Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Zusammenfassung

Frostschutzproteine (AFPs) binden an bestimmte Eisebenen, um das Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. Die Fluoreszenzbasierte Eisebene (FIPA)-Analyse ist eine Modifikation der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. AFPs werden fluoreszierend beschriftet, in makroskopische Einzeleiskristalle integriert und unter UV-Licht visualisiert.

Zusammenfassung

Frostschutzproteine (AFPs) werden in einer Vielzahl von kalt-harten Organismen exprimiert, um das interne Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. AFPs binden sich durch ihre Eisbindungsflächen an bestimmte Eisebenen. Die FiPA-Analyse (Fluoreszenzbasierte Eisebene)ist eine modifizierte Technik zur Bestimmung der Eisebenen, an die die AFPs binden. FIPA basiert auf der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. Es erzeugt klarere Bilder in einer verkürzten experimentellen Zeit. In der FIPA-Analyse werden AFPs fluoreszierend mit einem chimären Tag oder einem kovalenten Farbstoff beschriftet und dann langsam in einen makroskopischen Einzeleiskristall eingearbeitet, der zu einer Hemisphäre vorgeformt und zur Bestimmung der A- und C-Achsenausgerichtet ist. Die AFP-gebundene Eishalbkugel wird unter UV-Licht dargestellt, um AFP-gebundene Ebenen mithilfe von Filtern zu visualisieren, um unspezifisches Licht zu blockieren. Die fluoreszierende Kennzeichnung der AFPs ermöglicht die Echtzeitüberwachung der AFP-Adsorption in Eis. Es wurde festgestellt, dass die Beschriftungen die Ebenen, an die AFPs gebunden sind, nicht beeinflussen. Die FIPA-Analyse führt auch die Möglichkeit ein, mehr als einen unterschiedlich markierten AFP auf demselben einzigen Eiskristall zu binden, um ihre Bindungsebenen zu differenzieren. Diese Anwendungen der FIPA tragen dazu bei, unser Verständnis dafür zu fördern, wie AFPs an Eis binden, um ihr Wachstum zu stoppen, und warum viele AFP-produzierende Organismen mehrere AFP-Isoformen ausdrücken.

Einleitung

Die Produktion von Frostschutzproteinen (AFPs) ist ein wichtiger Überlebensmechanismus einiger Organismen, die in eisbeladenen Umgebungen leben. Bis vor kurzem dachte man, dass die einzige Funktion von AFPs darin bestand, das Wachstum von inneren Eiskristallen zu verhindern oder zu verlangsamen, die die Durchblutung blockieren, Gewebeschäden verursachen und osmotischen Stress verursachen würden. Organismen, die kein Einfrieren vertragen, wie Fische, drücken AFPs aus, um das Eiskristallwachstum vollständig zu hemmen¹. Andere, wie Gras, sind frosttolerant und drücken AFPs aus, um die Eisrekristallisation zu hemmen, die die Bildung großer Eiskristalle in ihren Geweben reduziert². Die Stabilisierung von Membranen bei niedriger Temperatur ist eine weitere Funktion, die für die AFPs vorgeschlagen wurde³. Kürzlich wurde eine neue Rolle für die AFP eines antarktischen Bakteriums, Marinomonas primoryensis, aus eisbedeckten Brackseen^{vorgeschlagen 4}. Diese AFP ist Teil eines viel größeren Adhesin-Proteins^5, von dem angenommen wird, dass es das Bakterium an Eis anheftet, um einen besseren Zugang zu Sauerstoff und Nährstoffen zu erhalten⁶. Andere Mikroben sind dafür bekannt, AFPs zu sezernieren, was die Struktur des Eises, in dem sie leben, verändern könnte⁷.

AfPs wurden in einigen Fischen, Insekten, Pflanzen, Algen, Bakterien, Diatomen und Pilzen gefunden. Sie haben bemerkenswert unterschiedliche Sequenzen und Strukturen, die mit ihrer Entwicklung von verschiedenen Vorläufern bei verschiedenen Gelegenheiten übereinstimmen; und doch binden sie alle an Eis und hemmen sein Wachstum durch den Adsorptionsinhibitionsmechanismus⁸. Die AFPs haben jeweils eine bestimmte Oberfläche, die als eisbindende Stelle (IBS) fungiert. Diese wurden typischerweise durch standortgesteuerte Mutagenese von Oberflächenrückständen^9-11identifiziert. Die IBS wird vermutet, um Wassermoleküle in einem eisähnlichen Muster zu arrangieren, das bestimmten Eisebenen entspricht. So bildet die AFP ihren Liganden, bevor sie an sie bindet^{5, 12}. Eisebenen können durch ihre Miller-Indizes definiert werden, und verschiedene AFPs können an verschiedene Ebenen binden. So bindet Typ I AFP von Winterflunder an die 20-21 Pyramidenebenen¹³, Typ III AFP bindet sowohl primäre Prisma als auch Pyramidenebenen mit einer zusammengesetzten Eisbindungsfläche^11,14, während der Fichtenknospenwurm AFP, ein hyperaktiver AFP, gleichzeitig an die Primär- und Basalebene^15,16bindet. Andere hyperaktive AFPs, wie MpAFP, binden an mehrere Eisebenen, wie ihre vollständige Abdeckung von einzelnen Eiskristallhemisphären^{zeigt 5,17}. Es wird vermutet, dass die Fähigkeit von hyperaktiven AFPs, die Basalebene zu binden, sowie andere Ebenen, für ihre 10-fache höhere Aktivität gegenüber mäßig aktiven AFPs¹⁸verantwortlich sein kann. Obwohl die Effizienz hyperaktiver AFPs gut dokumentiert ist, ist ihre Fähigkeit, sich an mehrere Eisebenen zu binden, immer noch nicht verstanden.

Die ursprüngliche Methode zur Bestimmung der AFP-gebundenen Eisflugzeuge wurde von Charles Knight^13,19entwickelt. Bei dieser Methode wird ein makroskopischer Einzeleiskristall auf einen hohlen Metallstab (Kaltfinger) montiert und zu einer Hemisphäre geformt, indem er in einen halbkugelförmigen Becher mit entgastem Wasser getaucht wird. Dann wird die Hemisphäre in eine verdünnte Lösung von AFPs getaucht und eine Eisschicht wird von der AFP-Lösung auf die Eiskristall-Hemisphäre über mehrere Stunden angebaut, die durch die Temperatur des Ethylenglykols gesteuert wird, das durch den kalten Finger zirkuliert. Der Eiskristall wird aus der Lösung entfernt, vom kalten Finger gelöst und in einen Gefrierraum von -10 bis -15 °C gelegt. Die Oberfläche wird mit einer scharfen Klinge abgekratzt, um den gefrorenen Oberflächenfilm der Frostschutzproteinlösung zu entfernen, und der Eiskristall darf sich für mindestens 3 Stunden sublimieren. Nach der Sublimation können die eisebenen, die von AFPs gebunden sind, als weiß geätzte Muster gesehen werden, die aus Restproteinen abgeleitet sind. Die Eishalbkugel kann an ihrer c-Achseund a-Achsenausgerichtet werden, um die Basal- und Prismenebenen des Eises zu lokalisieren und die Miller-Indizes der geätzten Flecken zu bestimmen.

Hier beschreiben wir eine Modifikation der ursprünglichen Methode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen, eine Methode, die wir als fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität (FIPA)¹¹bezeichnen. Die AFPs sind fluoreszierend entweder mit einem chimären Etikett, wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP)^11,16,17,20, oder mit einem fluoreszierenden Farbstoff kovalent an die AFP^5,21gebunden. Die fluoreszierend markierten AFPs werden auf einen einzigen Eiskristall adsorbiert und mit dem gleichen experimentellen Verfahren wie die ursprünglichen Eisätzexperimente überwuchert. Das Ausmaß der AFP-Bindung an die wachsende Eishalbkugel kann während des gesamten Experiments mit einer ultravioletten (UV) Lampe überwacht werden. Nach Abschluss des Experiments kann die Hemisphäre direkt vom kalten Finger abgenommen und ohne Sublimation abgebildet werden. Wenn gewünscht, kann die Hemisphäre jedoch sublimiert werden, um einen traditionellen Eisätz zu visualisieren. Änderungen, die an der FIPA-Methodik vorgenommen wurden, verkürzen das traditionelle Eisätzprotokoll um mehrere Stunden. Darüber hinaus besteht das Potenzial, mehrere AFPs mit jeweils einem anderen fluoreszierenden Etikett gleichzeitig zu bebildern, um die überlappenden Muster von AFP-gebundenen Eisebenen zu visualisieren.

Protokoll

1. Wachsende Einzelne Eiskristalle

1. Nehmen Sie eine saubere Metallwanne (15 cm Durchmesser, 4,5 cm Höhe), die in ein Ethylenglykol-Kühlbad passt und auf einem Schwimmen schwimmt.
2. Polyvinylchlorid (PVC) zylindrische Formen vorbereiten, (4,5 cm Durchmesser, 3-4 cm hoch, 4 mm dick), durch Sägen von Profilen aus einem Rohr.
   1. Schneiden Sie eine Kerbe, (1 mm breit, 2 mm hoch) auf einer Seite (Abbildung 1A).
   2. Bereiten Sie so viele Formen vor, die bequem in die Pfanne passen (Abbildung 1B).
      Hinweis: Eine Studie zeigte, dass Polyvinylalkohol (PVA) die Eiskerne beeinflussen kann²². In unserem offenen Schimmel-PVC-System sind wir jedoch nicht auf Probleme der atypischen Eisbildung gestoßen.
3. Tragen Sie einen leichten Film aus Vakuumfett auf den unteren Oberflächenring jeder Form auf, d. h. auf die Oberfläche mit ausgeschnittener Kerbe. Verdichten Sie diese gefettete, eingekerbte Oberfläche auf eine Metallwanne mit den Kerben, die von der Mitte der Pfanne weg ausgerichtet sind. Achten Sie darauf, die Kerben nicht mit Fett zu füllen oder zu verschließen.
4. Fügen Sie 0,22 m gefiltertes und entgastes/deionisiertes Wasser in die Mitte der Pfanne, aber außerhalb der Formen, und lassen Sie das Wasser langsam in die Formen durch die Kerben eindringen. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Die Wasserschicht sollte ca. 5 mm tief sein.
5. Die Pfanne in ein temperaturgeregeltes Ethylenglykolbad auf -0,5 °C abgekühlt. Die Pfanne sollte perfekt eben sein. Fügen Sie bei Bedarf Ballastgewichte an den Seiten der Pfanne hinzu.
6. Nachdem die Pfanne und das Wasser -0,5 °C erreicht haben, fügen Sie ein kleines Stück Eis in die Mitte der Pfanne, außerhalb der Formen.
   1. Dadurch wird das Eiswachstum im unterkühlten Wasser über die Pfanne und in die Formen nukleiert. Die kleine Kerbe am Boden jeder Form lässt nur einen Eiskristall durch, was zu einem einzigen Eiskristall in jeder Form führt.
   2. Über Nacht bebrüten, um eine Eisschicht zu bilden.
7. In den nächsten drei Tagen 13 ml 4 °C entgastes/deionisiertes Wasser einmal täglich in jede Form geben und die Temperatur des Ethylenglykolbades nach jeder Zugabe von -0,8 °C am ersten Tag auf -1,1 °C am zweiten Tag und auf -1,5 °C am dritten Tag senken.
   1. Inkubieren Sie bei diesen Temperaturen über Nacht.
   2. Am vierten Tag sollten die Formen vollständig mit Eis gefüllt sein.
8. Ziehen Sie die Formen aus der Pfanne, schieben Sie die Eiskristalle aus den Formen und lagern Sie auf einer sauberen Oberfläche, wie z. B. einem Wägeboot, in einem -20 °C Gefrierschrank für ca. 1 Stunde vor dem Handling.
9. Anstatt viele kleine einzelne Eiskristalle vorzubereiten, kann ein großer Einzele-Eiskristall mit mehreren Litern Volumen in einem konstanten Temperatur-Inkubator hergestellt werden, wie von Knight²³beschrieben. Der große Eiskristall kann ein Jahr oder mehr gelagert werden, wenn er in einem Gefrierschrank von -15 bis -20 °C aufbewahrt wird. Teile von Einzelkristall können mit einer Säge nach Bedarf aus dem Eisblock geschnitten werden.

2. Bestimmung der Singularität und Orientierung des Eiskristalls

1. Stellen Sie fest, ob es sich bei dem aus der Form vertriebenen Eis um einen einzelnen Kristall handelt, indem Sie in einem Gefrierraum zwischen zwei gekreuzten Polaroiden (Abbildung 1D)beobachten.
   1. Wenn der Eiskristall einzeln ist, sollten keine Risse oder Diskontinuitäten gesehen werden, und die Lichtrichtung sollte sich innerhalb des Eiskristalls nicht ändern.
      Hinweis: Wenn kein Gefrierraum zur Verfügung steht, kann stattdessen ein Kühlraum in allen erforderlichen Schritten genutzt werden, wobei man vorsichtig ist, schnell zu arbeiten und das Eis sparsam zu handhaben.
2. Aufgrund der Eisbirefreringence kann man gleichzeitig die Ausrichtung der c-Achsebestimmen. Verwenden Sie die folgenden Informationen, um die Ausrichtung zu bestimmen:
   1. Wenn die c-Achsegenau parallel zum einfallenden Licht ist, wird theoretisch kein Licht durch die gekreuzten Polaroids passieren. Wenn das einfallende Licht leicht von parallel zur c-Achsebetitelt wird, wird ein gleichmäßiges mehrfarbiges Lichtspektrum durch den Kristall übertragen, wenn es zwischen den gekreuzten Polaroids gedreht wird. Diese gleichmäßige Transmission entsteht durch die optische Inaktivität von Eis I_h entlang seiner c-Achse²⁴. Die Basalebene des Eiskristalls ist normal zur c-Achse.
   2. Wenn die c-Achseweiter vom parallelen zum einfallenden Licht entfernt ist und der Eiskristall zwischen den gekreuzten Polaroids gedreht wird, wechselt das übertragende Licht zwischen 0-100% Transmission mit jeder 90° Drehung des Kristalls.
   3. Am häufigsten ist die c-Achsenormal zur kreisförmigen Ebene des zylindrischen Eiskristalls.
3. Bestimmen Sie die Ausrichtung der a-Achsendurch Eislochierung^25, die geschieht, indem Sie den Eiskristall fest in Aluminiumfolie wickeln, ein kleines Loch mit einer Nadel durch die Folie in das Eis auf der Basalebene (normal zur c-Achse)stecken und ihn 20 min unter Vakuum stellen.
   1. Diese Behandlung erzeugt eine Ätze mit sechseckiger Symmetrie auf der Basalebene, wo die a-Achsendurch die Scheitelpunkte des sechsseitigen Sterns verlaufen (Abbildung 2A).
   2. Auf Wunsch kann der Eiskristall mit einer Säge entweder parallel oder senkrecht zu einer Seite des Sechsecks geschnitten werden, um ihn mit einer primären oder sekundären Prismaebene senkrecht zum kalten Finger zu montieren (Abbildung 3).

3. Adsorption von fluoreszierend gekennzeichneten Frostschutzproteinen an einen einzigen Eiskristall

1. Montieren Sie einen einzelnen Eiskristall auf den kalten Finger (Abbildung 1C), indem Sie zuerst einen Hohlraum in die Oberseite des Kristalls bohren. Dazu wechseln Sie das Eis abwechselnd mit zwei Aluminiumstäben mit leicht unterschiedlichem Durchmesser, aber ähnlich dem Durchmesser des kalten Fingers, um den Hohlraum zu bilden, in den der kalte Finger passen kann.
2. Kühlen Sie den kalten Finger auf -0,5 °C, legen Sie ihn in die Eishöhle und halten Sie den Eiskristall an Ort und Stelle, bis er auf das Metall gefriert (Abbildung 2B). Vermeiden Sie Luftblasen, wenn Sie den Kristall am Finger befestigen, da sie eine effiziente Wärmeübertragung vom Finger zum Stab behindern.
3. Füllen Sie einen halbkugelförmigen Becher, der etwa doppelt so groß ist wie der Durchmesser des Eiskristalls, mit gefiltertem entionisiertem Wasser oder Puffer, gekühlt auf ca. 4 °C. Untertauchen Sie den kalten, fingergebundenen Eiskristall in die Tasse und entfernen Sie überschüssiges Wasser oder Puffer, so dass die Spitze des Eiskristalls ungefähr mit der flüssigkeitsschicht gleich ist und das Eis die Tassenwände nicht berührt.
   1. Bedecken Sie den Becher mit Isolierung und senken Sie die Temperatur auf -5 °C.
   2. Warten Sie etwa 1 Stunde, bis sich der Eiskristall zu einer Hemisphäre formt und überprüft seinen Status etwa alle 20 min (Abbildung 2C).
   3. Das Eis wird die Form des halbkugelförmigen Bechers annehmen, indem es den Eiskristall schmilzt und wächst, aber es sollte nie überwachsen, um die Tassenwände zu berühren. Es sollte mindestens 1 cm Abstand zwischen Wand und Hemisphäre vorhanden sein und der kalte Finger sollte nicht aus dem Eis herausragen.
4. Entfernen Sie die Tasse aus dem Eiskristall und fügen Sie die fluoreszierende Proteinlösung zu einem Endvolumen von 25-30 ml und der gewünschten Analysekonzentration hinzu, wobei Sie darauf achten, das gesamte Flüssigkeitsvolumen in der Tasse unverändert zu halten. Eine typische AFP-Konzentration beträgt 0,1 mg/ml.
   1. Den Eiskristall wieder in den Becher untertauchen, so dass die Spitze des Eiskristalls mit der Flüssigkeit auf dem Niveau ist und der Eiskristall die Tassenwände nicht berührt (Abbildung 2D).
   2. Lassen Sie die kalte Fingertemperatur auf -8 °C fallen und lassen Sie die Proteinlösung 2-3 Stunden lang in den Eiskristall einfrieren, wodurch die Lösung oft unter Rühren behandelt wird. Das aus der Proteinlösung gebildete Eis sollte mindestens 5 mm betragen, bevor das Eiswachstum gestoppt wird.
5. Entfernen Sie den Eiskristall aus der Tasse, während Sie noch am kalten Finger befestigt sind. Lösen Sie das Eis von letzterem, indem Sie das Kühlmittel durch den kalten Finger auf knapp über 0 °C erwärmen und warten, bis der Eiskristall abschmilzt.
6. Legen Sie den Kristall flach auf eine saubere Oberfläche, wie z. B. eine Wägeschale, achten Sie darauf, das neu formierte Eis nicht zu berühren und vor der Übergabe mindestens 20 min bei -20 °C aufzubewahren.

4. Visualisierung von Frostschutzprotein-gebundenen Eisebenen

1. Die Visualisierung der Fluoreszenz erfolgt in einem abgedunkelten Gefrierschrank oder Kühlraum, indem der Eiskristall flach unter Lampen mit wellenlängenspezifischen Anregungsfiltern platziert wird, um das Fluoreszenzetikett und kameraemissionsfilter zu anregen, um jedes andere unspezifische Licht zu blockieren. Basierend auf dem Muster können die Eisebenen, die durch AFPs gebunden sind, geschätzt werden (Abbildung 4).
2. Wenn Wellenlängenspezifische Leuchten nicht verfügbar sind, kann stattdessen ein UV-Lichtkasten verwendet werden.
3. Herkömmliche Eisätze können auch einfach durchgeführt werden, indem die Eishalbkugel bei -20 °C für mindestens 3 Stunden sublimiert werden kann, danach kann Restproteinpulver auf der Eisoberfläche sichtbar werden (Abbildung 5).
4. Schritt 2.3 kann wiederholt werden, um die Ausrichtung der a-Achsender fertigen Eishalbkugel zu bestimmen.

Ergebnisse

Die Vorbereitung und Montage des einzelnen Eiskristalls sind die beiden Schritte des FIPA-Verfahrens, bei denen am häufigsten Fehler gemacht werden. Die Bestimmung, ob der vorbereitete Eiskristall einzeln ist, erfolgt durch Untersuchung durch gekreuzte Polaroide (Abbildung 1D), wie in Schritt 2.1 des Protokollabschnitts beschrieben. Wenn ein multikristalliner Eiskristall für die FIPA-Analyse verwendet wird, wird das Ergebnis eine diskontinuierliche Bindung der AFPs auf der Hemisphäre ohne ein kohärentes ...

Diskussion

Entwicklung der Eisätzmethode durch Charles Knight zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisflugzeugen hat die Studien über den Mechanismus der Eisbindung durch AFPs weit fortgeschritten. Während Strukturen von AFPs durch Röntgenkristallographie^26,27 gelöst werden konnten, gab es keine offensichtliche Methode, um die komplementäre Oberfläche auf Eis abzuleiten, an die sich die AFP gebunden hatte. Als Typ I AFP von Winterflunder zunächst charakterisiert wurde, wurde es angenommen, an die primären Prismaebenen von E...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NESLAB RTE Kältebad/Umwälzthermostate	Thermo Scientific	RTE7
Ethylenglykol, vorgemischtes Frostschutzmittel/Kühlmittel	zertifiziert	29-3037-0	Gängiges Kfz-Frostschutzmittel
Kalter Finger	nicht verfügbar	nicht verfügbar nicht verfügbar	Sonderanfertigung aus Messing (9 cm lang, 1,5 cm Außendurchmesser)
Halbkugelbecher	nicht verfügbar	nicht verfügbar	Sonderanfertigung aus Harz (8 cm Außendurchmesser, 6 cm Innendurchmesser)
Beleuchtungssystem mit hohem Doppelausgang	Lightools Research	LT-99D2, Illumatools DLS 120 Volt AC, LT-9470FX, LT-9549FX	Zusätzliche und kundenspezifische Anregungsfilter können bei Lightools erworben werden Forschungskamera
	Canon	EOS 50D
Emissionsfilter	Lightools Research	LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG	Möglicherweise ist ein Filterringadapter erforderlich, um den Filter auf das Kameraobjektiv zu montieren