Messung der Auswirkungen von Bakterien auf C. Elegans Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

Summary

Ein Ei-in-Wurm (EIW)-Assay ist eine nützliche Methode, um Eiablageverhalten quantifizieren. Änderungen in Eiablage kann eine Verhaltensreaktion des Modells Organismus Caenorhabditis elegans Potenziell schädlichen Umwelteinflüssen Substanzen wie diejenigen, die durch pathogene Bakterien.

Abstract

C. elegans Eiablage Verhalten wird durch Umweltreize wie Osmolarität ¹ und Vibrationen ² betroffen. In dem völligen Fehlen von Lebensmitteln C. elegans auch aufhören Eiablage und behalten befruchteten Eizellen in ihre Gebärmutter ^3. Jedoch ist die Wirkung der verschiedenen Quellen für Lebensmittel, insbesondere pathogenen Bakterien und insbesondere Enterococcus faecalis, auf Eiablageverhalten nicht gut charakterisiert. Das Ei-in-Wurm (EIW) Assay ist ein nützliches Werkzeug, um die Auswirkungen der verschiedenen Arten von Bakterien zu quantifizieren, in diesem Fall E. faecalis auf Eiablageverhalten.

EIW Assays beinhalten Zählen der Anzahl der Eier in die Gebärmutter der C gehalten elegans ^4. Der Test umfasst EIW Bleichen inszeniert, schwangeren Erwachsenen C. elegans zur Entfernung der Nagelhaut und trennen Sie die beibehalten Eier aus dem Tier. Vor dem Bleichen, sind Würmer, Bakterien (oder jede Art von Umwelt-Cue ausgesetzt) Für eine feste Zeitspanne. Nach dem Bleichen ist eine sehr leicht in der Lage, die Anzahl der Eier in der Gebärmutter der Würmer gehalten zählen. In diesem Test wurde eine messbare Erhöhung der Ei-Retention nach E. faecalis Belichtung kann leicht gemessen werden. Die EIW Assay ein Assay, der Verhaltens verwendet werden, um potentiell pathogenen Bakterien oder dem Vorhandensein von Umweltgiften screenen kann. Darüber hinaus kann die EIW Assay ein Werkzeug zum Auffinden von Wirkstoffen, die Neurotransmitter beeinflussen Signalisierung seit Eiablageverhalten moduliert von Neurotransmittern wie Serotonin und Acetylcholin ^5-9 sein.

Introduction

Caenorhabditis elegans, ein mikroskopisch, frei lebende Fadenwurm ist ein Modellorganismus traditionell genutzt, um Entwicklungs-und Zell-Signal-Prozesse wegen seiner transparenten Anatomie, gut charakterisierten Entwicklung, vollständig sequenzierten Genom, kurz-Generation Zeit und genetische Homologie zu Menschen studieren . In jüngerer Zeit C. elegans hat sich zu einem Modellorganismus im Bereich der Umwelt-Toxikologie und angeborenen Immunität ^{10, 11.}

Diese Selbstversorger-Düngung Zwitter Würmer geschlechtsreif werden innerhalb von zwei bis drei Tagen nach dem Schlüpfen aus dem Ei. Während seines Lebenszyk....

Protocol

1) Herstellung der Nematode Wachstumsmedien (NGM)

1. Um 50 Platten machen, fügen Sie 1,5 g NaCl, 8,5 g Reinstwasser Agar und 1,25 g Pepton zu einem 1 Lflask.
2. In 487,5 ml dH ₂ O zu überführen. Swirl sanft zu mischen und decken Eröffnung der Kolben mit einem Stück Alufolie.
3. Sterilisieren Sie die Lösung durch Autoklavieren bei Normalbedingungen (121 psi, 120 ° C, 20 min).
4. Lassen Sie die Lösung auf 45 ° C in einem Wasserbad abkühlen.
5. Zu der Lösung, fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge: 500 ul Cholesterin aus einer 5 mg / ml Stammlösung (gelöst in Ethanol), 500 ul 1 M CaCl _2, 500 ul 1 M MgSO _....

Results

Dieser Assay ermöglicht es, die Anzahl der Eier im C gehalten quantifizieren elegans nach Einwirkung von E. faecalis. L4 inszeniert Würmer (gekennzeichnet durch transparente offenen Raum über ihre Vulva, Abbildung 1), um E. ausgesetzt wurden faecalis bis ins Erwachsenenalter. Nach 40 Stunden der Exposition gegenüber E. faecalis wurde Bleichen durchgeführt. Da die Kutikula zerfiel in der Bleiche Tröpfchen, wurden die Eier noch deutlicher (Abbi.......

Discussion

Die wichtigsten Schritte bei der erfolgreichen Durchführung dieses Tests sind: 1) mit wohlgenährt Bestände von C. elegans, 2) Kultivieren einzelne Arten von Bakterien auf der Assay-Platte, 3) genau identifiziert inszeniert L4 Würmer für die Exposition gegenüber E. faecalis, 4) halten Belichtungszeit auf E. faecalis konsistent über alle Studien und 5) Bleichen Zeit sollte nicht mehr als zehn Minuten, um Ei Zerfall zu verhindern.

Für diesen Test ist es wichtig, gesun.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, ultrareines	Affymetrix	10906
Bacto Pepton	Becton Dickinson	211677
Bacto Trypton	Becton Dickinson	211705
Gehirn Herz Infusion dehydriertes Medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 Stamm	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterin	Alfa Aesar A11470
Kulturplatten für C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Kulturplatten für E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis Stämme			bereitgestellt von J. Middleton. Alle Isolate wurden als Enterokokken
durch Beobachtung des Wachstums auf Enterokokken-Agar (BBL) und in 6% NaCl-Brühe bestätigt;
alle Stämme wuchsen um 44,5 º C und waren Katalase-negativ und hydrolysiertes Esculin. A vereinfacht  dichotomer Schlüssel basierend auf Pigmentierungs- und Fermentationsreaktionen für sechs Zucker  (Arabinose, Mannitol, Methyl-α-D-Glucopyranosid (MGP), Ribose, Sorbose und Sorbit) erlaubt  mutmaßliche Identifizierung aller E. faecalis Stämme (Efs ist nicht pigmentiert und ist arabinose, MGP  und Sorbose negativ und Sorbit, Mannitol und Ribose positiv). Alle mutmaßlichen Efs-Stämme  wurden unter Verwendung des API 20 STREP-Systems (Biomerieux) bestätigt.
Mikroskop	Motic	SMZ 168B	Jedes Mikroskop mit Durchlichtbeleuchtung und 50-facher Vergrößerung sollte ausreichend sein
Streptomycinsulfat	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soja Agar (Sojabohnen-Kasein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Sojabrühe (Sojabohnen-Kasein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Hefeextrakt	Acros	61180-1000