Bottom-up-und Shotgun Proteomics, um eine umfassende Cochlear Proteome Identifizieren

Zusammenfassung

Proteomanalyse des Cochlea-sensorischen Epithel kann eine Herausforderung aufgrund seiner geringen Größe und weil Membranproteine ​​sind schwer zu isolieren und zu identifizieren. Sowohl Membran und lösliche Proteine ​​können durch die Kombination mehrerer Herstellungsverfahren und Trennverfahren mit hochauflösenden Massenspektrometrie identifiziert werden.

Zusammenfassung

Proteomik ist eine häufig verwendete Ansatz, der Einblicke in komplexe biologische Systeme bieten können. Die Cochlea Sinnesepithels enthält Rezeptoren, die mechanische Energie der Ton in einer elektrochemischen Energie durch die peripheren und zentralen Nervensystem verarbeitet zu transduzieren. Mehrere Proteomics Techniken entwickelt worden, um die Cochlea Innenohr, wie zum Beispiel zweidimensionale Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE), Antikörper-Microarray und Massenspektrometrie (MS) zu untersuchen. MS ist die umfassende und vielseitiges Werkzeug in der Proteomik und in Verbindung mit Trennverfahren kann eine eingehende Proteom von biologischen Proben. Trennmethoden in Kombination mit MS hat die Fähigkeit, Proteinproben zu bereichern, zu erkennen niedrigem Molekulargewicht und hydrophoben Proteinen und identifizieren niedrigen reichlich Proteine, die durch die Verringerung der Proteom-Dynamikbereich. Verschiedene Strategien zur Verdauung gesamte Lysat oder fraktionierte Protein-Lysat aufgetragen, um Peptid-und Protein verbessernSequenzabdeckung. Die Verwendung von unterschiedlichen Trenntechniken, einschließlich starker Kationenaustausch (SCX), Reversed-Phase (RP) und geleluiert flüssige Fraktion Einschluss-Elektrophorese (GELFrEE) angewendet werden, um die Komplexität Probe vor der MS-Analyse zur Identifizierung von Proteinen zu reduzieren.

Einleitung

Proteomics ist die Untersuchung komplexer biologischer Systeme durch die Analyse von Protein-Expression, Funktion, Änderungen und Wechselwirkungen ^ein. Verschiedene Verfahren wurden für die Proteomanalyse des Innenohrs, einschließlich Antikörper-Microarray ^2, zweidimensionale Gelelektrophorese ^3-5 und DIGE ⁶ verwendet worden. Jedoch nur eine beschränkte Anzahl von Proteinen identifiziert und charakterisiert ^2,7-10, im Vergleich zu den mehr als 10.000 Gene und exprimierten Sequenz-Tags (ESTs) in das Innenohr ^11,12 identifiziert, MS ist das am häufigsten verwendete und umfassende Technik in der Proteomik....

Protokoll

Ethikerklärung

Experimente mit Mäusen Gewebe wurden von der University of South Florida Institutional Animal Care und Verwenden Committee (Protokolle 3931R, 3482R) zugelassen nach unter den Richtlinien der National Institutes of Health gesetzt.

1. Proteinextraktion

1. Isolieren Cochlea sensorischen Epithel von 16 30 Tage alten (P30) CBA / J-Mäusen und bei -80 ° C
2. Am Tag des Experiments, waschen Gewebe mit 500 &mgr; l 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Zentrifugieren für 3 min bei 1000 · g, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholt für insgesamt drei Waschungen.
3. Beschallen Gewe....

Ergebnisse

Um die umfassendste Proteom des Cochlea-sensorischen Epithel zu erhalten, wird schnell Gewebedissektion vor der Proteinextraktion und Probenvorbereitung erforderlich. Zwei Proteom-Techniken verwendet werden können, Schrotflinte und Bottom-up-Proteomics. Um Proben für Schrot Proteomik vorzubereiten, wurde FASP Aufschlussverfahren verwendet, wie in Abbildung 1 dargestellt. Das Verfahren ermöglicht FASP Konzentration von Proteinen, die Entfernung von Detergenzien und Verdauung der Proteine ​​mit mehreren E.......

Diskussion

Die wichtigsten Schritte zur Maximierung Proteinidentifizierung aus dem Riechepithel Cochlea sind: 1) Verwendung von mehreren Endoproteinasen für die Verdauung, 2) Verwendung von mehreren Trenntechniken, und 3) Einsatz einer hochauflösenden Massenspektrometer. Die Anwendung von mehreren Enzymen erhöht die Anzahl von Peptiden und verbessert die Proteinsequenzabdeckung, damit eine Verbesserung der Anzahl der identifizierten Proteine ​​aus der Cochlea Gewebe. Trypsin, das am häufigsten verwendete Protease stellt eine.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
8% Tris-Acetat-Patrone	Protein Discovery	42103
Aceton	Sigma-Aldrich	179124
Acetonitril	Honeywell	015-1L
AEBSF	Calbiochem	101500
Ammoniumformiat	Fisher Scientific	AC16861
Aprotinin	Calbiochem	616370
ASB-14	Calbiochem	182750-5GM
Rinderserumalbumin	BioRad	500-0112
C18 Säule	Neues Ziel	A25112	75 μ m x 10 cm
DC Protein Assay	BioRad	500-0116	Mikrotiterplatten-Assay Protokoll
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Endoproteinase Lys-C	Sigma-Aldrich	P3428
FASP Protein Digest Kit	Protein Discovery	44250
Ameisensäure	Fluka	94318
GELFrEE Fraktionierungssystem	Protein Discovery	42001	GELFrEE 8100
Leupeptin	Calbiochem	108975
MacroSpin Säule	The Nest Group	SMM SS18V	Silica C18
Microcystin	Calbiochem	475815
Pepstatin	Sigma-Aldrich	P5318
Polysulfoethyl A-Säule	The Nest Group	202SE0503
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sonic Dismembrator	Thermo Fisher	15-338-53	Modell 100
Trypsin	Sigma-Aldrich	T6567	Proteomik-Qualität