Reverse-Hefe-Zwei-Hybrid-System an Säugetier Nuclear Receptor Rückstände Identifizieren Sie, dass Interagieren Sie mit Liganden und / oder Antagonisten

Summary

Ketoconazol bindet und antagonisiert Pregnane X-Rezeptor (PXR) Aktivierung. Hefe-Hochdurchsatz-Screening von Mutanten PXR definieren eine einzigartige Region für Ketoconazol verbindlich. Diese Hefe-basierten genetischen Methode entdeckt neue Kernrezeptor-Interaktionen mit Liganden, die mit Oberflächenbindungsstellen zuordnen.

Abstract

Als ein entscheidender Regulator des Arzneimittelstoffwechsel und Entzündung, Pregnane X-Rezeptor (PXR), spielt eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie Krankheit Verknüpfung Stoffwechsel und Entzündungen (z. B. Fettleber) ^1,2. Es hat viele Fortschritte bei der Identifizierung von Liganden für PXR-Agonisten, jedoch gibt es begrenzte Beschreibungen arzneimittelähnlichen Antagonisten und ihre Bindungsstellen auf PXR ^3,4,5. Ein kritisches Hindernis war die Unfähigkeit, effizient reinigen Protein voller Länge für Strukturuntersuchungen mit Antagonisten obwohl PXR wurde 1998 kloniert und charakterisiert. Unser Labor entwickelt einen neuartigen Hochdurchsatz-Hefe-basierten Zwei-Hybrid-, ein Antagonist, Ketoconazol definieren, Bindungsreste auf PXR ^6. Unsere Methode umfasst das Erstellen Mutations Bibliotheken, die die Wirkung der einzelnen Mutationen auf die AF-2 Oberfläche des PXR erwartet, dass mit Ketoconazol interagieren zu retten wäre. Rettung oder "Gain-of-function" second Mutationen vorgenommen, so daß Rückschlüsse auf die genetische Interaktion von Ketoconazol und der Oberflächenrest (e) auf PXR realisierbar werden. So entwickelten wir einen hohen Durchsatz Hefe-Zwei-Hybrid-Bildschirm des PXR Mutanten die Interaktion mit seinen Co-Aktivator, SRC-1. Mit diesem Ansatz, bei dem die Hefe wurde modifiziert, um die Untersuchung des Antimykotikums, Ketoconazol aufnehmen, könnten wir bestimmte Mutationen auf PXR in Klonen nicht auf Ketoconazol binden angereichert demonstrieren. Durch die umgekehrte Logik schließen wir, dass die Original-Reste sind direkte Interaktion Reste mit Ketoconazol. Dieser Test stellt eine neuartige, gefügig genetischen Test zum Screening auf-Antagonist-Bindungsstellen auf Kernrezeptor-Oberflächen. Dieser Assay kann zu jedem Medikament unabhängig von seiner zytotoxischen Potential, Hefe sowie zur zellulären Protein (e), die unter Verwendung von Standardstrukturbiologie oder Proteom-basierte Verfahren nicht untersucht werden können, angewendet werden. Mögliche Fallstricke beinhalten Interpretation der Daten (komplementäre Methoden sinnvoll), Zuverlässigkeitrung auf einzelne Y2H Verfahren, Know-how im Umgang mit Hefe-oder Durchführen Hefe-Zwei-Hybrid-Assays und Assay-Optimierung.

Introduction

Das Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Assay wird häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu entdecken und vor kurzem zur Entdeckung von neuen kleinen Molekülen, die Protein-Protein-Wechselwirkung Komplexe ^{7, 8, 9, 10, 11} zu stören. Die herkömmlichen Ansätze dieses Tests, für die Wirkstoffforschung oder "Treffer" verwendet werden, nicht für die Detektion von allosterischen Interaktion Rückstände von Chemikalien, Verbindungen, die in Protein-Protein-Oberflächen, ermöglichen, dass, wenn noch verändert interagieren und ermöglichen eine Abfrage der geänderten Reste ¹¹ . Tatsächlich ist ein solches Verfahren (e), wenn möglich, zu entwickeln, würde ....

Protocol

1. Bau von PXR und SRC-1-Fusionen in Hefe-Vektoren

1. PCR-Amplifikation der Menschen PXR LBD (107-434 Aminosäuren) und Menschen SRC-1 voller Länge (1 bis 1401 Aminosäuren).
   1. Verwenden pSG5-hPXR Plasmid ⁸ als PXR LBD-Vorlage, verwenden Sie pCMX SRC1-Plasmid als SRC-1-Vorlagen.
   2. Tauwetter SuperMix PCR, DNA-Template und Primer (siehe Materialien), halten Sie sie auf Eis.
   3. In 0,25 ug / ul ul DNA-Vorlage 1, 10 mM Primerpaare jeweils 2 ul, 45 ul PCR SuperMix und fügen H ₂ O auf ein Gesamtvolumen von 50 ul zu bringen.
   4. Eingestellt PCR bei einem Zyklus von 94 ° C für 2 min, 20 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 55 °....

Results

Wir führten einen Test, um zu sehen, ob wir ein farbmetrische Auslesen der Vereinigung von PXR und Steroid-Rezeptor Co-Aktivator-1 (SRC-1) zu erkennen. Da Hefe signifikante Sterol-Produktion, ist früher gezeigt worden, dass die lacZ-Expression in Hefe kann ohne die Notwendigkeit für zusätzliche exogene Liganden induziert werden. Wir fanden, dass lacZ-Expression (blaue Kolonien) ist auch in den Hefestamm mit PXR und SRC-1 transformiert induziert, jedoch gibt es keine Induktion des LacZ-Expression (weiße Kolonien) in Hefe.......

Discussion

In unserer modifizierten Y2H-Assay haben wir wichtige Reste für Ketoconazol Interaktionen auf PXR ⁶ identifiziert. Seit SRC-1 ist ein Co-Aktivator (und wurde in die pGADNot kloniert), haben wir auch getestet, ob SRC-1 könnte lacZ-Expression, wenn sie in der PSH-Vektorsystem kloniert aktivieren und ob dies die Aktivierungsprofil ändern und / oder auf die Undichtigkeit die Hefe-Zwei-Hybrid-Assay. Mit unserem neu gestalteten Plasmide wir in ERG3 Δ / Δ ERG11 Hefe-Zwei-Hybrid-geführt Assays. Nach.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hefestamm CTY10-5D erg3δ/erg11δ			Laborhefe CTY10-5d wurde doppelt ausgeschaltet ERG3 und ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) Gene6 .
YPD Wachstumsmedium	BD Biosciences	630409
Difco Hefe Stickstoffbase (YNB) ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat	BD Biosciences	233520
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
CSM-HIS/-LEU Complete Supplement Mixture	MP Biomedicals	4250-412
ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranosid).	Sigma-Aldrich	N1127
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Luria Bouillon (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Fisher	BP-1615
Beschallte Lachsspermien DNA gekocht (10 mg/ml)	Life Technology	156-017
Ampicillin	Acros Organics	61177
Ketoconazol	Sigma-Aldrich	K1003
N,N-Dimethylformamid	Acros Organics	326871000
Lithiumacetat	Sigma-Aldrich	L4158
50% PEG-3350 Lösung, filtersterilisiert	Sigma-Aldrich	P-3640
Nitrocellulose Membran	Whatman	10402091
10 cm Petrischale	Fisher	875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'unser	Labor		PXR LBD Forward Primer für pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'unser	Labor		PXR LBD Reverse Primer für pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'unser	Labor		SRC-1 Forward Primer für pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'unser	Labor		SRC-1 Reverse Primer für pGADNOT
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
BamHI	unser Labor	R0136
SalI	unser Labor	R0138
NotI	unser Labor	R0189