Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

Zusammenfassung

Dieses Manuskript stellt eine Technik, um auf adhärenten Zellen oder Gewebe gelten oder freiKräfte mit unidirektionalen Stretching.

Zusammenfassung

Mechanische Kräfte auf Zellen ausgeübt und / oder Gewebe spielen eine wichtige Rolle in zahlreichen Prozessen. Wir haben ein Gerät an Zellen auf einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Membran, mit bildgebenden kompatibel vernickelt strecken entwickelt. Dieses Verfahren ist reproduzierbar und vielseitig. Die PDMS-Membran, um Zellen oder Gewebe zu einem bestimmten Geometrie beschränken mikrostrukturiert werden. Der erste Schritt ist die Mikrostrukturen auf den PDMS-Membran mit einem tiefen UV-Technik gedruckt. Die PDMS-Membran wird dann auf einer mechanischen Trage befestigt. Eine Kammer ist auf der Oberseite der Membran mit biokompatiblen Fett damit Gleiten während der Strecke gebunden. Die Zellen werden ausgesät und für mehrere Stunden auf den Mikro verbreiten. Die Probe kann mehrere Male unter Verwendung einer Mikrometerschraube gespannt und ungestreckte werden. Es dauert weniger als eine Minute, um die Strecke in vollem Umfang (rund 30%) anzuwenden. Die hier vorgestellte Technik nicht eine motorisierte Vorrichtung, die für eine erforderliche umfassenpplying wiederholter Dehnungszyklen schnell und / oder Computer-kontrolliertes Recken, aber dies kann realisiert werden. Dehnen von Zellen oder Gewebe kann von Interesse für die Fragen, um die Zellkräfte, Zell-Antwort gegen mechanische Beanspruchung oder Gewebemorphogenese bezogen werden. Diese Video-Präsentation wird zeigen, wie die typischen Probleme, die, wenn Sie diese Art von scheinbar einfachen Experiment entstehen könnten.

Einleitung

Die Zellen Zusammensetzen eines Gewebe in höheren Organismen unterliegen mechanischen Spannungen und Dehnungskräfte kommen entweder von der äußeren Umgebung oder von umgebenden Zellen ^1,2. Die Zellen müssen sich anzupassen und zu widerstehen, diese Kräfte, um die Gewebeintegrität aufrecht zu erhalten. Solche Kräfte sind auch für Gewebe-Morphogenese während der Entwicklung ^3,4. Anwenden von mechanischen Kräften auf kultivierte Zellen ist ein Weg, zu imitieren, was in einem Gewebe passieren könnte, aber mit einer quantitativen und unabhängige Steuerung der Zellform und Zellverformung ^5,6. Hierzu könnten verschiedene Techniken verwendet werden. Man kann auf die Zellen (die ganze Zelle oder einen Teil davon), beispielsweise mit AFM oder Derivate ^7,8 oder strecken das Substrat die Zellen wachsen auf zu drücken.

Die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren zeigt, wie ein Flugzeug Substrat mit Zellen plattiert dehnen. Auf m Diese Technik wurde ursprünglich entwickelt, um beurteilen die Rolle der Streitkräfte ausgeübtitotic Säugetierzellen ^9. Mitotische Zellen bleiben mit dem Substrat verbunden, durch Zurückziehen und Strecken der Fasern Membran ausgeübt wird, eine Kraft auf jene Fasern, die wiederum provozierte die Rotation der mitotischen Spindel. Das Interesse der Kombination von Klebstoff und Mikro Recken um eine unabhängige Steuerung von Kräften und Form der einzelnen Zellen zu erreichen. Es ist beispielsweise möglich, eine eiförmige Zelle in eine perfekt runde Form isotropen strecken, während einachsige Dehnung angewendet wird. Wenn die Zellen nicht auf Mikro geflochten, uniaxiales Strecken Ergebnisse in Zellstreckung, wobei die meisten Zellen, die ein mit dem Streckachse ausgerichtet langen Achse. Es ist dann schwierig, den Effekt der Ausrichtung der langen Achse und der Wirkung der Ausdehnung auf die Zellen zu trennen.

Das Gerät eignet sich für alle lebenden Zellen, einschließlich Langzeitablauf Fluoreszenz-Mikroskopie, und Medikamente können während des Experiments hinzugefügt werden. Die tiefe Mikrostrukturierungsverfahren ¹⁰ UVswurde im Detail in Azioune et al. ¹¹ Musterung auf PDMS wurde beschrieben in Azioune et al. ¹² Die vorliegende Streck Protokoll ist ein Video-Version Carpi et al. ¹³

Protokoll

1. Passivierung der PDMS

1. Ein Stück des PDMS ca. 35 mm x 20 mm aus einer bereits geformten Folie (zum Beispiel GelPak, wie in der Tabelle aufgeführten Materialien).
2. Entfernen Sie die obere und die untere Schutzschichten aus Kunststoff (falls erforderlich) und mit Hilfe einer Pinzette, um die PDMS in einer Kunststoff legen (nicht zellkulturbehandelte) Petrischale.
3. Waschen Sie die PDMS mit 70% Ethanol für 5 Minuten auf einem Schüttler bei 30 Schwingungen / min.
4. Trocknen Sie die Oberfläche durch strömende Luft auf sie.
5. Illuminate mit tiefen UV (λ = 180 nm) für 5 min bei einem Abstand von den UV-Lampen von etwa 5 cm (siehe Materialien Blatt für Lampe Referenz; Parameter für verschiedene Lampen variieren).
6. Planen 200 ul EDC / NHS-Lösung für jedes Stück PDMS (muss unmittelbar vor der Verwendung hergestellt, da die Reaktivität der Lösung zerfällt in wenigen Stunden werden). Für 1 ml 0,05 M MES + 0,5 M NaCl-Puffer bei pH 6,0, fügen 11,5 mg Sulfo-NHS und 19,2 mg EDC.
7. Übertragen Sie diePDMS Blätter von der Petrischale mit dem Deckel der Petrischale, die nicht belichtet worden ist. Dadurch wird sichergestellt, dass die Umgebung des PDMS sind sehr hydrophob und ermöglichen den nächsten Schritt.
8. In EDC / NHS-Lösung und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
9. Spülen EDC / NHS mit Wasser.
10. Hinzufügen PLL-g-PEG-Lösung (0,5 mg / ml in 10 mM HEPES pH 8.6) und Inkubation von 3 h bis über Nacht bei Raumtemperatur.
11. Spülen Sie die PLL-g-PEG mit Wasser. Passi PDMS (mit PLL-g-PEG funktionalisiert) kann für mehrere Tage bei 4 ° C gelagert werden

2. Strukturieren der PDMS

1. Nehmen Sie ein PDMS Blatt und legen Sie es auf einem synthetischen Quarzphotomaske tragen die Mikroformen zur Strukturierung (siehe Abbildung 1). Legen Sie die PDMS seitigen Lager die PLL-g-PEG mit Blick auf den Chrom Seite der Photomaske.
2. Beleuchten 7 Minuten durch die Photomaske in einem Abstand von der UV-Lampen von etwa 5 cm.
3. Fügen Sie Wasser auf die Maske + PDMS und schälen Sie die PDMS langsam aus der Maske.
4. Inkubieren mit Fibronectin-Lösung bei 50 mg / ml in HEPES-Puffer bei pH 8,6 für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Es ist möglich, andere ECM-Proteine ​​zu verwenden, aber diese sind nicht mit diesem Protokoll getestet.
5. Spülen mit PBS.

3. Das Gerät montieren

1. Montieren Sie die zuvor passivierten PDMS auf die Spannvorrichtung (siehe Diskussion zur Fehlersuche).
   1. Befestigen einer Seite des PDMS zu dem feststehenden Teil der Trage.
   2. Befestigen Sie die andere Seite mit dem Mobilteil der Trage ohne Spann zu viel von der PDMS Blatt.
2. Schneiden Sie ein Rechteck von PDMS (22 mm x 19 mm) in einer dicken PDMS Stich-und Schnitt ein weiteres Rechteck im Inneren, um einen Pool (oder Rahmen) haben, die die Zellen-und Medien behalten werden (siehe Abbildung 2).
3. In Silikonfett unter diese PDMS Pool und legen Sie es auf der PDMS-Blatt zu erstellen med.ium Haltebecken. Das Fett wird die Gleitfähigkeit des Pools über das PDMS Blatt beim Strecken zu ermöglichen.

4. Strukturieren der Zellen

1. Lösen Sie die Zellen aus einer 50% Konfluenz Kulturflasche mit Versene.
2. Zähle die Zellen zu resuspendieren und diese in einer Konzentration von 200.000 Zellen / ml.
3. 1 ml der Zellsuspension in den Pool (siehe Diskussion für weitere Details).
4. Sei (je nach Zelltyp, RPE-1-Zellen werden 10 min und HeLa-Zellen 20 min dauern) die Zellen zu binden, um die Muster für 10-30 min.
5. Vorsichtig spülen Sie die schwimmenden Zellen mit ins Gleichgewicht Medium (ins Gleichgewicht mittel Inkubator).
6. Lassen Sie die Zellen verteilt für ein paar Stunden auf die Muster (RPE-1 ist mindestens 2 Stunden brauchen, HeLa-Zellen wird 3 Stunden brauchen).
7. Fügen Sie ein Deckglas auf den Pool, um Verdunstung und mittlere Leckage bei der PDMS Pausen zu vermeiden.
8. Legen Sie das Gerät auf einem inversen Mikroskop und starten Bildgebung. Vermeiden Sie die Verwendung von Ölimmersion objectives, da es nicht durch Fokussierung Probleme funktionieren.

5. Dehnung

1. Die Mikrometerschraube drehen, während die Korrektur der Tischposition in x-, y-und z-Achse (hauptsächlich x). Die Bühnenposition muss korrigiert, die Erweiterung des PDMS und den Verlust des Fokus entgegenzuwirken. (Siehe "Bei der Strecke" Absatz in der Diskussion).

Ergebnisse

Die in diesem Video-Protokoll vorgestellte Technik erlaubt die Anwendung von Kräften auf die Rückzugs Fasern mitotischer Säugerzellen. In der Tat, während der Zellteilung, bei der mitotischen Phase, Säugetierzellen zurückziehen, um die Form einer Kugel nehmen und hinterlassen dünnen Aktin-Kabel von Membran umgeben, die auf dem Substrat befestigt sind. Diese Kabel (Rückzug Fasern), sind die Erinnerung an die Zellgeometrie, bevor er in Division. Machen Mikro mit tiefen UV durch eine Photomaske auf PDMS Dünnschicht <...

Diskussion

Obwohl diese Technik wurde mehrfach verwendet und wird gründlich getestet, gibt es mehrere kritische Schritte, die zu einem fehlgeschlagenen Experiment führen kann.

Über die PDMS:

Für diese Arbeit GelPak ein handelsüblicher Dünn PDMS Blatt, verwendet. Alternativ PDMS Blätter können direkt von PDMS-Mischung gegossen werden. Wir empfehlen die Verwendung GelPak, weil es mehr reproduzierbar, und ist weniger wahrscheinlich zu brechen Vergleich zu maßgeschneiderten PDMS. ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Verschiedene Dicken/Klebrigkeiten sind erhältlich. Eine Alternative könnte darin bestehen, Ihr PDMS zu casten  dich.
Silikonfett	GE Bayer Silikone	Baysilone-Paste	Dies ist biokompatibel
Dehnungsgerät	GREM mé canique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid)	Sigma	3450	Stabil 6 Monate bei -20 &de; C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz)	Sigma	56485	Vor Feuchtigkeit schützen
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zürich)
Synthetische Quarz-Photomaske	Toppan		Nehmen Sie die binäre Standard-Fotomaske in
Quarz-Fibronektin aus Rinderplasma	Sigma	F1141