Dieses Papier bietet eine Schritt für Schritt Anleitung, um die Fluktuationsanalyse-Technik k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) zur Messung der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenz in lebenden Säugerzellen gekennzeichnet Plasmamembranproteinen.
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Methodenartikel
Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Lateral Diffusion und Kompartimentierung der Plasmamembran-Proteine sind fest in Zellen reguliert und damit das Studium dieser Prozesse werden neue Erkenntnisse zur Plasmamembran-Protein-Funktion und Regulation offenbaren. Kürzlich, k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) wurde entwickelt, um ein Routine-Messungen der Diffusionskoeffizienten direkt aus Bildern von fluoreszierend markierten Plasmamembran-Proteine, die von Photophysik Sonde eingeführt systematischer Fehler vermieden zu ermöglichen. Obwohl die theoretische Grundlage für die Analyse kompliziert ist, kann das Verfahren durch Nicht-Experten unter Verwendung einer frei verfügbaren Code zum Diffusionskoeffizienten von Proteinen messen implementiert werden. KIC berechnet eine Zeitkorrelationsfunktion von einem Fluoreszenzmikroskopie Bildstapel nach Fourier-Transformation jedes Bild, um gegenseitige (k-) Raum. Anschließend Kreismittelung, natürlichen Logarithmus-Transformation und lineare passt zu der Korrelationsfunktion ergibt sich die Diffusionskoeffizienten. DiesPapier bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Bildanalyse und Messung von Diffusionskoeffizienten über KIC.
Zuerst wird eine hohe Bildrate Bildsequenz eines fluoreszierend markierten Plasmamembranprotein mit einem Fluoreszenzmikroskop erfasst. Dann wird ein Bereich von Interesse (ROI) zu vermeiden intrazellulären Organellen, Vesikel bewegt oder hervorMembranBereiche ausgewählt. Die ROI-Stapel in einem frei verfügbaren Code importiert und mehreren definierten Parameter (siehe Abschnitt Methode) sind für die KIC Analyse gesetzt. Das Programm erzeugt dann einen "Hang Pisten" Handlung aus den k-Raum-Zeit-Korrelationsfunktionen und der Diffusionskoeffizient wird aus der Steigung des Grundstücks berechnet. Unten finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um die KIC Diffusionskoeffizient eines Membranproteins messen mit der renalen Wasserkanal Aquaporin-3 mit EGFP als kanonische Beispiel verschlagwortet.
Einleitung
Die vierdimensionale Raum-Zeit-Organisation und die seitliche Beweglichkeit der Plasmamembran-Proteine sind streng reguliert und können in Protein-Funktion, Aktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen eine Rolle spielen. Die laterale Diffusion von Plasmamembranproteinen, wird traditionell von der Berechnung Diffusionskoeffizienten für Einzelpartikel aus Zeitraffer-Bildgebung von Quantenpunkt-oder Farbstoff markierte Plasmamembran-Proteine 2-4 untersucht. Dieser Ansatz erfordert das Einführen eines extrazellulären Tag in der Plasmamembranprotein für Quantenpunkt oder Farbstoffmarkierung, die die Proteinfaltung und die Funktion beeinträchtigen können und daher nicht für einige Proteine erreicht werden. Die sterische Volumen einer Quantenpunkt ist gezeigt worden, um die Diffusion des Proteins 5 zu verlangsamen und weiterhin nur ein winziger Bruchteil der Proteine in der Bevölkerung mit Quantenpunkten markiert ist, und es ist nicht bekannt, ob diese Fraktion repräsentativ ist für die Gesamt Pool von Plasmamembranproteinen. Einzelpartikel tracking (SPT) Messungen der Diffusionskoeffizienten von Bild-Serie von Quantenpunkt-markierten Proteine beinhaltet Zuordnung der abgebildeten Spitzenpositionen der Partikel mit zweidimensionalen Gauß-Anfälle durch umfangreiche Analysealgorithmen gefolgt. Die Analyse ist sehr rechenintensiv und erfordert umfangreiche nicht-lineare Kurvenanpassung in jedem Einzelbild einer Zeitraffersequenz, um Näherungen der Objektpunktverteilungsfunktion (typischerweise zweidimensionale räumliche Gauß) und anschließender Verknüpfung der Partikelpositionen in Trajektorien beschreiben die Bewegung einzelner Moleküle 6,7.
Eine kürzlich entwickelte Bildkorrelationsverfahren, k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) ermöglicht relativ einfachen Messungen der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenzmarkierten Plasmamembranproteinen. Die Möglichkeit, routinemäßig berechnen Diffusionskoeffizienten von Membranproteinen mit fluoreszierenden Proteinen markiert durch KIC ist ein einzigartiges Werkzeug, das hältmehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Quantenpunkt SPT Analyse: Keine Insertion von extrazellulärem Tags und zeitaufwendig extrazelluläre Markierung erforderlich ist (Zelllinien, die fluoreszierende Proteine verwendet werden können); Diffusionskoeffizienten aus dem Gesamtpool von fluoreszierenden Proteinen im Vergleich zu einer Teilmenge mit Quantenpunkten markiert extrahiert; Analyse ohne die Notwendigkeit, einzelne Proteine verfolgt einfach und die Analyse kann unter Verwendung einer vorhandenen Code ohne Erfordernis zusätzlicher Anwenderprogrammierung durchgeführt werden. Das Verfahren ist schnell, da es eine Mittelungstechnik, die eine schnelle Berechnung und die Berechnung der Diffusionskoeffizienten ermöglicht. Diese schnellen Diffusionsmessungen für das Protein Bevölkerung ergänzen die detaillierte Informationen molekularen Transport durch die sorgfältige SPT Methoden für eine Teilmenge der Bevölkerung erhalten.
KIC Zeit korreliert Fluoreszenzmikroskopie Bildfolgen, die als erste Fourierraum transformiert worden sind, und dadurch trennt fluorescence Schwankungen durch Photophysik von den zur molekularen Transport ein. Als Ergebnis kann die Anzahl KIC Dichte zu bestimmen, Durchflussgeschwindigkeit und Diffusion von fluoreszenzmarkierten Molekülen während unvoreingenommene durch komplexe Photobleichen oder blinkt der Fluorophore. Dies macht KIC ein nützliches Werkzeug für die schnelle Bestimmung der Diffusionsdynamik des fluoreszenzmarkierten Zellmembranproteinen, ohne dass individuelle Schreib Algorithmen. Neben der fluoreszenzmarkierten Proteine, KIC auch auf Quantenpunkt-markierten Membranproteine 8 angewendet werden.
Dieses Papier bietet eine Schritt-für-Schritt-Einführung, wie man KIC verwenden, um Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembran-Proteine durch den Nachweis, wie man die Ernte zu platzieren, wie man den Code und wie man die generierten Plots, auszuwerten extrahieren, aus dem Diffusions Koeffizienten extrahiert. Als Beispiel Daten durch Spinning-Disk-Mikroskopie-Set im internen Halbtotalreflexion erhalten fluoreszierennce (TIRF)-Modus, einer Nieren-Wasser-Kanal-Protein Aquaporin-3 (AQP3) mit EGFP markiert wird vorgestellt.
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Protokoll
Erwerb von EGFP-markierte Proteine in der Plasmamembran für die KIC-Analyse kann auf einem Epifluoreszenzmikroskop, einem TIRF-Setup oder auf einem Spinning-Disk-Mikroskop eingestellt, um Bilder der Membran von Interesse erwerben geführt werden. Das Kamerapixelgröße sowie der Zeit zwischen Einzelbildern ist für die Analyse benötigt. Bildsequenzen von 100-1,200 Rahmen mit einer Rahmenrate von 4-30 Hz für die Analyse verwendet werden. Während der Erfassung, ist es wichtig, um die Membran scharf während der gesamten Dauer der Bilderzeugungs halten und sich auf einen Bruchteil der Flachmembran, in der die Fluoreszenz gleichmäßig verteilt. Umzug Vesikel, hervorstehende Membranbereiche und Zellorganellen kann später im Analyseprozess beschnitten werden. Die Erfassungszeit sollte so gewählt werden, dass es keine Drift oder Bewegung der Zelle.
KIC-Code Skripte für MATLAB zu erhalten, wenden Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). Das erste Mal die KIC-Code verwendet wird, geöffnet MATLAB und klicken Sie auf Datei, dann set path, klicken Sie dann auf Add mit Unterordnern und finden Sie den Ordner auf dem Computer, in dem die KIC-Code befindet. Dann klicken Sie auf OK, speichern und schließen. Jetzt mit der Analyse von Kulturen in den nächsten Punkten beschrieben fortsetzen.
1. Importieren Sie die Bildsequenz in der Nähe in einem Imaging-Analyse-Programm als TIFF-Stapel
Speichern Sie die Datei mit dem Namen: stack1.tif.
- Wählen Sie eine rechteckige Region of Interest (ROI) auf dem flachen Teil der Membran ohne bewegliche Zellorganellen und hervorstehende Membran Regionen. Die Erntemenge wird so gewählt, dass genügend Statistiken sind für eine gute k 2 Grundstücke erzeugt.
- Schneiden Sie das Region und speichern Sie die Ernte als TIFF-Datei in einem entsprechenden Ordner. Wenn es mehrere Pflanzen aus dem gleichen Film, verwenden Sie eine Reihe Schritt, z. B. "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
- Legen Sie den Ordner lokal mit den Kulturenauf dem Computer, nicht auf einem Server, während Sie KIC-Analyse.
2. Importieren Sie die Feldfrüchte in die Analyse-Software One by One, um die Analyse durchzuführen
- Offene MATLAB und geben Sie "icsgui" im Befehlsfenster, und drücken Sie ENTER. ICS-GUI ist die ausführbare Namen für das Bild-Korrelationsspektroskopie grafische Benutzerschnittstellenprogramm.
- In der ICS-GUI auf die Registerkarte "KIC". Ein Screenshot des Analysefensters ist in Fig. 1 gezeigt.
- Suchen Sie den Ordner mit dem Namen des Ordners "MATLAB-Code" und navigieren Sie zu der Datei mit dem Dateinamen "Scripts" und öffnen Sie diese durch Doppelklick. Alternativ der rechten Maustaste auf die Datei und wählen Sie "Öffnen mit MATLAB" oder gehen Sie zu Datei, in MATLAB offen und öffnen Sie das Script-Datei. Diese Datei wird als Editor.
- Im Editor navigieren Sie zu "Load KIC Datensätzen", dann kopieren oder Typ Dateinamen und Ordner in die Kommandozeile, die beginntmit img = zB "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". In der Kommandozeile unter dem Ordner die Anzahl der Frames analysiert werden - z. B. [1:500]. Verwenden Sie die gleichen Einstellungen für alle Folge-Filme in der Datenreihe. Wenn es Fokusdrift in späteren Bildern, sollten diese von der Analyse ausgeschlossen werden.
- Im Editor klicken Sie auf "Speichern" und dann auf "bewerten Zelle". Der Datensatz wird nun in in die Analyse-Software geladen.
- In der KIC Analyse-Fenster in der GUI, geben Sie die Einstellungen für die Analyse:
- Unclick "T cell"-Boxen.
- Geben die Anzahl der Zeitverzögerungen zu analysieren. Die Anzahl der Zeitverzögerungen (τ) wird Einfluss auf die Diffusions Grundstück haben und muss so gewählt werden, dass die Diffusion Handlung ist linear sein. Beginnen Sie mit der Eingabe 25 und dann, wo die Diffusions Handlung ist linear abnehmen. τ ist die Anzahl der Zeitverzögerungen der KIC-Analyse vergleicht und eine Zeitverzögerung ist die Zeit, bwischen einem Rahmen und die nächste. Der kleinste Wert, der eine lineare Handlung gibt gewählt werden. Die maximale Anzahl von Zeitverzögerungen ist so gewählt, daß eine lineare Regression erhalten wird, die Wahl eines höheren Wertes werden die Daten, die nicht Leitung angebracht werden können herzustellen.
- Geben Sie die maximale k 2-Wert (siehe Kreis 1 in Fig. 1), ist es in der Regel 20-50. Eine gute k 2 Grundstück ist ein Plot, in dem es viele Datenpunkte, die entlang einer Linie verteilt sind. Beginnen Sie mit der Eingabe 70 und dann ausgewertet, nachdem die k 2 und Diffusion Grundstücke zu verringern, und wählen Sie den niedrigsten Wert, wo die Datenpunkte gruppieren sich um eine gerade Linie. Der k-2-Wert ist der eckige Größe der k-Raumvektor im Fourierraum.
Zunächst sollte die Analyse wiederholt, bis die besten Werte ermittelt werden, dann verwenden Sie die gleichen Einstellungen für alle folgenden Filme in der Datenreihe aber immer überprüfen, ob die gewählten Einstellungen geben eine gute Anpassung an die Daten werden: gut k 2 Grundstückeund einer linearen Diffusions Handlung. - Klicken Sie auf "Einstellungen speichern und fahren".
- Klicken Sie "Ja", um alle Grafiken zeigen.
- Klicken Sie auf "Load Bild-Serie" (siehe Kreis 2 in Abbildung 1), dann klicken Sie auf "Arbeitsplatz".
- Wählen Sie "imgSerCrop", klicken Sie dann auf "Import aus Workspace".
- Geben Sie die Einstellungen für die Erfassung Abbildungssystem. In der Box "Pixelgröße" geben Sie die projizierten Pixelgröße für die Imaging-System, mit der die Bildstapeln erworben werden. Für AQP3-EGFP, 0,111 verwendet. Geben Sie im Feld "Geben Sie die Zeit (en) zwischen den Bildern", 0,1150 für AQP3-EGFP verwendet.
- Klicken Sie auf "Wählen ROIs", geben Sie "1", klicken Sie auf OK und "ganze Bild zu verwenden."
- Klicken Sie auf "Do KIC Analyse" und klicken Sie auf Ja zu "unbeweglich Filterung" zu tun. Die Ergebnisse werden automatisch als Bilder zu öffnen.
- Minimieren Sie das Einstellungsfenster, minimieren die Zelle info window, und das Fenster Photophysik zu minimieren. Im Fenster Dynamik, überprüfen Sie, dass die Dynamik Plot zeigt eine lineare Anpassung der Daten auf eine Linie mit einer negativen Steigung bedeutet, dass die Datenpunkte korrelieren und freie Diffusion ausgegangen werden. Aufzeichnen des Diffusionskoeffizienten für den bestimmten Zeitverzögerung und K 2 Einstellungen (es ist nicht notwendig zu beachten die Standardabweichung der Anpassung). Die Datenpunkte in den k 2 Grundstücke müssen auf der ganzen Linie für die gegebene Zeitverzögerungen geclustert werden.
- Tick Feld "Speichern offenen Zahlen als Bilder", klicken Sie dann auf "Speichern offenen Zahlen als Bilder", um zu speichern Ergebnisdateien. Speichern Sie in einem neuen Ordner unter C: Users Dokumente AQP3diffusion. Klicken Sie auf "klare aktuellen Daten" und weiter mit der Analyse des nächsten Ernte.
3. Durchschnitts des berechneten Diffusionskoeffizient berechnet, um eine Übersicht über die analysierten Daten Get
- Geben Sie die einzelnen Diffusionskoeffizienten von jedem ROI in einem spreadsheet (stellen Sie sicher zu beachten die τ und k 2-Werte), verwenden Sie die Namen der Pflanzen, wie oben dargelegt.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Diffusionskoeffizienten und Standardabweichung mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.
- Führen Sie einen Kolmogorov-Smirnov-Test oder t-Test auf statistische Unterschiede zu bewerten mit einem 5%-Signifikanzniveau. Quantitave Vergleiche zwischen Zellen (beispielsweise gegen nicht-behandelten behandelt) hergestellt werden kann.
- Öffnen Sie die Tabelle Version der Diffusionsstücke, die durch die Analyse-Software für jede Kultur erzeugt wurde, und der Mittelwert der Daten für jeden Zustand für jede Zeitverzögerung. Erstellen Sie einen neuen gemittelten Diffusions Grundstück für die Präsentation in Papiere oder Präsentationen.
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Ergebnisse
Geeignete Bildstapeln mit KIC analysiert erwerben können unterschiedliche Mikroskopsystemen verwendet werden. Es ist möglich, Bildsequenzen aus einem Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop sowie ein TIRF-oder Spinning-Disk-Setup zu analysieren. Die Membran muss ohne großen bewegten Zellorganellen oder beweglichen Vesikel / Objekte flach sein. Dieser Beitrag stellt eine Zeitraffer-Bildfolge von AQP3 mit EGFP markiert live MDCK Zellen auf einer sich drehenden Scheibe Mikroskop mit Fokus auf der Plasmamembran mit einer Bildrate vo...
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Diskussion
Dieses Papier präsentiert eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Überblick darüber, wie die KIC Analyseverfahren gelten für Diffusionskoeffizienten von Mikroskopiebilder von Proteinen mit fluoreszierenden Proteinen markiert bestimmen. Die Analyse ist unabhängig von der Wahl Sonde mit einem sehr breiten Dynamikbereich bei der Etikettierung Dichte und kann somit auch Proteine mit Quantenpunkten sowie Farbstoffe und fluoreszierende Proteine wie EGFP angewendet werden.
Gültige Diffusionskoeff...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von einem Lundbeck Junior Group Leader-Stipendium für LNN unterstützt. PWW erkennt Zuschussfinanzierung Unterstützung von den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Wir danken auch den dänischen Molekulare Bildgebung in der Biophotonik Center an der University of Southern Denmark für den Zugriff auf Spinning-Disk-Mikroskopie.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 31600-083 | |
| FBS | Invitrogen | 10082147 | |
| Penicilin | Sigma | 13752 | |
| Kanamycin | Gibco | 15160070 | |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | |
| Phenolrot freies Medium | Gibco | 11880-028 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Apparat | |||
| Spinning Disk Mikroskop | Nikon | Ti Eclipse | |
| EMCCD Kamera | Andor | Ixon+ |
Referenzen
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
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- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
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