ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen Engineered Mit Oberflächen initiierte Versammlung

Summary

Eine Methode, um komplexe Nanofasern und Nanostrukturen aus einzelnen oder mehreren extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, wird beschrieben. Diese Methode verwendet Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu frei stehenden Materialien auf Proteinbasis mit abstimmbaren Zusammensetzung und Architektur für den Einsatz in einer Vielzahl von Gewebe-und Biotechnologie-Anwendungen zu erstellen.

Abstract

Die extrazelluläre Matrix (ECM) in Geweben synthetisiert und von Zellen zusammengesetzt, um ein 3D fibrilläre Proteinnetzwerk mit streng reguliert Faserdurchmesser, Zusammensetzung und Organisation bilden. Neben der Bereitstellung von Strukturförderung, die physikalischen und chemischen Eigenschaften der ECM spielen eine wichtige Rolle in mehrere zelluläre Prozesse einschließlich Adhäsion, Differenzierung und Apoptose. In vivo wird die ECM indem kryptischen Selbstmontage (Fibrillogenese) Websites innerhalb von Proteinen zusammengebaut . Dieses Verfahren unterscheidet sich für verschiedene Proteine, sondern Fibronectin (FN) Fibrillogenese ist gut charakterisiert und dient als Modellsystem für die zellvermittelte ECM Anordnung. Genauer gesagt, Zellen zu verwenden, Integrin-Rezeptoren auf der Zellmembran FN Dimere und Aktomyosin generierten Kontraktionskräfte zu binden, um Bindungsstellen für den Zusammenbau zu entfalten und unlöslichen Fasern freizulegen. Dieser Rezeptor-vermittelte Verfahren ermöglicht Zellen aus der Zellgewebe sca versammeln und organisieren die ECMles. Hier präsentieren wir eine Methode bezeichnet oberflächeninitiierte Montage (SIA), die Zell-vermittelte Matrixanordnung rekapituliert Verwendung von Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu ECM-Proteine ​​entfalten und montieren sie in unlösliche Fasern. Zunächst werden ECM-Proteine ​​auf eine hydrophobe Polydimethylsiloxan (PDMS) Oberfläche, wo sie teilweise zu denaturieren (breiten) und setzen kryptische Bindungsdomänen adsorbiert. Die entfalteten Proteine ​​werden dann in wohldefinierten Mikro-und Nanostrukturen durch Mikrokontaktdruck auf eine thermisch ansprechende Poly (N-isopropylacrylamid) (PIPAAm) Oberfläche übertragen. Thermisch ausgelöste Auflösung des PIPAAm führt zur Endmontage und Freisetzung von ECM-Protein unlöslich Nanofasern oder Nanostrukturen mit definierter Geometrie. Complex-Architekturen sind durch Ingenieur definierten Muster auf den PDMS-Stempel für Mikrokontakt-Drucken verwendet werden kann. Neben FN kann die SIA-Prozess mit Laminin, Fibrinogen verwendet werden und Kollagene vom Typ I und IV der Mehrkomponenten-Nano ECM erstellenturen. Somit SIA kann zur ECM-Materialien auf Proteinbasis mit genauer Kontrolle der Proteinzusammensetzung, Fasergeometrie und Gerüst-Architektur, um die Struktur und Zusammensetzung der ECM in vivo gentechnisch zu rekapitulieren.

Introduction

Die extrazelluläre Matrix (ECM) in Geweben aus multifunktionellen Proteine ​​in physikalischen und chemischen Regulation mehrerer Zellprozesse einschließlich Adhäsion, Proliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt ^1-3 besteht. Das ECM synthetisiert, zusammengebaut und von Zellen organisiert und die Proteinbestand Fibrillen haben einzigartige Zusammensetzungen, Fasergröße, Geometrien und Architekturen, die mit miteinander verbundenen Gewebetyps und des Entwicklungsstadiums variieren. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass die ECM lehr Hinweise liefern, um Zellen zu Geweben entwickelt ⁴ zu bilden, was darauf hindeutet, dass die ECM rekapituliert in Bezug auf die Zusammensetzung und Struktur könnte die Entwicklung biomimetischer Materialien für Tissue Engineering und Biotechnologie-Anwendungen ermöglichen zu führen.

Eine Anzahl von Herstellungsverfahren entwickelt worden, um polymere Gerüste, die Aspekte der ECM in Gewebe nachahmen kann Ingenieur. Zum Beispiel Elektrospinning-und Phasen separation haben sowohl die Fähigkeit gezeigt porösen Matrices aus Fasern mit einem Durchmesser von zehn Mikrometern bis einigen zehn Nanometern ^5-7 bilden. Beide Techniken haben auch gezeigt, daß hochporöse Matrizen von Nanofasern Zelladhäsion und Infiltration in das Gerüst ⁸ unterstützt. Jedoch sind diese Ansätze in den Fasergeometrien möglich, Orientierungen und 3D-Architekturen, die erzeugt werden kann begrenzt. Das Elektro erzeugt typischerweise Gerüste entweder mit zufällig orientierten oder stark ausgerichteten Fasern wohinPhasenTrennung erzeugt Gerüste mit zufällig orientierten Fasern. Es gibt auch Einschränkungen hinsichtlich der Materialien, mit Forschern typischerweise unter Verwendung von synthetischen Polymeren, wie Poly (ε-caprolacton) ⁸ und Poly (milch-co-glykolsäure) ^9, die nachfolgend mit ECM-Proteinen beschichtet sind, um die Zelladhäsion zu fördern. Natürliche Biopolymere werden ebenfalls verwendet, einschließlich Kollagen Typ I ^{10, 11} Gelatine, Fibrinogen ^12,Chitosan ^{13, 14} und Seide, aber nur einen kleinen Teil der Proteine ​​in nativem Gewebe gefunden. Die meisten Gewebe enthalten eine größere Milieu von ECM-Proteinen und Polysacchariden, einschließlich Fibronectin (FN), Laminin (LN), Kollagen Typ IV und Hyaluronsäure, die schwierig oder unmöglich zu Nanofasern unter Verwendung von existierenden Verfahren herzustellen sind.

Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir unsere Forschung auf die Art und Weise imitiert Zellen synthetisieren, montieren und organisieren ECM-Protein Fibrillen in ihrer Umgebung konzentriert. Während die spezifische Fibrillogenese Verfahren variiert für verschiedene ECM-Proteine, typischerweise eine Konformationsänderung im ECM-Protein-Moleküls wird durch eine enzymatische oder Rezeptor-vermittelte Wechselwirkung, die kryptische Selbstmontagestellen macht ausgelöst. Hier verwenden wir FN als Modellsystem, um die Fibrillogenese Prozess besser zu verstehen. Kurz gesagt, FN Homodimere an Integrin-Rezeptoren auf der Zelloberfläche über die RGD-Aminosäuresequenz in der 10. Typ II bindenIch wiederhole Einheit. Einmal gebunden, bewegen sich die Integrine auseinander Actomyosin über Kontraktion und entfalten die FN-Dimere kryptische Selbstmontagestellen freizulegen. Die Exposition dieser FN-FN-Bindungsstellen ermöglicht es den FN-Dimere nach rechts auf der Zelloberfläche ¹⁵ in eine unlösliche Fibrillen zusammenzubauen. Work in zellfreien Systemen hat gezeigt, dass kryptische FN-FN-Bindungsstellen durch Entfaltung mit Vergällungsmittel ¹⁶ oder Oberflächenspannung bei einem Luft-Flüssigkeit-Feststoff-Schnittstelle ^17-19 offenbart werden. Jedoch werden die FN-Fasern, die durch diese Techniken auf bestimmte Faser Größen und Geometrien beschränkt und sind typischerweise an eine Oberfläche gebunden.

Hier beschreiben wir einen Ansatz bezeichnet oberflächeninitiierte Montage (SIA) ^20, die diese Einschränkungen überwindet durch die Verwendung von Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu freistehenden unlöslichen Nanofasern, nanofabrics (2D-Pläne) und anderen Nanostrukturen von einzelnen oder mehreren ECM-Proteinen (Abbildung 1 erstellen ). In diesem process, werden ECM-Proteine ​​aus einem kompakten, kugelförmigen Konformation in Lösung adsorbiert und teilweise denaturiert (ungefaltet) auf einem gemusterten hydrophoben Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel. Die ECM-Proteine ​​werden dann in diesem Zustand auf einen thermisch ansprechenden Poly (N-isopropylacrylamid) (PIPAAm) Oberfläche durch Mikrokontaktdruck ²² übertragen. Wenn es mit 40 ° C Wasser hydratisiert die PIPAAm bleibt eine feste, aber wenn bis 32 ° C abgekühlt, es durch eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST), wo sie hydrophil wird spielt quillt mit Wasser und dann löst sich, die Freigabe der ECM-Nanostrukturen zusammengesetzt aus der die Oberfläche. Die SIA-Methode ermöglicht die Kontrolle über die Dimensionen mit Nanometer-Präzision. Durch die Steuerung Schlüsselparameter wie Zusammensetzung, Fasergeometrie und Architektur ist es möglich, viele Eigenschaften der ECM in vivo gefunden zu rekapitulieren und zu fortgeschrittenen Gerüste für Tissue Engineering und Biotechnologie-Anwendungen zu entwickeln.

Protocol

1. Herstellung von Master-Mold mittels Photolithographie

1. Die ECM-Protein-Nanofasern, nanofabrics und Nanostrukturen hergestellt werden, werden zunächst mit Hilfe von Computer Aided Design (CAD) Software konzipiert. Diese CAD-Datei wird dann auf eine Photomaske übertragen. Die Art der Photomaske auf die Auflösung der Funktionen hängen; mit einer Transparenz-basierte Photomaske ausreichend für Spielgrößen bis zu ~ 10 um. Kleinere Funktionen <10 um eine Chrom auf Glasphotomaske erforderlich. Alle Nanofasern und Nanostrukturen hier vorgestellten wurden mit einem Transparenz-basierte Photomaske nicht lateralen Abmessungen hergestellt und waren damit im Nanometer-Maßstab in der Dicke aber.
   Hinweis: Es ist wichtig, zu unterscheiden, welche Regionen der Photomaske wird dunkel sein (verhindert UV Licht passieren) und die transparent sein wird (lassen UV-Licht durchlässt), da dies, zusammen mit der Art des Fotolacks (positiv oder negativ) , wird die endgültige Topographie des Master-Form diktieren.
2. Zur Herstellung der Master-Form beginnen, dehydrieren ein 4 "Silizium-Wafer, indem Sie es auf einer Heizplatte auf 150 ° C für 15 min eingestellt.
3. Zentrieren des Wafers auf dem Vakuumspannfutter einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung. Gießen SU8-2015 negativen Photoresist auf die Mitte des Wafers und weiterhin Gießen in konzentrischen Kreisen bis zu zwei Drittel des Wafers bedeckt.
   Hinweis: beim Gießen, um die Bildung von Blasen zu minimieren Halten Sie die Flasche SU8 Nähe des Wafers.
4. Programmieren Sie die Spincoaters wie folgt:
   • Spread-Zyklus: 500 min bei einer Beschleunigung von 100 U / s für 10 Sekunden.
   • Schleudern: 4000 UpM mit einer Beschleunigung von 100 U / s für 30 Sekunden.
   Anmerkung: Diese Spincoating Rezept wird eine Photoresistschicht ist, die ~ 10 &mgr; m Dicke zu bilden. Durch Änderung der Spinngeschwindigkeit oder der SU8-Formulierung kann die Dicke eingestellt werden.
5. Weiche backen den Wafer, indem Sie es auf einer Heizplatte auf 95 ° C für 3 min eingestellt.
6. Setzen Sie die Scheibe mit UV-Licht durchdie Fotomaske für eine Gesamtdosis von 140 mJ / cm ^2.
   Hinweis: SU8 ist ein Negativlack also Regionen, in denen UV-Licht ist in der Lage, durch die Photomaske übergeben wird nach der Entwicklung bleiben und hob Features auf der Master-Form.
7. Nach der Belichtung des Wafers, indem Sie es auf einer Heizplatte auf 95 ° C für 4 min eingestellt.
8. Entwickeln Sie die Wafer, indem es in SU8 Entwickler für 3 min. Nach 3 min, spülen Sie die Scheibe mit Isopropyl-Alkohol. Wenn ein weißer Film wird während des Spülvorgangs erzeugt wird, wird der Wafer nicht vollständig entwickelt und es sollte wieder in den Entwickler für weitere 30 Sekunden gesetzt werden. Spülen wieder mit Isopropyl-Alkohol. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis ein weißer Film nicht während der Isopropylalkohol gespült bilden.
9. Trocknen der Wafer in einem Stickstoffstrom und in eine 150 mm Petrischale vor Staub zu schützen.

2. Herstellen der PDMS-Stempel

1. Bereiten Sie die PDMS-Präpolymer durch die Kombination der Elastomer Basis und Härter in einem10.01 w / w-Verhältnis. Typischerweise 80 g Base und 8 g Härter verwendet werden, um sicherzustellen, dass es ausreichend ist, um das PDMS-Vorlagenform in einer 1 cm dicken Schicht bedecken.
2. Mix und entgast die PDMS mit einer zentripetalen Mischpult an den folgenden Einstellungen:
   • Mix: 2.000 rpm für 2 min
   • Degas: 2.000 rpm für 2 min.
3. Wenn ein Mischer ist nicht verfügbar, die PDMS-mischen von Hand für 10 min mit einer 10 ml serologische Pipette. Entgasen der Mischung, indem sie in einem Vakuum-Exsikkator für 30 Minuten, um Blasen zu entfernen.
4. Gießen Sie genug PDMS Prepolymer die Master-Form (gemusterten Silizium-Wafer), eine 1 cm dicke Schicht zu bilden. Härten des PDMS durch Backen bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei Raumtemperatur für 48 Stunden.
5. Einmal ausgehärtet, können die Regionen, die die Muster ausgeschnitten werden, um die PDMS-Stempel zu bilden. Um die Funktion zu Seite, von der Rückseite der PDMS-Stempel unterscheiden, schneiden eine Kerbe von einer der Ecken auf der Rückseite der Briefmarke.

3. Mikrokontakt-PrInting von ECM-Patterns

1. Rein 25 mm Durchmesser Glasdeckgläser durch Beschallung in 95% Ethanol für 1 Stunde und dann in einem 65 ° C Ofen trocknen.
2. Vorbereitung der PIPAAm durch Auflösen PIPAAm in 1-Butanol bei einer Konzentration von 10% (w / v, typischerweise 1 g in 10 ml).
3. Mitte ein Deckglas auf der Vakuumspannvorrichtung und der Spincoater Pipette 200 ul der Lösung PIPAAm so dass die gesamte Glasoberfläche bedeckt.
4. Schleuderbeschichtung des Deckglases bei 6.000 rpm für 1 min.
5. Reinigen Sie die PDMS-Stempel durch Beschallung in 50% Ethanol für 30 min und dann unter einem Stickstoffstrom trocken.
   Hinweis: Die Trocknung und die nachfolgenden Schritte sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden, um die Sterilität für Anwendungen, bei denen die ECM-Nanostrukturen wird mit Zellen verwendet werden, beizubehalten.
6. Beschichten der strukturierten Oberfläche jeder PDMS-Stempel mit 200 &mgr; l der Proteinlösung, typischerweise 50 ug / ml in sterilem destilliertem Wasser für FN. Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.
   Hinweis: ThBeschichtungsvolumen ist für eine 1,5 cm ² PDMS-Stempel und müssen je nach Größe der PDMS-Stempel, der verwendet ECM-Protein, und die Konzentration des ECM-Protein in Lösung eingestellt werden.
7. Waschen Sie die PDMS-Stempel in destilliertem Wasser, um überschüssiges Protein und gründlich trocknen unter einem Stickstoffstrom entfernen.
   Hinweis: Jeder Wasser gelassen auf der Briefmarke wird die vorzeitige Auflösung des PIPAAm Beschichtung auf dem Deckglas auslösen und richtige Proteintransfer zu verhindern.
8. Für sterile Herstellung, legen Sie die PIPAAm-beschichtete Deckgläser in einer geschlossenen Petrischale und sterilisieren mit UV-Exposition, 45 min unter der UV-Licht in einem biologischen Sicherheitsschrank ist ausreichend. Dieser Schritt kann die Sterilität nicht erforderlich weggelassen.
9. Führen Mikrokontaktdruck, indem Sie die Funktion Seite der PDMS-Stempel in Kontakt mit der PIPAAm-beschichtete Deckglas. Wenn erforderlich, Pinzette leicht auf der Rückseite der Briefmarken tippen, um Luftblasen zu entfernen und sicherzustellen, gleichmäßigen Kontakt.
10. Nach 5 kmn, ziehen Sie die PDMS-Stempel aus dem Deckglas.
11. Auf dieser Stufe können weitere ECM-Proteine ​​strukturiert werden, um komplexere und Mehrkomponentenstrukturen. Bis zu 3 Drucke überprüft wurden, um mit diesem Prozess zu arbeiten, und mehr machbar sein.

4. Mitteilung von ECM-Nanofasern und Nanostrukturen

1. Legen Sie die gemusterten PIPAAm beschichtete Deckgläschen in einer 35 mm Petrischale und untersuchen das Muster Treue mit Phasenkontrastmikroskopie. Je nach dem Muster, kann eine CCD-Kamera erforderlich sein, die Merkmale des Musters aufzulösen. Fluoreszenzmikroskopie können auch verwendet werden, um die, sofern die ECM-Proteine ​​fluoreszierend markiert Muster zu inspizieren.
2. 3 ml 40 ° C destilliertem Wasser auf die Petrischale und lassen Sie das Wasser nach und cool.
3. Die Auflösung des PIPAAm Schicht und die Freisetzung der ECM Proteinmuster kann unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie überwacht werden. Wenn die Anwendung die Verwendung von optischen tec nicht zulassenhniques kann die Freisetzung durch Messung der Lösungstemperatur überwacht werden. Typischerweise wird das Wasser auf Raumtemperatur und unterhalb der LCST PIPAAm (32 ° C) abgekühlt, um sicherzustellen, dass die ECM-Protein-Nanostrukturen sind bekannt.
4. Nach der Freigabe werden die Nanofasern, nanofabrics und anderen Nanostrukturen in Wasser schwimmen. Um sie zu verwenden für weitere Anwendungen, die sie benötigen, um manipuliert werden. Die genaue Vorgehensweise wird auf dem Versuchsziel ab und kann Schritte wie Immobilisierung auf eine andere Oberfläche, bewegt sich mit einem Mikromanipulator-System oder die Einbettung in einem Hydrogel gehören.

Results

SIA ist in der Lage Engineering ECM-Protein-Nanofasern mit präziser Kontrolle über die Faserabmessungen. Um dies zu demonstrieren, wurden Anordnungen von FN-Nanofasern mit ebenen Abmessungen von 50 x 20 um auf eine PIPAAm beschichteten Deckglas (2A) strukturiert. Nach Freigabe, beauftragte die Fasern, weil sie unter einer inhärenten Vorspannung, wenn auf der Oberfläche PIPAAm (2B) strukturiert. Die Analyse der FN-Nanofasern ergab, waren sie monodisperse Pre-Release mit einer durchschnit...

Discussion

Die hier vorgestellten Methode SIA imitiert Zell-vermittelte Matrixaufbau und ermöglicht die Konstruktion von ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen mit einstellbaren Größe, Organisation und Zusammensetzung. Zwar nicht identisch mit Zell-ECM erzeugt, schafft SIA ECM nanoskaliger Protein Fibrillen ^20, die reversible Faltung unterziehen / Entfaltung bei der mechanischen Belastung ²¹ und ²⁰ Zellen binden zusammen. Dies bietet eine einzigartige Fähigkeit, ECM-Protein-Materialien, die viel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(N-isopropylacrylamid) / PIPAAm	Polysciences	21458-10	40.000 Mw
Sylgard 184 Silikon Kit (PDMS)	Dow Corning		Mix 10 Teile Basis mit 1 Teil Härter.
Butanol
Fibronektin	BD Biowissenschaften	354008	Mensch, 1mg
Laminin	BD Biowissenschaften	354239	Ultrarein, Maus, 1mg
Negativer Fotolack	Microchem	SU8-2015
SU8 Entwickler	Microchem
Sonicator Branson M3510	Branson Ultrasonic Corporation	CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mischer	Thinky Corporation
Spincoater	Spezialbeschichtungssysteme	G3P-8
Glasabdeckung 25 mm Durchmesser, Nr. 1,5	Fisher Scientific	12-545-86