 ° C für 10 min. Kurz zentrifugieren (5 sec) bei 6.700 xg Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln.
    8. In 200 ul von 100% EtOH und Vortex für 15 Sekunden. Spin kurz, um die Flüssigkeit auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln, übertragen Sie dann die Mischung (einschließlich Niederschlag) an die Spin-Säule (in einem 2-ml-Tube) ohne Benetzung der Felge. Folgen Waschschritte nach der Protokoll des Herstellers (hier nicht gezeigt).
    9. Zum Eluieren der DNA übertragen Säule in einem markierten Mikrozentrifugenröhrchen, 50 &mgr; l Puffer AE (from Kit), und bei Raumtemperatur für 2 min. Zentrifuge bei 4300 g für 1 min. Einmal wiederholt für eine endgültige Elutionsvolumen von 100 ul. DNA bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
    10. Um qPCR durchzuführen, sterilisieren die Hauben mit UV-Licht für 15 Minuten vor dem Start. Vorbereiten einer 96-Well-Platte Karte Arbeitsblatt, um auch Standorte für jede Probe aufzeichnen wird empfohlen.
    11. Bereiten Standardkurve mit einer 10 ng / ul Lager von genomischer DNA Pneumokokken (von Referenzstamm ATCC 6305 entnommen).
      1. Auftauen Pneumokokken-Lager DNA und kurz abzentrifugieren (5 sec) in einer Tischzentrifuge.
      2. Führen 01.10 serielle Verdünnungen in 6 vormarkiert Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 3 ul DNA auf 27 ul Nuklease-freiem H 2 O, Tipps und Wechsel zwischen den einzelnen Wirbeln Verdünnung. Die endgültige Verdünnungsreihe besteht aus 6 Röhren: 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 und 0,00001 ng / ul.
        Anmerkung: Dies kann bei 4 ° C für bis zu einer Woche gelagert werden.
    12. PreparE lytA Mastermix wie in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen in einem sterilen PCR Haube folgt. Komponenten auf Eis auftauen und Wirbel unmittelbar vor der Verwendung.
      Komponente pro Reaktion x 102 (Vollplatte)
      lytA F 0,25 ul 10 uM Lager 25,5 ul
      lytA R 0,25 ul 10 uM Lager 25,5 ul
      lytA Sonde 0,5 ul 10 uM Lager 51 ul
      H 2 O 9,5 ul 969 ul
      Master-Mix 12,5 ul 1275 ul
      Das endgültige Volumen 23 ul 2346 ul
      Hinweis: Einige Echtzeit-PCR-Maschinen erfordern die Verwendung einer Referenzfarbstoff, der in einigen kommerziellen Mastermix enthalten ist oder separat hinzugefügt werden. Dieses Protokoll wird für die Ausführung von 25 &mgr; l Reaktionen in einer 96-Well-Platte entwickelt, kann aber eingestellt werden, um verschiedene Echtzeit-PCR-Maschinen aufzunehmen. Die Primer-und Sondensequenzen wurden ursprünglich von Carvalho et al. Veröffentlicht und 15 sind in der Liste der Materialien gezeigt.
    13. Vortex und Last 23 ul / der lytA mischen in die Vertiefungen. Siehe Karte Platte.
    14. Transport Platte zusätzlich Bereich (vorzugsweise eine sterile Schrank in einem separaten Raum) für die Probenlade Vorlage.
    15. Verwenden Sie eine P2-Pipette, um Proben zu laden, ändern Tipps für jeden gut. Alle Proben werden doppelt durchgeführt. Siehe Karte Platte für die Lage.
    16. Für Standardkurve Brunnen, fügen Sie 1 ul / Vertiefung Die geeignete Verdünnung des Standardkurve DNA plus 1 ul / H 2 O, um das endgültige Volumen auf 25 ul zu bringen.Für Nicht-Template-Kontrollvertiefungen, fügen Sie 2 ul H 2 O.
    17. Add 2 ul / Vertiefung DNA-Probe in die entsprechenden Wells.
    18. Verschließen Sie alle Brunnen im Einsatz. Stellen Sie sicher, Kappen sind eng geschlossen. Drehen Sie schnell die PCR-Platte (5 sec) vor dem Einlegen der Platte in einer Echtzeit-PCR-Maschine.
    19. Lastplatte in PCR-Maschine und Lauf qPCR nach den Anweisungen des Maschinenherstellers. Die folgenden Hydrolyse Sonde Zyklusbedingungen werden empfohlen:
      Schritt 1 (1x): 3 min bei 95 ° C
      Schritt 2 (40x): 20 sec bei 95 ° C
      20 sec bei 60 ° C
    20. Daten sammeln und zu quantifizieren Pneumokokken-DNA anhand der Standardkurve. Bakterielle Belastungen berechnet werden, wie zuvor beschrieben 17, Schätzen, dass 1 &mgr; g genomische DNA ist äquivalent zu 447,4 Zellen und als KBE / ml (unter der Annahme, one Genom pro CFU, und eine Kopie des lytA pro Genom; siehe Abbildung 4). Für einen erfolgreichen Test sollte der R 2-Wert ≥ 0,98 und alle positive Ergebnisse im Bereich der Standardkurve (CT-Werte von weniger als für die 0,00001 ng erhalten / ul Standardkurve Punkt werden als Hintergrund / lytA negativ).
      Hinweis: Einige Echtzeit-PCR-Systeme kommen mit Analyse-Software, die verwendet werden können, um Standardkurven konstruieren und berechnen Unbekannten. Andernfalls können diese Berechnungen in Excel oder ähnlichen Programmen durchgeführt werden. Ein Beispiel für Standardkurve ist in Fig. 4 gezeigt.
    21. Um die Einhaltung Pneumokokken zu berechnen, normalisieren die Anzahl der adhärenten Pneumokokken aus Bedingung b. CCL-23-Zellen + Pneumokokken bis 100%, und vergleichen haft Pneumokokken von anderen Bedingungen für diese Bedingung.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, bei dem Pneumokokken (S. pneumoniae PMP843 eine Kolonisierung 19F Isolat) wurden in CCL-23-Zellen 1 h nach der Zugabe von S. hinzugefügt salivarius und Pneumokokken-Adhärenz wurde sowohl Keimzahl und lytA qPCR quantifiziert werden in Tabelle 2 gezeigt. Ergebnisse waren konsistent zwischen den beiden Methoden für sowohl die absolute Anzahl von Bakterien (wie CFU / ml dargestellt) und die Einhaltung%, normiert auf die Anzahl...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein wichtiger Teil dieses Assays wird um die entsprechende Konzentrationen von S. salivarius und Pneumokokken in den Abschnitten 3.1.7 und 3.1.12. Die Konzentrationen werden mit OD-Werten geschätzt, aber die genaue Inokula sind nicht bestimmt, bis Platten gezählt werden am folgenden Tag. Aus diesem Grund empfehlen wir die Durchführung von Wachstumskurven auf OD und Keimzahl (CFU / ml) über die Zeit für alle Bakterienstämme im Assay verwendet, um den mittleren log-Phase zu identifizieren und helfen bei der Schät...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Murdoch Childrens Research Institute und betriebliche Infrastruktur-Support-Programm der Regierung von Victoria unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Minimum an essentiellen Medien (MEM)Thermo Fisher ScientificSH30244.01 
Fötales Kälberserum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30084.03 
T-75 FlascheNunc156472 
CCL-23 ZellenATCCCCL-23 
TrypsinLife Technologies15090046 
24-Well-ZellkulturplatteNunc142475 
Pferdeblut-Agar-Platten (HBA)OxoidPP2001Schafblut-Agar-Platten auch akzeptabel
Todd-Hewitt BouillonOxoid CM0189 
Hefe-ExtraktBeckton Dickinson212750 
DigitoninSigma-AldrichD141-100MG 
EinwegküvettenKartell1938 
HeparinPfizer2112105wird in sterilen Ampullen mit 5.000 I.E./5 m/ 
Steriler SpreaderTechnoplasS10805050alternativ kann ein Glasspreader vor jedem Gebrauch in 96%iges Ethanol getaucht und flammensterilisiert werden
LysozymeSigma-AldrichL6876 
MutanolysinSigma-AldrichM9901 
Proteinase KQiagen19133 
SDS 20% LösungAmbionAM9820 
RNase AQiagen19101 
QIAamp DNA-Mini-Kit (250)Qiagen51306 
LytA F PrimerSigma-AldrichCustom made5' -> 3' Sequenz ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R PrimerSigma-AldrichCustom made5' -> 3' Sequenz  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA-SondeEurogentecSonderanfertigung5' -> 3' Sequenz Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative Fluorophore können verwendet werden
Nukleasefreies WasserAmbionAM9906 
Brilliant III Ultraschneller QPCR-MastermixAgilent Technologies600880 
Thermo-Fast 96 Detektionsplatte Thermo Fisher ScientificAB-1100 
Ultraklare qPCR-KappenstreifenThermo Fisher ScientificAB-0866 
Mx3005 QPCR-SystemAgilent Technologies401449 
*Alternative Quellen sind für die meisten/alle aufgeführten 
Produkte verfügbar

Referenzen

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