Dieses Papier bietet eine Schritt für Schritt Anleitung, um die Fluktuationsanalyse-Technik k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) zur Messung der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenz in lebenden Säugerzellen gekennzeichnet Plasmamembranproteinen.
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Methodenartikel
Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Lateral Diffusion und Kompartimentierung der Plasmamembran-Proteine sind fest in Zellen reguliert und damit das Studium dieser Prozesse werden neue Erkenntnisse zur Plasmamembran-Protein-Funktion und Regulation offenbaren. Kürzlich, k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) wurde entwickelt, um ein Routine-Messungen der Diffusionskoeffizienten direkt aus Bildern von fluoreszierend markierten Plasmamembran-Proteine, die von Photophysik Sonde eingeführt systematischer Fehler vermieden zu ermöglichen. Obwohl die theoretische Grundlage für die Analyse kompliziert ist, kann das Verfahren durch Nicht-Experten unter Verwendung einer frei verfügbaren Code zum Diffusionskoeffizienten von Proteinen messen implementiert werden. KIC berechnet eine Zeitkorrelationsfunktion von einem Fluoreszenzmikroskopie Bildstapel nach Fourier-Transformation jedes Bild, um gegenseitige (k-) Raum. Anschließend Kreismittelung, natürlichen Logarithmus-Transformation und lineare passt zu der Korrelationsfunktion ergibt sich die Diffusionskoeffizienten. DiesPapier bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Bildanalyse und Messung von Diffusionskoeffizienten über KIC.
Zuerst wird eine hohe Bildrate Bildsequenz eines fluoreszierend markierten Plasmamembranprotein mit einem Fluoreszenzmikroskop erfasst. Dann wird ein Bereich von Interesse (ROI) zu vermeiden intrazellulären Organellen, Vesikel bewegt oder hervorMembranBereiche ausgewählt. Die ROI-Stapel in einem frei verfügbaren Code importiert und mehreren definierten Parameter (siehe Abschnitt Methode) sind für die KIC Analyse gesetzt. Das Programm erzeugt dann einen "Hang Pisten" Handlung aus den k-Raum-Zeit-Korrelationsfunktionen und der Diffusionskoeffizient wird aus der Steigung des Grundstücks berechnet. Unten finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um die KIC Diffusionskoeffizient eines Membranproteins messen mit der renalen Wasserkanal Aquaporin-3 mit EGFP als kanonische Beispiel verschlagwortet.
Einleitung
Die vierdimensionale Raum-Zeit-Organisation und die seitliche Beweglichkeit der Plasmamembran-Proteine sind streng reguliert und können in Protein-Funktion, Aktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen eine Rolle spielen. Die laterale Diffusion von Plasmamembranproteinen, wird traditionell von der Berechnung Diffusionskoeffizienten für Einzelpartikel aus Zeitraffer-Bildgebung von Quantenpunkt-oder Farbstoff markierte Plasmamembran-Proteine 2-4 untersucht. Dieser Ansatz erfordert das Einführen eines extrazellulären Tag in der Plasmamembranprotein für Quantenpunkt oder Farbstoffmarkierung, die die Proteinfaltung und die Funktion beeinträchtigen können ....
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Protokoll
Erwerb von EGFP-markierte Proteine in der Plasmamembran für die KIC-Analyse kann auf einem Epifluoreszenzmikroskop, einem TIRF-Setup oder auf einem Spinning-Disk-Mikroskop eingestellt, um Bilder der Membran von Interesse erwerben geführt werden. Das Kamerapixelgröße sowie der Zeit zwischen Einzelbildern ist für die Analyse benötigt. Bildsequenzen von 100-1,200 Rahmen mit einer Rahmenrate von 4-30 Hz für die Analyse verwendet werden. Während der Erfassung, ist es wichtig, um die Membran scharf während der gesamten Dauer der Bilderzeugungs halten und sich auf einen Bruchteil der Flachmembran, in der die Fluoreszenz gleichmäßig verteilt. Umzug Vesikel, hervorstehende ....
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Ergebnisse
Geeignete Bildstapeln mit KIC analysiert erwerben können unterschiedliche Mikroskopsystemen verwendet werden. Es ist möglich, Bildsequenzen aus einem Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop sowie ein TIRF-oder Spinning-Disk-Setup zu analysieren. Die Membran muss ohne großen bewegten Zellorganellen oder beweglichen Vesikel / Objekte flach sein. Dieser Beitrag stellt eine Zeitraffer-Bildfolge von AQP3 mit EGFP markiert live MDCK Zellen auf einer sich drehenden Scheibe Mikroskop mit Fokus auf der Plasmamembran mit einer Bildrate vo.......
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Diskussion
Dieses Papier präsentiert eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Überblick darüber, wie die KIC Analyseverfahren gelten für Diffusionskoeffizienten von Mikroskopiebilder von Proteinen mit fluoreszierenden Proteinen markiert bestimmen. Die Analyse ist unabhängig von der Wahl Sonde mit einem sehr breiten Dynamikbereich bei der Etikettierung Dichte und kann somit auch Proteine mit Quantenpunkten sowie Farbstoffe und fluoreszierende Proteine wie EGFP angewendet werden.
Gültige Diffusionskoeff.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von einem Lundbeck Junior Group Leader-Stipendium für LNN unterstützt. PWW erkennt Zuschussfinanzierung Unterstützung von den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Wir danken auch den dänischen Molekulare Bildgebung in der Biophotonik Center an der University of Southern Denmark für den Zugriff auf Spinning-Disk-Mikroskopie.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 31600-083 | |
| FBS | Invitrogen | 10082147 | |
| Penicilin | Sigma | 13752 | |
| Kanamycin | Gibco | 15160070 | |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | |
| Phenolrot freies Medium | Gibco | 11880-028 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Apparat | |||
| Spinning Disk Mikroskop | Nikon | Ti Eclipse | |
| EMCCD Kamera | Andor | Ixon+ |
Referenzen
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K.
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Nachdrucke und Genehmigungen
