Summary
Le hawaiensis amphipode Parhyale est un organisme modèle prometteur pour l'étude de l'embryologie crustacé et le développement des arthropodes et l'évolution comparatives. Ce protocole décrit une méthode de suppression manuelle de blastomères simples à partir d'embryons à un stade préliminaire de clivage de Parhyale.
Abstract
Le hawaiensis amphipode Parhyale est un petit crustacé trouvé dans les habitats marins intertidaux à travers le monde. Au cours de la dernière décennie, Parhyale a émergé comme un organisme modèle prometteur pour les études de laboratoire de développement, fournissant une comparaison de outgroup utile pour le modèle d'arthropodes bien étudié organisme Drosophila melanogaster. Contrairement aux clivages syncytial de drosophile, les premiers clivages sont des Parhyale holoblastique. cartographie destin utilisant des colorants traceurs injectés dans blastomères précoces ont montré que les trois feuillets embryonnaires et la lignée germinale sont établis par le stade de huit cellules. A ce stade, trois blastomères sont condamnées à donner naissance à l'ectoderme, trois sont condamnés à donner lieu à l'mésoderme, et les deux blastomères restants sont les précurseurs de la ligne de l'endoderme et le germe respectivement. Cependant, les expériences d'ablation blastomères ont montré que les embryons Parhyale possèdent également capabiliti réglementaire importantees, de sorte que les sorts de blastomères ablation au stade de huit cellules peuvent être prises en charge par les descendants de certains des blastomères restants. Blastomere ablation a été précédemment décrit par l'une des deux méthodes: l'injection et l'activation subséquente de colorants phototoxiques ou ablation manuel. Cependant, photoablation tue blastomères mais ne supprime pas le corps de cellules mortes de l'embryon. Élimination physique complète des blastomères spécifiques peut donc être un procédé préféré d'ablation pour certaines applications. Nous présentons ici un protocole pour l'enlèvement manuel de blastomères simples de la scène à huit cellules d'embryons Parhyale, illustrant les instruments et les procédures manuelles nécessaires à la suppression complète du corps de la cellule tout en gardant les blastomères restants vivant et intact. Ce protocole peut être appliqué à n'importe quelle cellule Parhyale au stade huit cellules, ou à d'autres stades de blastomères de clivage précoce. De plus, en principe, ce protocole pourrait être applicable à CLEA tôtembryons au stade Våge d'autres invertébrés marins clivage holoblastically.
Introduction
Le Parhyale hawaiensis amphipode crustacé a émergé au cours de la dernière décennie comme un organisme modèle prometteur avec un grand potentiel pour une utilisation dans la recherche en biologie évolutive du développement 1. Parmi les arthropodes, la plupart des systèmes modèles sont des insectes, et la plus étudiée de ces derniers est la mouche Drosophila melanogaster. D. melanogaster est un membre de l'ordre des insectes diptères, et que ces affiche de nombreuses caractéristiques embryologiques qui sont dérivées par rapport à ceux des insectes ramification basale 2. En outre, les insectes sont imbriqués dans le sous-embranchement Pancrustacea 3, ce qui signifie que les insectes ont leurs plus proches parents dans le groupe de longue date "naturel" appelé pancrustaceans, et que ce groupe est paraphylétique. Cela suggère que, en plus de ramification basale modèles d'insectes, les études d'autres crustacés sont nécessaires pour avoir une vue plus large de l'histoire de l'évolution des traits développement d'unmécanismes moléculaires nd qui ont été si bien étudiés dans D. melanogaster. Cependant, très peu de crustacés ont été bien établies pour l'analyse de laboratoire expérimental de développement. L'amphipode P. hawaiensis est un système de modèle de laboratoire très docile, prête à une gamme de techniques expérimentales. Amphipodes affichent de nombreuses fonctionnalités uniques dans leur superorder mère Peracarida (trémies de plage, gammares, et crevettes ainsi), et sont donc censés être relativement dérivé dans ce groupe de crustacés. Néanmoins, la relative facilité de manipulation génétique embryonnaire et fonctionnel offert par Parhyale faire cet amphipode un ajout précieux à l'inventaire actuel des organismes modèles.
Comme un animal de laboratoire, P. hawaiensis offre de nombreux avantages. Les animaux sont tolérantes à un large éventail de températures et de salinité, et survivent bien dans les grandes cultures de l'eau de mer artificielle 1. Il est facile de distinguer entrhommes et les femmes een basées sur les différences morphologiques évidentes, plus particulièrement, les grands crochets, les appendices du tronc antérieures que les hommes utilisent pour saisir les femelles pendant l'accouplement. Pour les travaux embryologique et développement, P. hawaiensis a plusieurs caractéristiques très attrayantes. Embryogenèse dure environ dix jours et le temps de la maturité sexuelle est d'environ six semaines à 28 ° C (mais notez que Parhyale survit bien à des températures allant d'environ 20-30 ° C, et que la stadification de développement détaillé est disponible pour les embryons soulevées à 18 º C 4 , 25 ° C 4, et 26 ° C 5,6). Les adultes s'accouplent toute l'année dans le laboratoire, si des embryons sont disponibles à tout moment de l'année. Les femelles pondent 2-20 (en fonction de l'âge des femmes) œufs fécondés dans une poche incubatrice ventrale située entre les premières paires de pattes (figures 1A et 1B), et il est possible de rassembler ces embryonss très tôt dans le développement sans tuer la femelle ou d'endommager les embryons (figure 1C). Les embryons survivent dans l'eau filtrée de mer artificielle jusqu'à l'éclosion, peuvent être fixés pour l'expression du gène ultérieur ou l'analyse histologique 7, et une table de transfert détaillée permet une identification précise des progrès grâce au développement 5. Protocoles robustes ont été utilisés pour effectuer l'analyse de l'expression des gènes par hybridation in situ 8-15 ou immunomarquage 4,16,17 dans, knockdown fonctionnelle par interférence ARN 13,15 ou morpholinos 12, et la lignée germinale stable transgénèse 18. Utilisation du système de transgenèse, une expression inductible 14 et l'amplificateur piège 19 méthodes peuvent également être utilisées pour étudier la fonction de gènes dans P. hawaiensis. Bien que la séquence du génome accessible au public n'est actuellement pas disponible, un transcriptome contenant des transcriptions produites au cours de l'ovogenèse et de l'embryogenèse a abeillen de novo assemblées et annotées 20, et déposés dans une base de données consultable 21, ce qui facilite la découverte de gènes. En somme, P. hawaiensis est un organisme modèle très maniable adapté à de multiples approches expérimentales et génétiques à la compréhension du développement.
Contrairement aux clivages syncytial début de D. melanogaster, P. embryons de hawaiensis clivent holoblastically après la fécondation (figure 2A). analyse traçage de Lineage a montré que par la troisième clivage, chacune des tiers blastomères de clivage est particulièrement malheureuse pour donner naissance à l'un des trois feuillets embryonnaires ou la lignée germinale 6 (figure 2B). Ces données, ainsi que les données de puces à ADN 22, analyses lignée cellulaire 6,23, et les expériences d'isolement de blastomère 4 ont suggéré que les potentiels de développement sont séparés à au moins certains tiers clivage blastomères par héritage asymétrique de cell déterminants du devenir. En conséquence, dans des expériences blastomère d'ablation, dans lequel le précurseur de la lignée germinale (appelée "g" dans le Parhyale lignée cellulaire nomenclature 6) a été éliminé à l'étape de cellule huit, les embryons n'avaient pas les cellules germinales à des stades de développement ultérieurs 4, comme indiqué par l'absence de cellules exprimer la protéine Vasa, qui est un marqueur de la lignée germinale dans la plupart des métazoaires 24. En revanche, les expériences somatiques d'ablation blastomères ont montré que P. embryons de hawaiensis possèdent également des capacités réglementaires importantes, telles que les sorts de mésoderme ou ectoderme blastomères précurseurs ablation au stade de huit cellules peuvent être prises en charge par les descendants de certains des blastomères restants 25. Comment réglementaire remplacement du destin cellulaire peut se produire, et la mesure de l'adoption autonome du destin cellulaire par blastomères somatiques, reste inconnu. Techniques embryologiques expérimentales telles que blastomère ablation peuvent être utiles dans compréding l'autonomie relative et nonautonomy des décisions du destin cellulaire 26,27 et sont donc d'un intérêt dans l'étude de P. hawaiensis embryogenèse.
Dans les expériences qui ont démontré le remplacement de régulation de l'ectoderme et mésoderme lignées, ablation blastomère a été réalisée par injection 28 et excitation ultérieure de colorants phototoxiques 25. Bien que cette technique est efficace pour tuer le blastomère (s) injecté, il ne supprime pas complètement le corps de cellules mortes de l'embryon. En outre, des différences ont été observées entre les données de la lignée de cellules recueillies jusqu'aux stades de l'embryogenèse de gastrulation par injection blastomères avec des traceurs de la lignée fluorescentes 28,29, et les données recueillies par la suite blastomères perturbés par le développement des mêmes stades embryonnaires 23. Élimination physique complète des blastomères spécifiques peut donc être un procédé préféré d'ablation pour certaines applications.
Nous avons déjà publié les résultats de la lignée cellulaire analyse des embryons dont les cellules simples ont été soumises à une ablation manuellement 23. Toutefois, les opérations délicates nécessaires pour éliminer blastomères simples à partir d'embryons de stade de clivage début n'ont pas encore été entièrement décrit. Nous présentons ici un protocole de collecte de P. embryons de hawaiensis et ablation manuelle d'un seul blastomère d'un embryon au stade de huit cellules. Le but de cette méthode est de parvenir à l'élimination complète du corps de la cellule de l'embryon, permettant l'observation des comportements cellulaires et les compétences du destin cellulaire des cellules restantes au cours de l'embryogenèse et le développement post-embryonnaire. Notre protocole montre l'enlèvement du précurseur g de la lignée germinale (figure 2C), mais peut être appliquée à n'importe quelle cellule au stade huit cellules, ou à des blastomères étapes de clivage précédents. En principe, ce protocole pourrait être appliquée pour éliminer les cellules individuelles à partir d'embryons à un stade préliminaire de clivage d'Other clivage holoblastically invertébrés marins.
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Protocol
Les commentaires qui pourraient être utiles dans l'exécution de certaines mesures sont indiquées en italique.
Une. Jour 1: Préparation des matériaux
- Préparer les documents suivants (voir le tableau des matériaux et de l'équipement):
- 15 cm et 22 cm de pipettes Pasteur
- Diamant scribe
- eau de mer artificielle filtrée (salinité entre 0,0018 à 0,0020) contenant 1 mg / ml d'amphotéricine B (1:100 d'une solution stock de 100 mg / ml), 100 unités / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine (1h50 d'une solution mère contenant 5000 unités / ml de pénicilline et 5,000 mg / ml de streptomycine)
- Filtre à eau de mer artificielle (salinité entre 0,0018 à 0,0020) sans additifs
- un récipient en matière plastique à grande pour les couples de logement (au moins 15 cm x 15 cm x 5 cm)
- petits (3 ou 5 cm) des boîtes de Pétri bordées de Sylgard
- petits (3 ou 5 cm) des boîtes de Pétri
- un verre de montre ou de verre plaque multi-puits
- forceps (nous utilisons le forceps émoussé dérivés vientm old Dumont # 5 pinces qui ont été accidentellement endommagés dans d'autres procédures de laboratoire, que nous avons réutilisés en utilisant une pince à aiguiser pierre à faire en sorte que les extrémités de la pince sont lisses, que les deux dents sont de même longueur, et qu'elles n'ont plus pointes. Pinces très fines, comme les nouveaux Dumont # 5 forceps, sont indésirables car ils peuvent blesser les embryons et / ou des femmes.)
- pipette Pasteur avec fin élargi (étape 1.2 dessous)
- un outil de recherche sur l'embryon constitué d'un mince fil de tungstène courbe intégré dans l'extrémité mince d'une pipette Pasteur (peut être remplacé par un autre de mettre en œuvre, voir 1.3 ci-dessous)
- une pipette de bouche avec une petite ouverture (voir l'étape 1.4 ci-dessous)
- une aiguille de verre fabriqué à partir d'un capillaire en verre tiré (voir étape 1.5 ci-dessous)
- Pour faire la pipette élargi Pasteur, premier score autour d'une pipette 15 cm de Pasteur à l'endroit où la pipette commence à se rétrécir avec une pointe en diamant, envelopper la région a reçu de la pipette dans une serviette Kimwipe ou papier pour protéger les doigts, puis soigneusement rompre la pointe sur la ligne de score. Tenez l'extrémité cassée de la pipette sur une flamme du brûleur Bunsen pendant plusieurs secondes pour lisser les bords. L'ouverture doit être légèrement plus étroite que la largeur maximale de la pipette.
- Pour rendre l'outil de dissection de fil de tungstène, insérer un fil de tungstène dans l'extrémité d'un 15 cm pipette Pasteur en verre, et maintenez brièvement sur flamme d'un brûleur Bunsen pour faire fondre le verre, fixant le fil en place. Utilisez une pince à courbe doucement l'extrémité du fil en forme de crochet. Voir Figure 3 pour un exemple d'une forme appropriée pour cet outil.
- Pour faire une petite ouverture pour la bouche pipette, tirez l'extrémité mince d'une pipette Pasteur 22 cm en deux vo pièceser une flamme, et rompre la pointe de la petite extrémité. Insérer dans l'extrémité du porte-pipette de la bouche.
- Ajoutez l'aiguille de verre qui sera utilisé pour perforer les blastomères d'intérêt au cours de la procédure d'ablation à l'aide d'un extracteur d'aiguille. Une aiguille de forme appropriée est représentée sur la Figure 4. Cette aiguille a été tiré sur un extracteur d'aiguilles Sutter P97 utilisant un programme avec des paramètres 2x (chaleur = 566, tirez = 100, vitesse = 20, temps = 250) + 1X (chaleur = 566, tirez = 100, vitesse = 100, temps = 250). Le programme et l'instrument spécifique utilisé pour faire l'aiguille peuvent varier, mais l'aiguille doivent avoir une pointe fine, mais aussi être suffisamment solide pour ne pas casser lorsqu'il est poussé contre le chorion de l'embryon.
2. Jour 1: Couples Rassemblement Parhyale accouplement
- Utilisez la pipette Pasteur élargi (étape 1.2 ci-dessus) pour recueillir l'accouplement P. couples hawaiensis du grand récipient de culture, et les transférer dans un récipient contenant séparé cpencher en eau de mer artificielle. Il n'est pas nécessaire que cette eau de mer filtrée. Il est préférable de recueillir des paires de contact dans l'après-midi plus tard et de laisser les couples à la température ambiante (20-23 º C) pendant la nuit, de sorte que le lendemain matin, la plupart des embryons aura été récemment fécondé et déposé, et donc au début du clivage des stades appropriés pour ablation. Recueillir au moins 20 paires de contact pour s'assurer que certaines femmes seront munis embryons au stade de clivage début le lendemain matin.
3. Jour 2: Rassemblement Parhyale embryons
- Le lendemain matin, infuser l'eau de mer artificielle filtrée (FASW) de CO 2. Certaines des femmes auront nagé sans leurs hommes pendant la nuit, de recueillir ces femmes séparées et anesthésier les dans FASW / CO 2. Les mâles non appariés restants peuvent être retirés à partir du récipient d'accouplement paire et retournés à la grande culture. Couples reproducteurs restants peuvent être enregistrés pour la collecte des embryons plus tarddans la journée ou le lendemain.
- Transférer une seule femelle anesthésié portant des embryons à un verre de montre dans FASW / CO 2. Toutes les femmes séparées auront probablement déposé des œufs, qui sera visible à l'oeil nu comme rose pâle ou sphéroïdes pourpre à travers les plaques coxales transparentes des femmes (figure 1A). Pour déterminer si les embryons sont à des stades précoces de clivage et donc approprié pour blastomère ablation, le chercheur devra éliminer les embryons de la poche incubatrice et les examiner sous un microscope.
- Affichage de la procédure sous un microscope de dissection, saisir les plaques coxales long d'un côté du corps avec des pinces. Les embryons seront visibles dans la poche incubatrice ventrale entre ces plaques coxales (figure 1B).
- Insérez l'outil de fil mince, courbe (Figure 3; étape 1.3 ci-dessus) dans l'extrémité postérieure de la poche incubatrice, et soulevez doucement le fil vers l'extrémité antérieure de la poche incubatrice de séparer le couvainrevêtements de poche (ceux-ci sont modifiés appendices ventraux appelés oostégites 30), l'ouverture de la poche et desserrer les embryons. Les embryons qui sont dans la première heure ou d'être mis sont tous enfermés dans une membrane transparente très mince qui sera facilement être perturbé par l'outil de fil; cette membrane disparaît d'environ 2-3 heures après la ponte, et les embryons ne sont pas liés à l'autre ou à la femelle en aucune façon partir de ce point tout au long de l'embryogenèse. Si les chercheurs trouvent gênant ou difficile à manoeuvrer l'outil métallique courbé pour éliminer les embryons de la poche incubatrice, une alternative mise en œuvre peut être utilisé, à condition que les mouvements sont doux et pas de pression sévère est appliquée sur les embryons ou la poche incubatrice. Autres outils appropriés pour éliminer les embryons de la poche incubatrice comprennent forceps émoussé ou un capillaire de verre scellée à une extrémité et lissée.
- Utilisez une pipette 15 cm inchangé Pasteur à injecter de l'eau à travers la poche de couvée ouvert, poussant til embryons, ce qui devrait se déposer au fond du verre de la montre. Transférer la femelle pour nettoyer FASW (sans CO 2) pour permettre la récupération avant sa réintroduction à la culture principale. Femelles multiples peuvent être placés dans le même bac de récupération, mais permettent femmes à se remettre complètement avant de les renvoyer à la culture principale, comme ils peuvent être mangés par d'autres animaux si elles sont encore partiellement anesthésiés.
- Utilisez une pipette 15 cm inchangé Pasteur pour transférer les embryons dans une boîte de Pétri avec FASW propre, et voir au microscope afin de déterminer leur stade embryonnaire. Embryons qui sont séparés lors de la troisième clivage (étape 4 de 5), qui sont appropriés pour cette procédure. Il devrait également être possible d'appliquer ce protocole à n'importe quel stade de clivage avant la formation de disque embryonnaire (stades 7 au 8 mai).
4. Jour 2: Ablation cellules isolées
- Remplissez boîte de Pétri Sylgard doublée d'une couche superficielle de FASW. Utilisez une inchangée 15 cm pi Pasteurpette de transférer un seul embryon à la plaque.
- En utilisant une pince émoussée, rouler doucement l'embryon d'identifier la cellule à l'ablation (Figures 2A et 2B). Le précurseur g de la lignée germinale peut être identifié comme le plus petit micromere, qui se trouve au sommet de la plus petite Mav de macromere. En outre, g ne touche pas directement la cellule en, qui est le micromere directement en face de lui, comme les micromères précurseurs de mésoderme ml et la part de mr une bordure de cellule dans le milieu de l'embryon. Mr le blastomère à droite de g, et ml est la micromere à la gauche de g. Les macromères sœurs de mr, ml, et en sont les précurseurs de l'ectoderme Er, El, et Ep respectivement.
- Avec des pinces dans le left la main si le chercheur est droitier (ou dans la main droite si le chercheur est gaucher), orienter l'embryon avec la cellule d'intérêt vers la droite (ou à gauche si le chercheur est gaucher), et saisir doucement l'embryon entre la pince pour le stabiliser.
- En utilisant une aiguille tirée de verre (de l'étape 1.5 ci-dessus, la figure 4), la perforation doucement la cellule d'intérêt. Ne pas insérer l'aiguille trop loin, afin de ne pas pousser l'aiguille dans les cellules voisines ou en dessous de la cellule d'intérêt. L'aiguille n'a plus qu'à percer le chorion et la membrane de la cellule sous-jacente, et n'a pas besoin de s'étendre profondément dans la cellule à ablater.
- Échanger l'aiguille utilisée pour percer l'embryon pour la fin de verre d'une pipette de bouche avec une amende tiré pointe de la pipette Pasteur (étape 1.4 ci-dessus). Maintenez la pointe de la pipette à proximité du trou créé dans la cellule d'intérêt, et appliquer une aspiration très doux.
- Très presser doucement l'embryon avec la pince. Comme le contenu du blastosimple est poussé hors du chorion par le trou créé à l'étape 4.4, sucer dans la bouche pipette pour permettre une vue dégagée de l'embryon. Si le trou est suffisamment grand, le noyau de la cellule perforé peut être vu à émerger aussi bien. C'est un bon contrôle pour s'assurer que le contenu des cellules entières ont été supprimés et ne peuvent pas être régénérée.
- Observer attentivement l'embryon comme le blastomère d'intérêt est retiré. La bordure de la cellule perforé va reculer vers le trou dans le chorion, ce qui rend les intersections des cellules sous-jacentes visibles. Continuer à appliquer une pression jusqu'à ce que tout le blastomère d'intérêt a été éliminée. Utilisez une pince à rouler l'embryon de gauche à droite et de confirmer visuellement que toutes les blastomère d'intérêt est allé.
- Utilisation d'un non modifiée 15 cm pipette Pasteur, transférer l'embryon pour nettoyer FASW + (FASW + 1 mg / ml d'amphotéricine B, 100 unités / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine).
- Soulever des embryons de blastomères-ablation dans des puits individuelsd'une assiette propre de 48 puits dans FASW +, changer 50% de FASW aux antibiotiques complété + quotidien. Dans nos mains embryons survivent et se développent bien, même après l'ablation, à une gamme de températures de 18 à 28 º C. Les chercheurs devraient élever leurs embryons à une température pour laquelle ils ont une surface propre (mais pas nécessairement stérile) sur lequel élever les embryons avec une perturbation minimale. Pour être en mesure de comparer le calendrier des événements de développement dans des embryons de blastomères-ablation avec des contrôles, nous renvoyons le lecteur à l'information de la mise en scène de développement détaillé est disponible pour les embryons soulevées à 18 º C 4, 25 º C 4, et 26 º C 5,6.
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Representative Results
Après ablation réussie de seul troisième clivage P. micromères de hawaiensis comme décrit dans ce protocole, les micromères restants passent progressivement leurs positions légèrement de manière à occuper partiellement l'espace précédemment occupé par le blastomère ablation. Par exemple, lorsque g est retiré, le voisin blastomères MR et ML décaler légèrement et venez partager les bordures de cellules latérales qui étaient auparavant en contact direct avec g (comparer la figure 2A et 2C). Après ablation réussie, les blastomères restants peuvent afficher un léger retard (de moins d'une heure) avant d'entrer dans la quatrième clivage, mais ils doivent ensuite reprendre les mêmes schémas de clivage et le calendrier qu'ils ont affiché dans les embryons non manipulés au moins par le biais de la gastrulation met en scène 23 . Après l'ablation de l'un des quatre micromères, descendants de la blasto restantmares devraient également montrer calendrier de clivage normal et comportements cellulaires, y compris la formation d'une entente cellulaire caractéristique appelée la "rosette" et l'initiation des mouvements de gastrulation 23. La proportion d'embryons qui survivent à la procédure d'ablation et de l'embryogenèse complète grâce à l'éclosion peut initialement être de l'ordre d'environ 10% pour un chercheur de nouveau à la technique, mais avec l'expérience devrait être en moyenne d'environ 50%, et peut être aussi élevé que 75% à la pratique et aux soins vigilants des embryons après ablation blastomère. Tableau 1 montre des exemples de nombre d'embryons ablation et les taux de survie pour une série d'expériences d'ablation successives effectuées par le même chercheur, montrent que les taux de survie sont généralement au moins 80% pour le premier peu jours après l'ablation, et que les taux de survie jusqu'à l'éclosion hausse avec l'expérience du chercheur.
Suppression incomplète de blastomère seraittémoigne en voyant les restes de la blastomère qui aurait dû être soumise à une ablation, qui pourraient inclure des composants de la membrane, cytoplasme, ou des granules de jaune, toujours situées dans le chorion de l'embryon. Un retard dans la quatrième clivage de plus de deux heures, ou des motifs de clivage irréguliers ou des comportements cellulaires de descendants des blastomères restants, pourrait également indiquer ablation échoué. Ces phénomènes peuvent être le résultat de dommages causés aux autres blastomères au cours de la procédure d'ablation. Si blastomères autres que celui visé pour l'affichage de l'ablation des anomalies morphologiques ou se désintégrer, puis de nouveau endommager a probablement été causé à d'autres blastomères au cours de la procédure d'ablation.
Si les marqueurs du destin cellulaire sont disponibles pour marquer les descendants des blastomères tiers de clivage spécifiques dont les destins ne sont pas soumis à un remplacement réglementaire, puis une confirmation supplémentaire de l'ablation réussie peut être obtenue par étiquetage manipulé embryons de ces marqueurs Folloaile de l'ablation. Marqueurs de certains mésodermiques et ectodermiques territoires ont été décrits au milieu à la fin des étapes de l'embryogenèse 8,14,15. Toutefois, en raison à la fois de ces couches germinales peut subir le remplacement de régulation en cas de perte d'un de leurs fondateurs blastomères 25, ces marqueurs ne peuvent pas déterminer sans ambiguïté si blastomère ou non ablation a réussi. Dans le cas du précurseur g de la lignée germinale, tous ses descendants sont marqués par l'expression de vasa transcription 12 et la protéine 4 tout au long de l'embryogenèse, et les embryons dans lequel g a été ablation des cellules manque germinales au moins jusqu'à la bande de germe premières étapes 4. Ablation réussie de g peut donc être confirmée par l'examen de l'expression de vasa suivante ablation dans les étapes ultérieures de l'embryogenèse (figure 5).
e = "5 po" fo: src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg" />
Figure 1. Adulte Parhyale hawaiensis femelle et embryons. (A) de la vue latérale d'une femelle adulte P. hawaiensis, montrant plaques coxales (flèches), appendices thoraciques (pointes de flèche) et embryons visibles sous forme de sphéroïdes roses ou pourpres à travers les plaques coxales transparentes (pointillé bleu). Antérieur, est à la gauche. (B) Vue ventrale d'une femelle adulte P. hawaiensis montrant embryons visibles dans la poche incubatrice (contour en pointillé bleu). Antérieur, est à la gauche. (C) Les embryons libérés de poche incubatrice se développent normalement dans FASW. Une variété d'étapes allant de S1 à l'éclosion sont présentés, mis en scène selon Browne et al 5 barre d'échelle = 1 mm (A) et (B);. 500 um (C).51073/51073fig1highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Huit embryons au stade de cellules de P. hawaiensis. (A) Live stade de huit cellules (S4 étape 5) embryon non manipulée, comprenant quatre micromères (cellules plus petites) et quatre macromères (cellules plus grandes). (B) Schéma d'un embryon au stade de huit cellules montrant les désignations de tous les blastomères dans un embryon de type sauvage du destin cellulaire tel que révélé par la lignée de traçage sur la base de marqueurs fluorescents 6. (C) Live S4 embryon au stade qui a eu la g blastomère éliminé par le présent protocole. La région encerclée montre la région autrefois occupée par le g blastomère; lamicromères restants sont passés position légèrement en raison de l'ablation de g. Barre d'échelle = 250 um (A) et (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. outil de fil utilisé pour enlever les embryons de la poche incubatrice. L'outil présenté ici a été fait par l'insertion d'un fil de tungstène dans l'extrémité étroite d'une pipette Pasteur et doucement la fusion du verre pour sceller le fil en place, puis en utilisant une pince à introduire une courbe douce dans le fil. Autres outils appropriés pour éliminer les embryons de la poche incubatrice comprennent forceps émoussé ou un capillaire de verre scellée à une extrémité et lissée. Caroline du Sudale bar = 1 cm.
Figure 4. Aiguille de verre utilisé pour perforer blastomères au cours de la procédure d'ablation. L'aiguille montré ici a été tiré sur un extracteur d'aiguilles Sutter P97 utilisant un programme avec des paramètres 2 x (chaleur = 566, tirez = 100, vitesse = 20, temps = 250) + 1 x (chaleur = 566, tirez = 100, = vitesse 100, temps = 250). D'autres instruments ou programmes peuvent être utilisés pour tirer des aiguilles appropriées pour l'ablation, tant qu'ils sont de la même forme générale que celui représenté ici. Barre d'échelle = 1 cm.
Figure 5. Évaluer les résultats de blastomère uneblation cours de l'embryogenèse. (A) région des gonades d'un type sauvage S29 stade embryon peu de temps avant l'éclosion, montrant des cellules germinales marquées par anti-Vasa immunologique (pointes de flèches). L'anticorps anti-Vasa utilisé ici est spécifique à P. hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes et Extavour, données non publiées). (B) la région des gonades d'un embryon de S29 de phase qui a la g blastomère éliminée au stade huit cellules, montrant l'absence de cellules germinales comme révélé par l'absence de signal anti-Vasa spécifique dans la région des gonades (têtes de flèches). La barre d'échelle (A) = 100 um et s'applique également à (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| au long de l'ablation | # Ablatées | # (%) De survivantspour le développement de 50% | # (%) A survécu au développement de 90-100% |
| 1 | 49 | 41 (83,7) | 6 (12,2) |
| 2 | 48 | 46 (95,8) | 17 (35,4) |
| 3 | 31 | 25 (80,6) | 22 (71,0) |
| 4 | 97 | 72 (74,2) | 56 (57,7) |
| 5 | 108 | 100 (92,6) | 65 (60.2) |
| 6 | 50 | 36 (72,0) | 37 (74,0) |
| TOTAL | 383 | 320 (83,6) | 203 (53,0) |
Tableau 1. La survie de l'ablation représentantstatistiques. Après micromere ablation, la survie a été marqué à la fois dans les 50 premiers% du développement (5-6 jours à 25 º C), puis au développement de 90-100% (10-12 jours à 25 º C). Ablation complète 1-6 sont des exemples représentatifs des expériences réalisées par un seul chercheur (AR Nast) dans l'ordre chronologique au cours d'une période de huit mois. Les chercheurs doivent trouver que, comme indiqué ici, le taux de survie à l'augmentation de développement de 90-100% avec l'expérience.
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Discussion
Nous décrivons un protocole pour l'ablation d'emploi et l'élimination physique complète de blastomères simples à partir des stades de clivage début de l'amphipode P. hawaiensis. Nous démontrons l'utilisation de ce protocole en supprimant la seule ligne de cellules germinales précurseur g à partir d'un embryon au stade de huit cellules, et montrons que l'ablation a été un succès en confirmant l'absence de cellules filles de g dans l'embryogenèse plus tard. Ce protocole peut être utilisé pour enlever les micromères de l'embryon à des stades précoces de clivage. Pour utiliser ce protocole pour éliminer macromères à ce stade, ou blastomères au premier ou deuxième étapes de clivage, les utilisateurs peuvent simplement appliquer les légères modifications de la création d'un peu plus grand trou dans le chorion à l'étape 4.4, et en appliquant une pression et d'aspiration pour un temps plus long pour retirer le plus grand volume de contenu de la cellule à l'étape 4.6. Nous avons constaté que suite à l'utilisation de ce protocole, le développement des blastomères restants après ablation est nonaffecté par rapport à des schémas de clivage et de mouvement de cellule à travers au moins le moment de la gastrulation 23.
Ce protocole pourrait être utile pour la poursuite de l'enquête dans le potentiel de développement des blastomères de clivage début de cet amphipode. Beaucoup de questions restent sans réponse dans ce domaine, y compris pourquoi certaines cellules mais pas d'autres peuvent changer sorts pour remplacer ceux de blastomères ablation, et le calendrier précis et des mécanismes de ces changements régulateurs. Le protocole peut également être modifié pour s'adapter à l'ablation de plus d'une cellule, en répétant les étapes 4.2 à 4.7 simplement successivement sur les blastomères d'intérêt.
Il est important d'utiliser un microscope stéréoscopique de haute qualité avec un éclairage approprié afin de visualiser et d'identifier correctement les premiers blastomères de clivage. Nous constatons que la lumière blanche incidente latérale à partir d'une source de lumière froide à fibres optiques est la plus utile dans ce but. La lumière incidente au dessus de la SPECIMen crée des réflexions qui peuvent masquer les morphologies et les limites cellulaires, tandis que la lumière transmise ne pénètre pas le jaune dense des embryons et blastomères sont donc difficiles à distinguer. Il est plus utile pour le verre de montre ou boîte de Pétri contenant des embryons pour être placé sur une surface noire plutôt qu'une surface de verre blanc ou transparent, car cela offre un meilleur contraste pour les embryons pâles.
Une limitation de ce protocole est que le blastomère d'intérêt doit être correctement et clairement identifié avant de commencer la procédure. techniques de photo-ablation seraient plus utiles pour les chercheurs qui découvrent le système, puisque les embryons peuvent être laissés à développer pendant quelques cycles de clivage après l'injection du colorant fluorescent 28, et l'identité du blastomère injecté confirmé après l'injection, mais avant photoablation, en analysant les motifs des descendants cellulaires, qui ont été bien décrites dans la ligne de la cellule précédenteanalyses âge 6,23. Une fois les chercheurs sont familiers avec le P. hawaiensis embryon et peut identifier tous les blastomères avec confiance, l'ablation manuelle décrite ici pourrait être utilisée pour des applications où l'élimination physique complète d'un blastomère, plutôt que de tuer la cellule sans enlever le corps de cellules mortes de l'embryon, est souhaitable.
Cette procédure pourrait en principe être appliqué pour éliminer blastomères simples à partir d'embryons au stade de clivage d'autres crustacés clivage holoblastically, ou d'autres invertébrés marins ou d'eau douce dont chorions ou des membranes de fécondation ne peut pas être facilement enlevé. Modifications pourraient comprendre l'utilisation des médias d'incubation avec des caractéristiques appropriées de salinité, et la modification de la forme de l'aiguille pour accueillir les membranes les plus délicates (plus minces, aiguilles) ou des revêtements embryonnaires plus robustes (plus courts, effilés rapidement aiguilles).
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Rayhan Arif et Hassaan Shahawy pour le travail de la caméra, Tripti Gupta et Frederike Alwes à l'aide d'affiner la technique d'ablation de la cellule, et les membres du laboratoire Extavour pour les informations sur les données, la vidéo et manuscrit. Ce travail a été partiellement financé par l'Institut des cellules souches de Harvard (semences nombre de Grant SG-0057-10-00) de la Fondation Ellison médical (New Scholar nombre Award AG-NS-07010-10) à la CGE, et bourses de recherche du Collège Harvard ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
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