Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle

Zusammenfassung

Ein quantitatives Verfahren zur spontanen Migration von Zellen in einem eindimensionalen beschränkt Mikro studieren beschrieben. Dieses Verfahren nutzt den Vorteil der mikrogefertigten Kanälen und kann verwendet werden, um die Migration der Vielzahl von Zellen unter verschiedenen Bedingungen in einzelnen Experimenten zu untersuchen.

Zusammenfassung

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Zellwanderung unter Einschluss in einer Dimension. Es basiert auf der Verwendung von mikrogefertigten Kanälen, die einen polarisierten Phänotyp Zellen durch physikalische Beschränkungen auferlegen basiert. Einmal in Kanäle, Zellen haben nur zwei Möglichkeiten: vorwärts oder rückwärts zu bewegen. Dies vereinfacht die Migration in dem Richtungs beschränkt erleichtert die automatische Verfolgung von Zellen und die Gewinnung von quantitativen Parameter für Zellbewegung beschreiben. Diese Parameter umfassen Zellgeschwindigkeit, Richtungsänderungen, und Pausen während der Bewegung. Mikrokanäle sind auch bei der Verwendung von Fluoreszenzmarkern kompatibel und eignen sich daher zur Lokalisation von intrazellulären Organellen und Strukturen während der Zellmigration bei hoher Auflösung zu untersuchen. Schließlich kann die Oberfläche der Kanäle mit verschiedenen Substraten funktionalisiert werden, wodurch die Kontrolle der Klebeeigenschaften der Kanäle oder der Untersuchung von Haptotaxis. Zusammenfassend ist das System here beschrieben soll die Migration großer Zellzahlen unter Bedingungen, bei denen sowohl die Geometrie und die biochemische Beschaffenheit der Umgebung gesteuert analysieren, die Erleichterung der Normalisierung und Reproduzierbarkeit der unabhängigen Experimenten.

Einleitung

Migration ist eine komplexe zelluläre Funktion, die wichtig für viele physiologische Prozesse in mehrzelligen Organismen, einschließlich der Entwicklung, Immunreaktionen und Geweberegeneration. Darüber hinaus können bestimmte pathologische Situationen wie der Tumorinvasion und Metastasenbildung beruhen auf Zellmotilität ^1. Aus diesen Gründen hat die Zellwanderung zu einem wichtigen Feld der Studie im Rahmen der Grundlagen-und translationalen Forschung. In vivo werden die meisten Gewebe von einem reichen extrazellulären Matrix und hohe Zelldichte aus. Zellmigration daher unter physiologischen Bedingungen tritt in einer komplexen Umgebung beschränkt. Klassisch, wahrscheinlich aus historischen Gründen und technischen Grenzen, Zellmigration hat in flachen 2D-Systemen, die sich nicht fortpflanzen viele der Umgebungseigenschaften in Geweben, wie der Entbindung gefunden sucht. Außerdem Faktoren wie Zelladhäsion, die für Beweglichkeit in 2D sind, wurden kürzlich zeigte nicht necessa seinRily für die Migration in vivo oder in Gelen erforderlich, was darauf hindeutet, dass die Mechanismen, die Zellbewegung in 2D und in anderen Umgebungen herrschen verschieden sind ^2. Verschiedene Systeme wurden entwickelt, um die komplexen Eigenschaften der Gewebe, die bekanntesten sind Kollagengele, die an rekapituliert die Eigenschaften der extrazellulären Matrix ³ zielen imitieren. Hier schlagen wir Mikrokanäle als einfache ergänzende Methode, die die Untersuchung der Zellmigration in einer Dimension unter einer geschlossenen Umgebung ermöglicht.

In diesem System Zellen wandern entlang Mikrokanäle, in die sie spontan ein. Wandernden Zellen erwerben dann die Form der Kanäle, die Annahme eine röhrenförmige Geometrie, die am ehesten verstärkt ihre Polarität. Die lineare Bewegung der Zellen in den Kanälen ermöglicht die automatische Tracking-Zelle und die Gewinnung von quantitativen Parameter aus Experimenten. Aus technischer Sicht ist dieses System einfach und flexibel. Die coating der Kanalwände kann manipuliert werden, die Größe und die Form der Kanäle angepasst werden kann, und eine große Anzahl von Zellen kann in Einzelexperimenten untersucht werden. Dieses System kann auch skaliert-up werden bis mittleren Bereich Bildschirm Analyse von Molekülen in Zellbewegung beteiligt durchzuführen. Das hier beschriebene Protokoll wurde unter Verwendung von dendritischen Zellen (DC) als ein zelluläres Modell standardisiert. Diese Zellen sind der Schlüssel für das Immunsystem, wie sie bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von spezifischen Immunantworten beteiligt ^4. In vitro DCs wurde gezeigt, spontan in engen Umgebungen zu wandern und sind daher ein gutes Modell, um die Zellbeweglichkeit in Mikro ^5,6 studieren . Wichtiger ist, kann das System erweitert werden, um die Migration von einem anderen beweglichen Zelltyp als T-Lymphozyten, Neutrophile, oder Tumorzellen ^7-9 analysieren.

Protokoll

Wichtiger Hinweis: Dieses Protokoll geht davon aus, dass die Form, die die Form für die gewünschte Mikrokanälen wurde bereits gemacht. Weitere Informationen über die Herstellung der Form wurde bereits veröffentlicht ^10. Dieses Protokoll setzt voraus, dass Knochenmark-DCs Kultur bekannt ist.

1. Chipfertigungs

1. Mix PDMS Öl und Härter in einem Gewichtsverhältnis 10.01 Uhr in einem Plastikbecher. Das Vermischen der beiden Verbindungen gründlich.
2. Werfen Sie die Mischung über den Formlagermikrokanäle. Die Gesamthöhe muss zwischen 0,5-1 cm sein.
3. Luftblasen in einem Vakuumgefäß Glocke während 1 Stunde.
4. Harden PDMS in der Form durch Anordnen des letzteren in einem Ofen für 2 Stunden bei 65 ° C.
5. Sobald das PDMS ist bei Raumtemperatur ein großes Stück geschnitten, auf der Struktur mit einer chirurgischen Klinge und ziehen es aus der Form (Fig. 1A).
6. Löcher bohren, wo Zellen injiziert werden (typischerweise 2 mm) und die Größe des PDMSmit einem chirurgischen Messer, um die Größe zu Glasbodenschalen, in denen Migration bewertet werden (Abbildung 1B) passen. Bevor Sie fortfahren, entfernen Reststaub aus der Schüssel mit Linsenreinigungspapier. Dies begünstigt die Bindung von PDMS in Schritt 1.10 beschrieben Glas.
7. Reinigen Sie die Größe verändert PDMS-Chip enthält die Kanäle durch Festhalten und Peeling Klebeband auf den Struktur Seiten.
8. Beschallen der PDMS-Stücke 30 Sekunden in 70% Ethanol, um Staub und kleine PDMS Partikel zu entfernen. Trocknen Sie sie anschließend schnell durch Einblasen von sauberer Luft.
9. Aktivieren Sie die PDMS (Strukturen oben) und Kulturschalen von Luft (oder Sauerstoff) Plasma-Behandlung während 30 Sekunden bei 300 Torr.
10. Legen Sie beide aktivierten Oberflächen in Kontakt, um die PDMS dauerhaft halten Sie sich an das Substrat. Falls erforderlich, verwenden Sie Metallzange, um oben auf dem PDMS leicht drücken, um den Kontakt zwischen dem Polymer und dem Glas der Schale (Abbildung 1C) zu zwingen.
11. Inkubieren der Chip in dem Ofen bei 65 ° C for 1 Stunde die Bindung zu stärken.

2. Beschichtung von Mikrokanälen

1. Aktivieren Sie die ganze Struktur, die durch Luft-Plasma bei 300 Torr für 1 min. Dadurch wird der Eintritt von Flüssigkeit in die Kanäle in dem nächsten Schritt zu fördern.
2. Füllen Sie schnell die Eintrittslöcher des Chips mit Fibronektin bei 10 ug / ml in Wasser. Andere Substrate, wie PEG verwendet werden, um die Zellhaftung an den Kanalwänden zu modifizieren. Achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit durch die gesamte Struktur ausbreitet. Dies kann leicht mit dem Auge unter normalen Licht oder mit einem normalen Hellfeld-Mikroskop überprüft werden.
   Hinweis: in sehr kleinen Strukturen, in denen die Diffusion härter Eintritt von Flüssigkeit in den Kanälen kann durch Anordnen der Struktur in einem Vakuumgefäß Glocke während mindestens 15 Minuten gezwungen. Um die Effizienz des Beschichtungs fluoreszierende Substrate verwendet werden (Fig. 2) zu überprüfen.
3. Inkubiere 1 h bei Raumtemperatur, um die Adsorption von Fibronektin oder andere Beschichtungs subst ermöglichenGeschwindigkeit an den Wänden der Kanäle.
4. Waschen Sie die Strukturen 3x mit PBS, um die nicht gebundenen Substrat zu entfernen.
5. Nach dem Waschen des Protokolls Nr. 3 fahren oder lagern Sie den Chip bei 4 ° C für eine spätere Verwendung (24 Stunden maximal).

3. Zell Loading

1. Entfernen Sie die PBS von der Platte und füllen das Mikrosystem mit Zellmedium. Lassen Inkubation für 1 Stunde, um die Kanäle mit dem Medium zu sättigen.
   HINWEIS: Für Experimente mit Drogen wie molekularen Inhibitoren, ist es ratsam, die Kanäle mit einem Medium, das Medikament in der richtigen Konzentration vorinkubiert. Darüber hinaus neigen einige Medikamente in der PDMS-Struktur, die die effektive Konzentration reduziert lösen. Einige Lösungen vorgeschlagen worden, um dieses Problem zu ^11-12 entgegenzuwirken.
2. Entfernen und wieder schwimm DCs halb adhärenten Zellen durch Spülen mit Kulturmedium. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
   HINWEIS: Für die Zellkern-Bildgebung, eine Hoechst 33342-Färbung kann vorher durch dadurch erreicht werden,cubating 2 x 10 ⁶ Zellen für 30 min mit dem Farbstoff bei 200 ng / ml in vollständigem Medium. Zweimal waschen durch Zentrifugation, um überschüssige Farbstoff bevor das Protokoll zu entfernen.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g während 5 min (Zeit und Geschwindigkeit kann unterschiedlich sein, je nach Zelltyp) und entsorgen Sie das Medium. Verdünnt das Pellet eine Konzentration von 20 x 10 ⁶ Zellen / ml zu erreichen.
4. Entfernen Sie das überschüssige Medium von der Platte und leeren die Eintrittslöcher in der PDMS-Struktur mit einer Mikropipette. Füllen Sie die Einträge mit 5 ul Zelllösung, einen Betrag von 1 x 10 ⁵ Zellen in jedem Eingangsloch zu erreichen.
   HINWEIS: hohe Zelldichte erforderlich, um den Kontakt der Zellen mit den Kanälen zu begünstigen. Niedrige Zelldichte kann in geringen Anzahl von Zellen in Kanälen und Ausfall des Experiments führen.
5. Inkubieren des Mikrochips für 30 min bei 37 ° C im Brutschrank. 2 ml Vollmedium dem Experiment Schale.
   HINWEIS: Die ganze Struktur PDMS muss be um das Trocknen der Zellen während des Experiments zu vermeiden bedeckt. Wenn 2 ml ist nicht genug, fügen Sie mehr Medium, um die PDMS-Struktur vollständig zu bedecken.

4. Imaging

1. Die externe Bodenfläche der Gerichte mit Linsenreinigungstuch reinigen, bevor die Platten unter dem Mikroskop.
2. Um die Migration in große Anzahl von Zellen zu analysieren, verwenden Sie 10-facher Vergrößerung und Weitfeldbeleuchtung in einem CO ₂ und Temperatur ausgestattet Video-Mikroskop (Abbildung 3). Um die Zellverfolgung zu erleichtern, kann der Hoechst-Färbung und UV-Licht verwendet werden (siehe Schritt 3.2). Migration kann mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, um eine höhere Auflösung zellulärer Strukturen während der Migration erhalten auch analysiert.
3. Für Zeitraffer-Mikroskopie bei 10X, wählen Sie eine Zeit-Frequenz entsprechend der erwarteten Zellzahl (typischerweise 2 min für die Migration dendritischer Zellen mit einer Geschwindigkeit von 5 um / min).
   Hinweis: Die hier beschriebenen Protokoll funktioniert not zählen die Analyse der Zellmigration Parameter. Ein paar Punkte sind in der Diskussion, um die Leser auf, wie Sie vorgehen, um Informationen von Zeitraffer-Filmen extrahieren beraten aufgelistet.

Ergebnisse

In jedem Experiment wird die Oberfläche des PDMS mit einem Molekül, das Interesse der Studie geeignet beschichtet. 2 zeigt Kanäle mit einem fluoreszierenden Molekül, PLL-g-PEG beschichtete vor und nach dem Waschen (Schritt 2.4). Ein solches Experiment ermöglicht die Steuerung der Homogenität der Beschichtung in den Kanälen.

Nach Beladung der Zellen können Videomikroskopie durchgeführt, um Zellmigration zu folgen. Fig. 3A zeigt ein Beispiel eines DC Migration...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Gerät von Mikrokanälen zusammengesetzt als eine Methode, um die Migrationseigenschaften der großen Anzahl von Zellen in einzelnen Experimenten zu untersuchen. Dieses experimentelle System ahmt die begrenzten Umweltauflagen im Gewebe durch endogene wandernden Zellen gefunden. Jedoch durch die Migration zwingt in einer einzigen Dimension, ermöglicht es die automatische Tracking-Zelle und die Gewinnung von Messgrößen (Abbildung 5). Wir zeigen auch, dass unser Gerät ist mit Fluoresz...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polydimethylsiloxan (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Packung mit 90 % Silikonbasis und 10 % Härter
Kernprobenschneider	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Durchmesser 2,5 mm
Glasbodenschale	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultraschallreiniger	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC 32 G	Für kleine Proben (35 Schalen). Eine größere Version ist auch erhältlich
: Fibronektin aus Rinderplasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysin transplantiert PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254