Neuronale Morphogenese und Migration sind entscheidende Ereignisse zugrunde liegenden richtige Entwicklung des Gehirns. Hier beschreiben wir Verfahren zur genetischen Manipulation kultivierten zerebellären Körnerzellen und die Entwicklung von Kleinhirn für die Beurteilung der Morphologie und der Migrationseigenschaften von Neuronen.
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Methodenartikel
Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Entwicklungs Ereignisse im Gehirn einschließlich der neuronalen Morphogenese und Migration sind hoch orchestriert Prozesse. In-vitro-und in vivo-Analysen erlauben eine detaillierte Charakterisierung von Wegen an diesen Veranstaltungen beteiligt sind. Kleinhirnkörnerzellen (CGN), die von sich entwickelnden Kleinhirn abgeleitet werden, sind ein ideales Modell-System, das für die morphologische Analysen ermöglicht. Hier beschreiben wir eine Methode, wie man genetisch zu manipulieren, CGN und wie axono-und dendritogenesis von einzelnen Nervenzellen zu studieren. Mit diesem Verfahren werden die Auswirkungen der RNA-Interferenz, Überexpression oder kleinen Molekülen verglichen werden, um Nervenzellen zu steuern. Darüber hinaus ist das Nagetier Kleinhirnrinde ein leicht in vivo-System zugänglich aufgrund ihrer vorherrschenden postnatale Entwicklung. Wir präsentieren auch eine in vivo Elektroporation Technik genetisch zu manipulieren und die Entwicklung von Kleinhirn Kleinhirn beschreiben nachfolgenden Analysen eine neuronale Morphologie beurteilennd Migration.
Einleitung
Das Kleinhirn ist ein ausgezeichnetes System, die Mechanismen der Axon Wachstum und Migration zu untersuchen. Das Kleinhirn hat sich seit den Anfängen der Neurowissenschaften ein Gegenstand von anatomischen Studien. Moderne Mikroskopie und immunhistochemischen Techniken erheblich erweitert und verfeinert die ersten Entdeckungen von Santiago, Ramon und Cajal 2-4. Maus-Genetik und molekulare Untersuchungen aufgedeckt wesentliche Wachstums-und Transkriptionsfaktoren bei der Kontrolle der Entwicklung des Kleinhirns, die zu einem besseren Verständnis der entscheidenden Ereignisse der richtigen Verkabelung von verschiedenen Arten von Neuronen, einschl....
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Protokoll
CGN kann entweder von postnatalen Tag (P) 5 Welpen Maus oder Ratte P6 Welpen vorbereitet werden. Wir folgen ein Protokoll, durch Bilimoria und Kollegen beschrieben, die eine Mitoseinhibitor nutzt, um für postmitotische, CGN 13 auswählen.
Ethik-Erklärung:
Alle Experimente mit lebenden Tieren wurden nach dem von der "Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit" des Landes Niedersachsen, Deutschland zugelassenen Tier Protokoll durchgeführt.
In-vitro-Assay:
1. Herstellung von DNA Plasmid, Medien und Puffer für den Calciumphosphat-Transfektion Methode
- ....
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Ergebnisse
Um die Morphologie der CGN in Reaktion auf unterschiedliche Kultivierungsbedingungen zu analysieren, transfizierten wir die Neuronen auf DIV 0 wie oben beschrieben. Nach der Transfektion war, legten wir einen Satz von Neuronen in Vollmedium (BME, 10% Kälberserum, 2 mM PSG, 25 mM KCl) und ein anderer Satz in Minimalmedium mit Insulin (BME, 25 mM Glucose, 2 mM PSG, 10 ug / ml Insulin). Wir Immuncytochemie unter die Neuronen mit dem GFP-Antikörper bei DIV 1, 2 und 3, gefolgt von der Messung Axonen und Dendriten und Axone S.......
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Diskussion
Vorteile und Grenzen der in vitro-und in vivo-Methoden beschrieben:
Kultivierte, CGN von Maus und Ratte sind gleich gut für die morphologische Analysen geeignet. Aufgrund der größeren Größe eines Rattenkleinhirn, die Ausbeute von CNG aus Rattenjungen übersteigt die Maus Welpen 3-4x. Abgesehen von CGN kann kortikalen und hippocampalen Neuronen als Kultursystem verwendet, sowie werden. Das Calciumphosphat-Verfahren führt zu einer niedrigen (0,01-5%) Transfektionseffizienz, die erwünsc.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Wir danken N. Schwedhelm-Domeyer für hervorragende technische Unterstützung, C. und S. Hammer Papiol für die Hilfe bei statistischen Analysen. Unsere Arbeit wird von der Max-Planck-Gesellschaft, der Deutschen Forschungsgemeinschaft, dem Center for Nanoscale Mikroskopie und Molekularphysiologie des Gehirns (CNMPB), Göttingen, Deutschland und der Junior-Gruppe GGNB Stipendium von der Universität Göttingen finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithin | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluran | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| ECM 830 und Pinzetten | Harvard Apparatur | ||
| Epifluoreszenzmikroskop und Kamera | Nikon | ||
| SP2 Konfokalmikroskop | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Ladetipp 1-200 µ l | Costar | 4853 | |
| Pipettenspitze 200 & Mikro; l | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Mikrolanze 3 Nadeln, 30 G | BD | 302200 | |
| 50 & Mikrolanze l gasdichte Spritze 1705 | Hamilton | ||
| Glass Deckgläser | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
Referenzen
- Cajal, S. R. Histology of the nervous system of man and vertebrates. , Oxford University Press. (1995).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R.,....
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Nachdrucke und Genehmigungen
