Dieses Manuskript stellt eine Technik, um auf adhärenten Zellen oder Gewebe gelten oder freiKräfte mit unidirektionalen Stretching.
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Methodenartikel
Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mechanische Kräfte auf Zellen ausgeübt und / oder Gewebe spielen eine wichtige Rolle in zahlreichen Prozessen. Wir haben ein Gerät an Zellen auf einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Membran, mit bildgebenden kompatibel vernickelt strecken entwickelt. Dieses Verfahren ist reproduzierbar und vielseitig. Die PDMS-Membran, um Zellen oder Gewebe zu einem bestimmten Geometrie beschränken mikrostrukturiert werden. Der erste Schritt ist die Mikrostrukturen auf den PDMS-Membran mit einem tiefen UV-Technik gedruckt. Die PDMS-Membran wird dann auf einer mechanischen Trage befestigt. Eine Kammer ist auf der Oberseite der Membran mit biokompatiblen Fett damit Gleiten während der Strecke gebunden. Die Zellen werden ausgesät und für mehrere Stunden auf den Mikro verbreiten. Die Probe kann mehrere Male unter Verwendung einer Mikrometerschraube gespannt und ungestreckte werden. Es dauert weniger als eine Minute, um die Strecke in vollem Umfang (rund 30%) anzuwenden. Die hier vorgestellte Technik nicht eine motorisierte Vorrichtung, die für eine erforderliche umfassenpplying wiederholter Dehnungszyklen schnell und / oder Computer-kontrolliertes Recken, aber dies kann realisiert werden. Dehnen von Zellen oder Gewebe kann von Interesse für die Fragen, um die Zellkräfte, Zell-Antwort gegen mechanische Beanspruchung oder Gewebemorphogenese bezogen werden. Diese Video-Präsentation wird zeigen, wie die typischen Probleme, die, wenn Sie diese Art von scheinbar einfachen Experiment entstehen könnten.
Einleitung
Die Zellen Zusammensetzen eines Gewebe in höheren Organismen unterliegen mechanischen Spannungen und Dehnungskräfte kommen entweder von der äußeren Umgebung oder von umgebenden Zellen 1,2. Die Zellen müssen sich anzupassen und zu widerstehen, diese Kräfte, um die Gewebeintegrität aufrecht zu erhalten. Solche Kräfte sind auch für Gewebe-Morphogenese während der Entwicklung 3,4. Anwenden von mechanischen Kräften auf kultivierte Zellen ist ein Weg, zu imitieren, was in einem Gewebe passieren könnte, aber mit einer quantitativen und unabhängige Steuerung der Zellform und Zellverformung 5,6. Hierzu könnten verschiedene Techniken verwendet ....
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Protokoll
1. Passivierung der PDMS
- Ein Stück des PDMS ca. 35 mm x 20 mm aus einer bereits geformten Folie (zum Beispiel GelPak, wie in der Tabelle aufgeführten Materialien).
- Entfernen Sie die obere und die untere Schutzschichten aus Kunststoff (falls erforderlich) und mit Hilfe einer Pinzette, um die PDMS in einer Kunststoff legen (nicht zellkulturbehandelte) Petrischale.
- Waschen Sie die PDMS mit 70% Ethanol für 5 Minuten auf einem Schüttler bei 30 Schwingungen / min.
- Trocknen Sie die Oberfläche durch strömende Luft auf sie.
- Illuminate mit tiefen UV (λ = 180 nm) für 5 min bei einem Abstand von den UV-Lampen von etwa 5 cm (sieh....
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Ergebnisse
Die in diesem Video-Protokoll vorgestellte Technik erlaubt die Anwendung von Kräften auf die Rückzugs Fasern mitotischer Säugerzellen. In der Tat, während der Zellteilung, bei der mitotischen Phase, Säugetierzellen zurückziehen, um die Form einer Kugel nehmen und hinterlassen dünnen Aktin-Kabel von Membran umgeben, die auf dem Substrat befestigt sind. Diese Kabel (Rückzug Fasern), sind die Erinnerung an die Zellgeometrie, bevor er in Division. Machen Mikro mit tiefen UV durch eine Photomaske auf PDMS Dünnschicht <.......
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Diskussion
Obwohl diese Technik wurde mehrfach verwendet und wird gründlich getestet, gibt es mehrere kritische Schritte, die zu einem fehlgeschlagenen Experiment führen kann.
Über die PDMS:
Für diese Arbeit GelPak ein handelsüblicher Dünn PDMS Blatt, verwendet. Alternativ PDMS Blätter können direkt von PDMS-Mischung gegossen werden. Wir empfehlen die Verwendung GelPak, weil es mehr reproduzierbar, und ist weniger wahrscheinlich zu brechen Vergleich zu maßgeschneiderten PDMS. .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Institut Curie, Paris, Frankreich gegründet. Die mechanische Bahre wurde von Damien Cuvelier (Institut Curie) entworfen und wird von GREM hergestellt (mecanique-grem.com). Die Strukturierung auf PDMS wurde von Ammar Azioune (Bordeaux II University) entwickelt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Verschiedene Dicken/Klebrigkeiten sind erhältlich. Eine Alternative könnte darin bestehen, Ihr PDMS zu casten dich. |
| Silikonfett | GE Bayer Silikone | Baysilone-Paste | Dies ist biokompatibel |
| Dehnungsgerät | GREM mé canique | Stretcher 2011 | |
| EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid) | Sigma | 3450 | Stabil 6 Monate bei -20 &de; C |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz) | Sigma | 56485 | Vor Feuchtigkeit schützen |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zürich) | ||
| Synthetische Quarz-Photomaske | Toppan | Nehmen Sie die binäre Standard-Fotomaske in | |
| Quarz-Fibronektin aus Rinderplasma | Sigma | F1141 |
Referenzen
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18
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Nachdrucke und Genehmigungen
