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Methodenartikel

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

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DOI:

10.3791/51192

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16. Mai 2014

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1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

DNabT Zellen sind selten unter peripheren T-Zellen; aber reichlich sind sie in bestimmten Nicht-lymphatischen Gewebe. Schwierigkeitsgrad der Isolierung DN T-Zellen von nicht-lymphatischen Gewebe behindert ihre Funktionsanalyse trotz steigender erkannt pathophysiologische Bedeutung. Wir beschreiben eine neue Methode zur Isolierung von hoch gereinigten DN T-Zellen aus murinen Niere.

Zusammenfassung

Derzeit gibt es keine Standard-Protokoll für die Isolierung von DN-T-Zellen von den nicht-lymphatischen Gewebe trotz ihrer zunehmend berichtet Beteiligung an verschiedenen Immunantworten. DN-T-Zellen sind eine einzigartige Immunzelltyp, der bei der Regulierung der Immun-und Autoimmunreaktionen und Toleranz zu allotransplants 1-6 gebracht wurde. DN-T-Zellen sind jedoch selten im peripheren Blut und sekundären lymphatischen Organen (Milz und Lymphknoten), jedoch sind die Haupt Bewohner der normalen Niere. Sehr wenig ist über die pathophysiologische Funktion 7 aufgrund ihrer Mangel in dem Umfang bekannt. Wir haben vor kurzem beschrieben, eine umfassende phänotypische und funktionelle Analyse dieser Bevölkerung in der Niere 8 in stationären und während der Ischämie Reperfusion. Analyse der DN-T-Zell-Funktion wird stark durch die Entwicklung eines Protokolls für ihre Isolation von der Niere verbessert werden.

Hier ein neues Protokoll, das ermöglicht isolatio beschreiben wirn von hochreinem ab CD4 + CD8 + T-Zellen und DN-T-Zellen aus der Maus-Nieren. Kurz gesagt, wir verdauen Nierengewebe mittels Collagenase und zu isolieren, Nierenmononuklearen Zellen (KMNC) durch Dichtegradientenzentrifugation. Dies wird durch zwei Schritte auf hämatopoetischen T-Zellen von 3% bis 70%, gefolgt von KMNC bereichern. Der erste Schritt besteht aus einer positiven Selektion von hämatopoetischen Zellen mit einer CD45 +-Isolierungs-Kit. Im zweiten Schritt werden negativ DN-T-Zellen durch Entfernen von nicht-gewünschten Zellen mit CD4, CD8, MHC Klasse II und monoklonale Antikörper und CD1d α-GalCer Tetramer isoliert. Diese Strategie führt zu einer Bevölkerung von mehr als 90% rein DN T-Zellen. Oberflächenfärbung mit den oben erwähnten Antikörper, gefolgt von FACS-Analyse wird verwendet, um die Reinheit zu bestätigen.

Einleitung

Periphere αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doppelt-negative (DN) T-Zellen werden in verschiedene Untergruppen, die unterschiedliche Phänotypen und Funktionen besitzen 1-4 unterteilt. DN-T-Zellen sind wenig verstanden, aber zunehmend auch in pathophysiologischen Immunantworten in verschiedenen Krankheitsmodellen 4-6 verwickelt.

DN-T-Zellen sind eine einzigartige Immunzelltyp, der immer an der Regulation von verschiedenen Immun-und Autoimmunreaktionen und die Modulation der Allotransplantat-Toleranz in Verbindung gebracht wird. 4-6, 9 Sie sind selten im peripheren Blut und sekundären lymphatischen Organen (Milz und Lymphknoten ). Allerdings sind sie großen Bewohner der normalen Nieren-und Darmepithel 10-12. Sehr wenig ist über ihre Funktion 7 in der Niere im stationären Zustand und unter pathologischen Bedingungen, wie akute Nierenschädigung (AKI) mit Nieren Transpl. verbundenen bekanntAmeise.

Wegen der komplizierten Rollen der verschiedenen Immunzellen bei der Regulierung der Immunantworten einschließlich alloresponses, die Definition der Rolle der einzelnen Spieler ist entscheidend für das Verständnis alloresponses und Gestaltung neuer Therapeutika. Angesichts der erheblichen Zahl von DN-T in der Niere unter physiologischen und unterschiedliche Krankheitszustände vorliegenden Zellen sind DN-T-Zellen wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Immun-und Autoimmunreaktionen in Mäusen und Menschen, und alloresponses bei Transplantatempfängern spielen. Thesaurierend wenn auch noch zerstreut Beweise bringen DN-T-Zellen in beiden pathogenen und immunsuppressive Funktionen, aber es ist schlecht verstanden, warum und wie sie eine spezifische schädliche oder drück Funktion aufweisen und wie die Umwelt beeinflusst sie.

Aufgrund ihrer geringen Menge in der Niere, sind verbesserte Verfahren zur Isolierung erforderlich.

Derzeit gibt es keine Standard-Protokoll für die Isolierung von DN T-Zellen von ter nicht-lymphatischen Geweben. Unser Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zur Isolierung von DN-T-Zellen aus der Niere; Jedoch kann das Verfahren auch für verschiedene nicht-lymphoiden Geweben verwendet werden.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Reagenzien

  1. Instrumente: Bereiten Sie die Reagenzien unter sterilen Bedingungen und unter Verwendung einer Steril.
  2. Herstellung von 1 l RPMI-Gewebekulturmedium mit 5% fötalem Rinderserum, 2,1 g Natriumbicarbonat, 10 ml Glutamat 100x, 10 mg HEPES, 1 mg Natriumpyruvat und 10 ml 100x Penicillin / Streptomycin.
    Hinweis: Die empfohlene Gewebekulturmedium RPMI, ist austauschbar mit DMEM.
  3. Vorbereitung 5% Collagenase "D"-Lösung (5 ml Collagenase "D" zu 9 ml Gewebekulturmedium).
  4. Machen Percoll-Lösung bei drei verschiedenen Konzentrationen: 100%, 80% und 40%. Die folgenden Konzentrationen sind 1 Probe berechnet. Halten Lösungen bei Raumtemperatur.
    1. Percoll Lösung: 9 ml unverdünntem Percoll (aus Stammlösung); 1 ml PBS 10x.
    2. Percoll-Lösung: 8 ml Percoll 100%; 2 ml PBS 1x.
    3. Percoll-Lösung:4 ml Percoll 80%; 4 ml PBS 1x.
  5. Auffüllen auf 1 L der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-Puffer; 5 ml 10% BSA (0,1% BSA), 1 ml 10% Natriumazid (0,1%), 2 ml EDTA-Agent, machen bis zu 1.000 ml mit 1x PBS.

2. Vorbereitung von Nieren Verdauung

  1. Nach dem Erwerb aller erforderlichen institutionellen Genehmigung opfern und exsanguinate die Mäuse mit Standardmethoden und nach den aktuellen Vorschriften und Tierpflege-Richtlinien.
    1. Betäuben die Maus mit Pentobarbital (0,07 mg / kg).
    2. Fahren Sie mit dem Ausbluten.
    3. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf einem Operationstisch.
    4. Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol.
  2. 10 ml Collagenase D Lösung der Petrischale.
  3. Entfernen und entkapseln beide Nieren aus jeder Maus.
    1. Öffnen abdomimal Hohlraum, indem eine Mittelschnitt durch die Bauchhaut und Peritoneum vom Brustbein bisdas Schambein.
    2. Die linke Niere freizulegen, indem der Darm seitlich zur Seite.
    3. Trennen Sie vorsichtig die linke Kapsel mit der Zange.
      Hinweis: Die Kapsel wird als transparente Schicht rund um die Nieren-und teilweise durch perinephric Fettgewebe bedeckt.
    4. Entfernen Sie die linke Niere durch Schneiden der Stiel Schiffe, die mit einer chirurgischen Schere.
    5. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die rechte Niere.
      Hinweis: Die rechte Niere ist Schädel und näher an der Mittellinie (Blütenstiele sind kürzer).
  4. Legen Sie die Niere in der Petrischale.
  5. Schneiden Sie das Nierengewebe in kleine Stücke (1-2 mm in der Abmessung) mit einem normalen Metallformung Klinge und legen die Stücke in den Collagenase-Lösung für 30-45 min im Brutschrank bei 37 ° C (Abbildung 1).

3. Vorbereitung von Nieren mononukleären Zellen (KMNC) aus der Niere Verdauung

  1. Eine Zellsuspension zu erhalten, der NiereVerdauung durch mechanisches Aufbrechen der Gewebe mit einem Sieb (70 um) und Resuspension in 25 ml Gewebekulturmedium und mischen.
  2. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C, um die Zellsuspension pelletieren.
  3. Re-suspend das Pellet in 4 ml 40% Percoll-Lösung und sanft überlagern auf 4 ml 80% Percoll-Lösung mit einer Übertragungsplastikpipette, sehr langsam und vorsichtig. Dies wird in zwei Phasen klar durch eine transluzente Schicht getrennt führen. Auf der Oberseite wird eine gelbe Schicht, die den Lipiden sein.
  4. Zentrifugieren bei 1500 × g für 30 min bei Raumtemperatur mit der Zentrifuge in Brems Aus-Modus.
  5. Durch Absaugen entfernen das gelbe und dicke Deckschicht (ca. 1-2 ml).
  6. Sammeln nur die leichte weißlich durchscheinende Schicht von der Grenzfläche der beiden Phasen mit einer Transferpipette. Diese Suspension sehr sorgfältig übertragen in eine 15 ml konischen Röhrchen mit 2 ml Gewebekulturmedium und fügen Sie dann 13 ml Medium, um ein Volumen von insgesamt machen15 ml.
  7. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C.
  8. Resuspendieren der Proben in 1 ml des Mediums.
  9. Zähle die Anzahl der KMNC mit Trypanblau-Ausschluss auf einer Zählkammer und das Ergebnis wird als Zahl der KMNC pro ml pro Niere.
  10. Einmal wie oben waschen.

4. Isolierung von hämatopoetischen (CD45 +) Zellen aus KMNC (Schritt I)

  1. Resuspendieren der Zellen bis zu 10 7 in 90 ul des Laufpuffers.
  2. In 10 ul CD45-Mikroperlen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C
  3. 1 ml Laufpuffer, um die Reaktion zu stoppen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C und Resuspendieren in 500 ul Laufpuffer.
  4. Vorbereitung der Magnetspalte, indem an dem Magneten und gründlich mit 3 ml Laufpuffer.
  5. Übergeben Sie die Zellsuspension durch die Magnetsäule und sammeln Sie die unmarkierte Zellen, die durch die Säule.
  6. Mit 3 ml runn Waschen Sie die Zellen dreimalten Puffer. Dann sammeln das Abwasser.
  7. Entfernen Sie die Spalte aus dem Separator und Pipette 5 ml Laufpuffer auf die Säulen und spülen Sie die markierten Bruch sofort. Diese Fraktion enthält die CD45 +-Zellen. Zählen Sie die Zellen.
  8. Um die absolute Anzahl verschiedener T-Zellen in Teilmengen Nieren Errechnung der Gesamtzahl von KMNC durch den Prozentsatz positiver Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt (Abbildung 2).

5. Isolierung von DN-T-Zellen aus CD45 + Vorbereitung durch negative Selektion (Schritt II)

  1. Add 2,5 ul (0,5 mg / ml, 1,25 &mgr; g) von jedem der folgenden biotinylierten Antikörper: anti-CD4, anti-CD8, anti-Fc-Rezeptor (CD16/32), Anti-MHC-Klasse II (IA b), anti- CD1d Tetramer PBS-57 für alle 10 7 hämatopoetischen Zellen.
  2. Inkubieren Zellen für 30 min in kalten Raum.
  3. 1 ml anti-Biotin-Mikrokügelchen.
  4. Inkubation für 30 min in einem kalten Raum.
  5. Das Röhrchen wird in ter Magnet und fahren Sie mit Erschöpfung.
  6. Zählen der lebensfähigen Zellen, die Gesamtzahl von DN-T-Zellen in der negativen Fraktion unter Verwendung einer Zählkammer bestimmen.
  7. Überprüfen Reinheit der DN-T-Zellen mit Durchflusszytometrie, indem Sie dieses Gating-Strategie: erste Tor CD45 +, zweite Tor TCRαβ +. Ausschließen CD1d +-Zellen. Grundstück CD4 + vs CD8 + T-Zellen auf DN (Abbildung 3) zu identifizieren.
  8. Multiplizieren Sie die Gesamtzahl der in der Reinheit bestimmt Prozentsatz.
    Hinweis: Die Verwendung dieses Protokolls zu einer Bevölkerung von mehr als 90% rein DN T-Zellen.

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Ergebnisse

Wildtyp C57BL / 6 (B6) Niere enthält etwa 1,5 bis 2,1 x 10 6 mononuklearen Zellen pro Niere. Weniger als etwa 10% hämatopoetische CD45 +-Zellen. Für die Herstellung von Nieren mononukleären Zellen (KMNC) werden die Nieren in kleine Stücke geschnitten, wie in Fig. 1 gezeigt, gefolgt von Verdauung mit Collagenase 5%.

Dies wird durch Durchführen einer Dichte-Gradienten-Zentrifugation auf KMNC Schicht (Fig. 2, links) zu sammeln, gefolgt. KM...

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Diskussion

Es gibt immer mehr Interesse an DN-T-Zellen, da sie, die in verschiedenen pathologischen Bedingungen, wie Autoimmunerkrankungen, Krebs, Transplantat-Toleranz und primären Erkrankungen der Niere einschließlich akuten Nierenschädigung (AKI) in Verbindung gebracht, Glomerulonephritis 8, 13. Daher besteht Bedarf, die pathophysiologische Funktionen DN-T-Zellen besser zu verstehen und zu charakterisieren. Derzeit jedoch mangelt es in Verständnis der Funktion dieser Zellen im Vergleich zu CD4 und CD8 T-Zellen. Ein w...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wird von NIH PBS (R21 AI095484) unterstützt. Wir danken NHI Tetramer Core Facility für CD1d Tetramer.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Laminar-Flow-HaubeBaker Company, IncOder gleichwertige Ausrüstung 
ZentrifugeBeckman-Scharoder gleichwertige Ausrüstung 
HämozytometerElektronenmikroskopie Sciences63514-11
Atmosphärengesteuerter InkubatorFisher Scientific ( 37°; C mit 5 % CO2)
Analytisches DurchflusszytometerLSR II
RPMI 1640Media Tech10-040-CV
Kollagenase DRoche11088858001
Percoll GE Healthcare17-0891-01
Serum für fötale RinderCorning Cellgro35-011-CV
0,1 % Natriumazid (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Puffer phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Corning Cellgro21-040-CV
PBS 10xMediatech46-013-CM
EDTA-PufferSigma-AldrichE1161
LS Säulen MiltenyiBiotec130-042-401
CD45+ MikrokügelchenMiltenyiBiotec6.78E-51
Biotin Mikrokügelchen MiltenyiBiotec130-090-485
anti-CD45 (Klon: 30-F11) PerCP eBioscienceG1397
Anti-CD45 (Klon: 30-F11) APC-Cy7Biolegend103116
Anti-TCR Pacific Blue  (ab-Kette, Klon: H57-597)InvitrogenHM3628
anti-CD4 PEeBioscience12-0043
anti-CD8 FITCeBioscience8011-0087
anti-CD4 biotinyliert (GK1.5)BD553728
anti-CD8 biotinyliert  (Klon 53-6.7)BD553029
anti-MHC Klasse II (I-A b) biotinyliertesBD553609
AutoMACS Laufpuffer - MACS Trennpuffer MIlteny I Biotec130-091-221
C57BL/6J MäuseJackson Labs000664Nieren - Lymphknoten
Petrischale BD Biosciences356517
70 μ m Filter Fisher Scientific22363548
Stößel Oder gleichwertige Ausrüstung 
GeneMate Röhrchen 50 mlBioexpressC-3394-3Oder gleichwertige Geräte 
GeneMate Röhrchen 15 mlBioexpressC-3394-1Oder gleichwertige Geräte 
CD1d α-Galcer TetramerNHI

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

Tags

Mononukleäre Zellen der NiereCollagenase-VerdauDichtegradientenzentrifugationCD45-PositivselektionNegativselektionflowcytometrische Analysemagnetische Bead-SeparationAnreicherung hämatopoetischer ZellenIsolation der Mausniere
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