Methodenartikel

Bottom-up-und Shotgun Proteomics, um eine umfassende Cochlear Proteome Identifizieren

DOI:

10.3791/51186

⸱

7. März 2014

 , 
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Proteomanalyse des Cochlea-sensorischen Epithel kann eine Herausforderung aufgrund seiner geringen Größe und weil Membranproteine ​​sind schwer zu isolieren und zu identifizieren. Sowohl Membran und lösliche Proteine ​​können durch die Kombination mehrerer Herstellungsverfahren und Trennverfahren mit hochauflösenden Massenspektrometrie identifiziert werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomik ist eine häufig verwendete Ansatz, der Einblicke in komplexe biologische Systeme bieten können. Die Cochlea Sinnesepithels enthält Rezeptoren, die mechanische Energie der Ton in einer elektrochemischen Energie durch die peripheren und zentralen Nervensystem verarbeitet zu transduzieren. Mehrere Proteomics Techniken entwickelt worden, um die Cochlea Innenohr, wie zum Beispiel zweidimensionale Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE), Antikörper-Microarray und Massenspektrometrie (MS) zu untersuchen. MS ist die umfassende und vielseitiges Werkzeug in der Proteomik und in Verbindung mit Trennverfahren kann eine eingehende Proteom von biologischen Proben. Trennmethoden in Kombination mit MS hat die Fähigkeit, Proteinproben zu bereichern, zu erkennen niedrigem Molekulargewicht und hydrophoben Proteinen und identifizieren niedrigen reichlich Proteine, die durch die Verringerung der Proteom-Dynamikbereich. Verschiedene Strategien zur Verdauung gesamte Lysat oder fraktionierte Protein-Lysat aufgetragen, um Peptid-und Protein verbessernSequenzabdeckung. Die Verwendung von unterschiedlichen Trenntechniken, einschließlich starker Kationenaustausch (SCX), Reversed-Phase (RP) und geleluiert flüssige Fraktion Einschluss-Elektrophorese (GELFrEE) angewendet werden, um die Komplexität Probe vor der MS-Analyse zur Identifizierung von Proteinen zu reduzieren.

Einleitung

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Proteomics ist die Untersuchung komplexer biologischer Systeme durch die Analyse von Protein-Expression, Funktion, Änderungen und Wechselwirkungen ein. Verschiedene Verfahren wurden für die Proteomanalyse des Innenohrs, einschließlich Antikörper-Microarray 2, zweidimensionale Gelelektrophorese 3-5 und DIGE 6 verwendet worden. Jedoch nur eine beschränkte Anzahl von Proteinen identifiziert und charakterisiert 2,7-10, im Vergleich zu den mehr als 10.000 Gene und exprimierten Sequenz-Tags (ESTs) in das Innenohr 11,12 identifiziert, MS ist das am häufigsten verwendete und umfassende Technik in der Proteomik zur Proteincharakterisierung. Proteom-Analyse von komplexen Proben, wie der Cochlea, kann schwierig sein. Allerdings ist die Kombination von mehreren Trenntechniken mit MS ermöglicht die Identifizierung einer größeren Anzahl von Peptiden und Proteinen aufgrund einer erhöhten dynamischen Konzentrationsbereich und die Spitzenleistung 13. Mehrdimensionale ChromatographiePHY reduziert sehr komplexe Proteingemische indem die Verwendung von verschiedenen Mechanismen Adsorption. Es gibt zwei häufig verwendete MS Proteomanalyse Ansätze, Schrotflinte und Bottom-up-Proteomics. Schrotflinte in der Proteomik, wird eine Mischung von intakten Proteinen enzymatisch verdaut und getrennt unter Verwendung multidimensionaler Chromatographie mit einem starken Kationenaustausch-Chromatographie (SCX), gefolgt von Umkehrphasen-Flüssigchromatographie (RPLC) 14,15. Die getrennten Peptide an Tandem-MS unterzogen und Datenbank-Suche 15. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Tausende von Proteinen in einer einzigen Analyse identifiziert werden, und die Technik ist besser, Membranproteine ​​geeignet.

Im Bottom-up-Ansatz wird das Proteingemisch abgetrennt, in der Regel durch ein-oder zweidimensionale Elektrophorese, und die einzelnen Proteinbanden oder Flecken ausgeschnitten und mit einem Enzym wie Trypsin verdaut, was in der Regel mehrere Peptide. Jedoch kann eine andere neuerely entwickelt elektrophoretische Ansatz, in bottom-up Proteomik verwendet wird, ist GELFrEE. Diese Technik fraktioniert Proteinproben in flüssiger Phase und macht sie weniger komplex vor der Analyse. Diese Technik ist reproduzierbar, bietet eine hohe Proteinausbeute und reduziert den Vertrieb von qualitativ vorkommenden Proteine ​​in komplexen Proteinproben 16. Peptide aus getrennten Proteine ​​entstehen, werden von MS analysiert, mithilfe von Peptidmassenfingerprinting-oder Tandem-MS (MS / MS), um Sequenz-Tags für die Datenbanksuche 17-19 erstellen. Einige der wichtigsten Vorteile der Verwendung des Bottom-up-Ansatz sind die Fähigkeit, hochauflösende Trennungen und umfassende Berichterstattung Protein zu erhalten. Bottom-up Proteomik ist die am häufigsten verwendete Technik in der Proteomik 20, daher sind mehrere Bioinformatik-Werkzeuge zur Verfügung. Darüber hinaus können Proteine ​​in einem komplexen Gemisch vor Verdauung getrennt werden, so gibt es eine größere Wahrscheinlichkeit der Identifikation.

Eine der großen Herausforderungenim Umgang mit dem inneren Ohr für Proteomanalyse ist seine geringe Größe, eingeschränkte Zugänglichkeit und Zelltyp Vielfalt 21. Zusätzlich Schlüsselproteine, die die Funktionalität unterscheiden, wie Ionenkanäle, Transporter und Rezeptoren sind Membranproteine, die schwierig sein kann, zu isolieren 22. So ist Filter gestützten Probenvorbereitung (FASP) für Proteom-Analysen von Geweben, die für die Proteinextraktion beschränkt sind vorteilhaft und Reinigungsmittel, die erfordern, um Membranen 23 zu lösen. Diese Filterung ermöglicht die MS-Analyse von Membran-und löslichen Proteinen und für die Fähigkeit, Peptide, die von niedrigmolekulargewichtigen Verunreinigungen 23,24 isolieren.

Dieses Protokoll beschreibt häufig verwendete Proteomics, die kombiniert werden und geändert werden, um lösliche und Membranproteine ​​zu analysieren und um die Anzahl der Protein-IDs aus der Cochlea Sinnesepithels maximieren. Wir beschreiben mit Shotgun Proteomics mit FASP Mehr verdauenIonen, Ionenaustausch-Chromatographie, hochauflösende MS, und Datenanalyse. Darüber hinaus werden wir Bottom-up Proteomik mit GELFrEE, FASP Mehr Verdauung, hochauflösende MS und Datenanalyse zu beschreiben.

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Protokoll

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Ethikerklärung

Experimente mit Mäusen Gewebe wurden von der University of South Florida Institutional Animal Care und Verwenden Committee (Protokolle 3931R, 3482R) zugelassen nach unter den Richtlinien der National Institutes of Health gesetzt.

1. Proteinextraktion

  1. Isolieren Cochlea sensorischen Epithel von 16 30 Tage alten (P30) CBA / J-Mäusen und bei -80 ° C
  2. Am Tag des Experiments, waschen Gewebe mit 500 &mgr; l 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Zentrifugieren für 3 min bei 1000 · g, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholt für insgesamt drei Waschungen.
  3. Beschallen Gewebe für 30 sec auf Eis in 100 &mgr; l Lyse-Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 ug / ml AEBSF, 10 ug / ml Leupeptin, 100 ug / ml Pepstatin, 2 ug / ml Aprotinin und 0,5 ug / ml unter Verwendung eines Schall Microcystin Dismembrator (Modell 100, Thermo Fisher). Coole Lysat auf Eisfür 1 Minute zwischen jeder Beschallung. Beschallen insgesamt 3x.
  4. Zentrifugieren des Extrakts bei 750 × g bei 4 ° C für 2 min und Überstand in ein neues Mikroröhrchen. Extrahieren des Pellets in 50 &mgr; l Lyse-Puffer durch Beschallung für 30 sec auf Eis. Der Extrakt wird zentrifugiert bei 750 × g bei 4 ° C für 2 min. Kombinieren beide Lysaten und Zentrifuge bei 28.600 × g bei 4 ° C für 60 min. Den Überstand in ein neues Mikroröhrchen und mit 20 &mgr; l Lyse-Puffer, der 0,1% ASB-14 zu dem Pellet. Wirbel für 1 min und Inkubation für 60 min bei 4 ° C.
  5. Erwärmen die Probe bei 95 ° C für 5 min, dann kühlen auf 4 ° C für 60 min. Folgen mit Zentrifugation bei 16.000 × g bei 25 ° C für 10 min. Sammeln Sie den Überstand und übertragen in ein neues Röhrchen.
  6. Zentrifugieren der Suspension bei 16.000 × g bei 4 ° C für 5 min und unter Beibehaltung der Überstand für die Verdauung.

2. Doppel CASO-Protein Verdauung von Whole Lysate Mit FASP

  1. Fügen Sie ein 30 μl Aliquot (≤ 400 &mgr; g) der Cochlea-Proteinextrakt, enthaltend 4% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 0,1 M Dithiothreitol (DTT) direkt mit einem 30K Spinfilter und gemischt mit 200 ul 8 M Harnstoff in Tris-HCl. Zentrifugieren bei 14000 × g für 15 min.
  2. Verdünnt das Konzentrat mit 200 ul 8 M Harnstofflösung und Zentrifugation bei 14.000 × g für 15 min.
  3. Werden 10 ul 10x Iodacetamid (IAA) in 8 M Harnstofflösung zu dem Konzentrat in der Filter-und Wirbel für 1 min. Inkubieren der Spin-Filter für 20 min bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln, gefolgt von Zentrifugation bei 14.000 × g für 10 min.
  4. 100 ul 8 M Harnstoff-Lösung zu dem Konzentrat auf der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 15 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. Füge 100 &mgr; l 50 mM Ammoniumbicarbonat (ABC)-Lösung zu der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
  5. Hinzufügen von 0,4 &mgr; g / &mgr; l Trypsin 1:100 (w / w) Enzym-zuProtein-Verhältnis und Inkubation über Nacht (O / N) bei 37 ° C.
  6. Nach der Inkubation werden 40 ul 50 mM ABC-Lösung für 10 min Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 xg. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
  7. Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu der Spinfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die tryptischen Peptide zu einem frischen Mikroröhrchen und säure mit Ameisensäure (FA) auf 1,0%, um die Verdauung zu stoppen.
  8. Die Filtereinheit mit 40 ul 8 M Harnstoff waschen, und dann waschen mit 2x 18 M 40 ul Wasser.
  9. Mit 100 ul 50 mM ABC Lösung waschen Sie die Filtereinheit 3x. Nach dem letzten Waschen hinzuzufügen 0,4 &mgr; g / &mgr; l Trypsin 1:100 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis und inkubieren O / N bei 37 ° C.
  10. Tryptischen Peptide eluieren von der zweiten Verdau durch Zugabe von 40 ul 50 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
  11. Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung, um dieFiltereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat enthält die tryptischen Peptide in ein frisches Mikroröhrchen und säuert mit FA zu 1,0%.
  12. Die Proben können mit Hilfe der Mikro kolorimetrischen Assay mit BSA als Standard quantifiziert werden.

3. Endoproteinase LysC und CASO-Protein Verdauung von Whole Lysate Mit FASP

  1. Hinzufügen eines 30-ul-Aliquot (≤ 400 &mgr; g) der Cochlea-Proteinextrakt, der 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 0,1 M DTT direkt mit einem 30K Spinfilter und mit 200 &mgr; l 8 M Harnstoff in Tris-HCl-Mischungs . Zentrifugieren bei 14000 × g für 15 min.
  2. Verdünnt das Konzentrat mit 200 ul 8 M Harnstofflösung und Zentrifugation bei 14.000 × g für 15 min.
  3. Werden 10 ul 10x IAA in 8 M Harnstofflösung zu dem Konzentrat in der Filter-und Wirbel für 1 min. Inkubieren der Spin-Filter für 20 min bei RT im Dunkeln dann bei 14.000 × g für 10 min zentrifugiert.
  4. 100 l 8 M Harnstoff Solution zu dem Konzentrat auf der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 15 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. Füge 100 &mgr; l 100 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
  5. Mit 0,1 &mgr; g / &mgr; l Endoproteinase LysC in einer 1:50 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis und inkubieren O / N bei 30 ° C.
  6. Nach der Inkubation werden 40 &mgr; l 100 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
  7. Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu der Spinfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die LysC Peptide zu einem frischen Mikroröhrchen und säure mit FA auf 1,0%, um die Verdauung zu stoppen.
  8. Die Filtereinheit mit 40 ul 8 M Harnstoff waschen, und dann waschen mit 2x 18 M 40 ul Wasser.
  9. Mit 100 ul 50 mM ABC Lösung waschen Sie die Filtereinheit 3x. Nach dem letzten Waschen hinzuzufügen 0,4 &mgr; g / &mgr; l Trypsin 1:100 Enzym-zu-ProProtein-Verhältnis und Inkubation O / N bei 37 ° C
  10. Eluieren tryptischen Peptiden durch Zugabe von 40 ul 50 mM ABC-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
  11. Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung mit der Filtereinheit und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die tryptischen Peptide zu einem frischen Mikroröhrchen und säure mit 1,0% FA.
  12. Die Probe kann unter Verwendung des Mikroplatten-kolorimetrischen Test mit BSA als Standard quantifiziert.

4. Entsalzung Peptiden mithilfe der Spin Columns

  1. Aktivieren einer C 18-Säule MacroSpin durch Zugabe von 500 &mgr; l Acetonitril (ACN) und Zentrifugieren bei 1100 × g für 1 min. Entsorgen Sie die Durchfluss nach Zentrifugation.
  2. Äquilibrieren der Säule mit 500 ul 0,1% FA und Zentrifuge bei 1100 × g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
  3. Fügen Sie bis zu 500 ul des Peptids verdauen zu der Säule eind Zentrifuge bei 1100 g für 1 min. Wenn das Probenvolumen größer als 500 ul ist dann wiederholen Sie diesen Schritt.
  4. Die Säule wird mit 500 ul 0,1% FA und Zentrifuge bei 1100 × g für 1 min. Entsorgen Sie die Durchströmung. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
  5. Add 250 &mgr; l einer 90:10-ACN zu-Wasser-Verhältnis auf die Säule und Zentrifugieren bei 1.100 × g für 1 min. Sammeln Sie die Laufmittel, die die Peptide entsalzt und Transfer zu einem neuen Mikroröhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
  6. Trocknen Sie die entsalzt Peptidprobe in einer Vakuumzentrifuge und komplett zu vermeiden, ließ die Probe trocken.

5. Ionenaustauschchromatographie

  1. Spritzen 50-100 ug verdauten Proteinprobe auf eine 200 x 2,1 mm, 5 um SCX-Säule (Polysulfoethyl A), um Peptide zu trennen.
  2. Verwenden eines Gradienten von 2-40% B über 50 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 250 ul / min. Lösemittel A ist 5 mM Ammoniumformiat, pH 3,0 in 25% Acetonitril und 75% ddH 2 O. Lösungsmittel B 500 mM Ammoniumformiat, pH-Wert6.0 in 25% ACN und 75% ddH 2 O.
  3. Überwachung der Peptidfraktionen bei 280 nm und sammelt die Fraktionen, die in 2-Minuten-Intervallen unter Verwendung eines Fraktionssammlers.
  4. Trocken Fraktionen im Vakuum-Konzentrator und Resuspension in 500 ul 50% Acetonitril in ddH2O mit 5% FA mit Salz Entfernung unterstützen.
  5. Fraktionen wieder zu trocknen und lagern bei -80 ° C bis bereit sind, für nano LC-MS/MS Analyse zu verwenden.

6. Aceton Niederschlag

Vor GELFrEE Trennung der Cochlea Proteinüberstand hat, entsalzt werden. Aceton Fällung kann verwendet werden, um Proteine ​​zu entsalzen und konzentrieren werden.

  1. In drei Bänden von eiskaltem Aceton zu dem Cochlea-Überstand. Vorsichtig vortexen und Inkubation bei -20 ° CO / N.
  2. Zentrifugieren Sie die Proben-Mischung bei 15.000 g für 15 min bei 4 ° C und Überstand.
  3. Waschen des Proteinpellet 3x mit gekühltem Aceton und Zentrifuge bei 14.000 × g für 5 min bei 4° C.
  4. Luft trocknen den Pellet-und in 112 ul 18 M Wasser auflösen.
  5. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit Hilfe der Mikrofarbtest.

7. GELFrEE Fraktionierung von Cochlear Sinnes Epithel

  1. Werden 30 ul 5x Probenpuffer (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w / v) SDS, 50% Glycerin, 0,5% (w / v) Bromphenolblau) auf die entsalzte Protein in 112 ul 18 M suspendiert Wasser.
  2. Hinzufügen 8 ul 1 M DTT und Wärme bei 95 ° C für 5 min auf Protein-Disulfid-Bindungen zu reduzieren. Nach dem Erhitzen ermöglichen Abkühlen auf Raumtemperatur.
  3. 8 ml Laufpuffer zum Anodenbehälter, 150 ul Laufpuffer zur Sammelkammer abzutasten, und 6 ml Laufpuffer Kathodenreservoir.
  4. Entfernen jeder Puffer, der in der Probenaufnahmekammer mit einer Pipette geflossen sein kann.
  5. Last 150 ul (≤ 1 mg) der Cochlea-Proteinmischung, in die Probenaufnahmekammer mit einem 8% Trist Acetat-Patrone mit einem Massenbereich von 3,5 bis 150 kDa.
  6. Nieder Elektroden und Deckel schließen Instrument, um den Lauf zu starten.
  7. An der ersten Pausenzeit des Instruments 2 ml Laufpuffer auf den Kathodenreservoir und wieder laufen.
  8. Bei jeder Pause Intervall auf das Instrument, sammeln die Probe aus der Probensammelkammer mit einer Pipette und in den frisch markierten Mikroröhrchen. Waschen Sie die Sammelkammer 2x mit 150 ul Laufpuffer und entsorgen.
  9. In 150 ml frisches Laufpuffer auf das Probensammelkammer und wieder laufen. Sammle die Proteinfraktionen über einen Zeitraum von 2,6 h in einem Gesamtvolumen von 150 ul / Fraktion.

8. 1D-Gel-Elektrophorese von GELFrEE Fraktionen

1D-Gel-Elektrophorese verwendet werden, um die Ergebnisse aus GELFrEE Fraktionierung vor der enzymatischen Verdauung und MS-Analyse zu visualisieren. GELFrEE Proteinfraktionen können auf einem 4-15% Tris-HCl-Gel getrennt werden.

  1. Mischen ein 5 ul Aliquot von jeder GELFrEE Fraktion mit 5 ul der Probenverdünnungspuffer (350 mM DTT in Probenpuffer).
  2. Erhitzen Sie die Proben bei 95 ° C für 3 min.
  3. Coole Proben auf RT.
  4. Last 10 ul jeder GELFrEE Fraktion in einzelnen Gelspuren und Last 5 ul der Molekulargewichtsstandard in der letzten ungenutzten Spur.
  5. Die Elektrophorese bei 125 V für 1,5 Stunden oder bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
  6. Entfernen Sie vorsichtig das Gel und Flecken mit Silber Stain Plus, um die Proteintrennung zu visualisieren.

9. Protein Verdauung von GELFrEE Fraktionen Mit FASP

Eine modifizierte FASP Verfahren ist für Reinigungsmittel entfernen und Verdauung der GELFrEE Fraktionen eingesetzt.

  1. Fügen jedes einzelne Fraktion direkt zu einer Filtereinheit 30K, mit 200 ul 8 M Harnstoff in Tris-HCl und Zentrifugation bei 14.000 × g für 25 min gemischt.
  2. Verdünnt das Konzentrat mit 200 ul Harnstofflösungund Zentrifuge bei 14.000 × g für 12 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
  3. Werden 10 ul 10x IAA in Harnstofflösung zu dem Konzentrat in jeder Filtereinheit, Wirbel für 1 min und Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln.
  4. 100 l Harnstofflösung zu dem Konzentrat auf den Filtereinheiten und Zentrifuge bei 14.000 × g für 15 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. 100 l 100 mM ABC-Lösung für die Filtereinheiten und Zentrifuge bei 14.000 g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
  5. Mit 0,1 &mgr; g / &mgr; l für LysC 1:50 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis zu den Filtereinheiten und Inkubieren O / N bei 30 ° C.
  6. Nach der Inkubation werden 40 ul 100 mM ABC-Lösung für die Spin-Filter und Zentrifuge bei 14.000 g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
  7. Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu der Drehfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die LysC Peptide aus jedem Spin Filter in ein frisches Mikroröhrchen und säure mit trifluoroacessigsäure (TFA).
  8. Die Spin-Filter mit 40 ul 8 M Harnstoff waschen, dann waschen 2x mit 40 ul 18 M Wasser.
  9. Waschen Sie die Spin-Filter 3x mit 100 ul 50 mM ABC-Lösung. Nach dem letzten Waschen hinzuzufügen 0,4 &mgr; g / &mgr; l Trypsin in einer 1:100 (w / w) Enzym-zu-Protein-Verhältnis und inkubieren O / N bei 37 ° C.
  10. Eluieren tryptischen Peptide aus jeder Filtereinheit durch Zugabe von 40 ul 50 mM ABC-Lösung und Zentrifugieren bei 14.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x.
  11. Dann werden 50 ul 0,5 M NaCl-Lösung zu den Filtereinheiten und Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min. Das Filtrat, das die tryptischen Peptide aus jeder Filtereinheit in ein frisches Mikroröhrchen und säure mit TFA.
  12. Trocknen Sie alle verdaut, in einem Vakuum-Konzentrator.

10. Probenvorbereitung für die LC-MS/MS

  1. Rekonstituieren getrocknet LysC und tryptischen Peptid verdaut Fraktionen in 20 ul 0,1% FA und Wirbel.
  2. Zentrifuge Proben bei 20.000 × g für 10min und entfernen Sie die obere 95% der Probe in ein neues Probengefäß.
  3. Injizieren 5 ul jeder Peptidfraktion auf einen 100 um x 25 mm Probenfalle, um Salze und Verunreinigungen zu entfernen, und chromatographische Trennung auf einer 75 &mgr; m × 10 cm C 18 Säule.
  4. Verwenden eines Gradienten von 2-40% B im Verlauf von 100 min mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 nl / min. Lösungsmittel A ist 95% ddH2O und 5% Acetonitril mit 0,1% FA. Lösungsmittel B ist 80% ACN und 20% ddH 2 O mit 0,1% FA.
  5. Sammeln Sie zehn Tandem-Massenspektren für jeden MS-Scan auf einem hochauflösenden Massenspektrometer. Ein LTQ Orbitrap-Massenspektrometer wurde in diesem Experiment verwendet.

11. Proteinidentifizierung

  1. Identifizieren Proteine ​​mit der Maus UniProt Datenbank mit Vorwärts-und Rückwärtsproteinsequenzen und gemeinsame Verunreinigungen. MaxQuant Software mit MASCOT Suchmaschine verwendet wird, um die Protein-Datenbank.
  2. Die Suchparameter, die verwendet werden können, umfassen, fest modification von carbamidomethyl Cystein, variable Modifikationen der Oxidation von Methionin, Protein N-terminale Acetylierung, maximal 2 verpasst Spaltung. Die Mindestpeptidlänge zu prüfen, ist für die Identifizierung sechs Aminosäuren. Geben Sie eine Peptidmassenkonzentrationsfehler von ± 8 ppm und ein Fragment Massentoleranz von 1,2 Da (Massenfehler ist abhängig von der Massenspektrometer verwendet werden).
  3. In der MaxQuant Software, verwenden Sie eine 1% False Discovery Rate (FDR) für Peptid-und Proteinidentifizierung. Proteinbestimmung mit der Anzahl der übereinstimm Peptide, die prozentuale Proteinsequenzabdeckung, und Peptidsequenzen aufgeführt.

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Ergebnisse

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Um die umfassendste Proteom des Cochlea-sensorischen Epithel zu erhalten, wird schnell Gewebedissektion vor der Proteinextraktion und Probenvorbereitung erforderlich. Zwei Proteom-Techniken verwendet werden können, Schrotflinte und Bottom-up-Proteomics. Um Proben für Schrot Proteomik vorzubereiten, wurde FASP Aufschlussverfahren verwendet, wie in Abbildung 1 dargestellt. Das Verfahren ermöglicht FASP Konzentration von Proteinen, die Entfernung von Detergenzien und Verdauung der Proteine ​​mit mehreren E...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die wichtigsten Schritte zur Maximierung Proteinidentifizierung aus dem Riechepithel Cochlea sind: 1) Verwendung von mehreren Endoproteinasen für die Verdauung, 2) Verwendung von mehreren Trenntechniken, und 3) Einsatz einer hochauflösenden Massenspektrometer. Die Anwendung von mehreren Enzymen erhöht die Anzahl von Peptiden und verbessert die Proteinsequenzabdeckung, damit eine Verbesserung der Anzahl der identifizierten Proteine ​​aus der Cochlea Gewebe. Trypsin, das am häufigsten verwendete Protease stellt eine...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, keine Interessenskonflikte.

Danksagungen

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Die Autoren danken Dr. Kent Seeley, Direktor des Center for Drug Discovery and Innovation (CDDI) Proteomics Core Facility an der Universität von Süd-Florida für die von dieser Möglichkeit Gebrauch. Diese Arbeit wurde vom NIH / NIDCD Zuschuss R01 DC004295 zu BHAS unterstützt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
8% Tris-Acetat-Patrone Protein Discovery42103
AcetonSigma-Aldrich179124
AcetonitrilHoneywell015-1L
AEBSFCalbiochem101500
AmmoniumformiatFisher ScientificAC16861
AprotininCalbiochem616370
ASB-14 Calbiochem182750-5GM
RinderserumalbuminBioRad500-0112
C18 SäuleNeues ZielA2511275 μ m x 10 cm 
DC Protein AssayBioRad500-0116Mikrotiterplatten-Assay Protokoll
EDTASigma-AldrichE9884
Endoproteinase Lys-CSigma-AldrichP3428
FASP Protein Digest KitProtein Discovery44250
AmeisensäureFluka94318
GELFrEE FraktionierungssystemProtein Discovery42001GELFrEE 8100
LeupeptinCalbiochem108975
MacroSpin SäuleThe Nest GroupSMM SS18VSilica C18
MicrocystinCalbiochem475815
PepstatinSigma-AldrichP5318
Polysulfoethyl A-SäuleThe Nest Group202SE0503
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma-AldrichL3771
Sonic Dismembrator Thermo Fisher15-338-53Modell 100
TrypsinSigma-AldrichT6567Proteomik-Qualität

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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