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Summary

Ein Ei-in-Wurm (EIW)-Assay ist eine nützliche Methode, um Eiablageverhalten quantifizieren. Änderungen in Eiablage kann eine Verhaltensreaktion des Modells Organismus<em> Caenorhabditis elegans</em> Potenziell schädlichen Umwelteinflüssen Substanzen wie diejenigen, die durch pathogene Bakterien.

Abstract

C. elegans Eiablage Verhalten wird durch Umweltreize wie Osmolarität ¹ und Vibrationen ² betroffen. In dem völligen Fehlen von Lebensmitteln C. elegans auch aufhören Eiablage und behalten befruchteten Eizellen in ihre Gebärmutter ^3. Jedoch ist die Wirkung der verschiedenen Quellen für Lebensmittel, insbesondere pathogenen Bakterien und insbesondere Enterococcus faecalis, auf Eiablageverhalten nicht gut charakterisiert. Das Ei-in-Wurm (EIW) Assay ist ein nützliches Werkzeug, um die Auswirkungen der verschiedenen Arten von Bakterien zu quantifizieren, in diesem Fall E. faecalis auf Eiablageverhalten.

EIW Assays beinhalten Zählen der Anzahl der Eier in die Gebärmutter der C gehalten elegans ^4. Der Test umfasst EIW Bleichen inszeniert, schwangeren Erwachsenen C. elegans zur Entfernung der Nagelhaut und trennen Sie die beibehalten Eier aus dem Tier. Vor dem Bleichen, sind Würmer, Bakterien (oder jede Art von Umwelt-Cue ausgesetzt) Für eine feste Zeitspanne. Nach dem Bleichen ist eine sehr leicht in der Lage, die Anzahl der Eier in der Gebärmutter der Würmer gehalten zählen. In diesem Test wurde eine messbare Erhöhung der Ei-Retention nach E. faecalis Belichtung kann leicht gemessen werden. Die EIW Assay ein Assay, der Verhaltens verwendet werden, um potentiell pathogenen Bakterien oder dem Vorhandensein von Umweltgiften screenen kann. Darüber hinaus kann die EIW Assay ein Werkzeug zum Auffinden von Wirkstoffen, die Neurotransmitter beeinflussen Signalisierung seit Eiablageverhalten moduliert von Neurotransmittern wie Serotonin und Acetylcholin ^5-9 sein.

Introduction

Caenorhabditis elegans, ein mikroskopisch, frei lebende Fadenwurm ist ein Modellorganismus traditionell genutzt, um Entwicklungs-und Zell-Signal-Prozesse wegen seiner transparenten Anatomie, gut charakterisierten Entwicklung, vollständig sequenzierten Genom, kurz-Generation Zeit und genetische Homologie zu Menschen studieren . In jüngerer Zeit C. elegans hat sich zu einem Modellorganismus im Bereich der Umwelt-Toxikologie und angeborenen Immunität ^{10, 11.}

Diese Selbstversorger-Düngung Zwitter Würmer geschlechtsreif werden innerhalb von zwei bis drei Tagen nach dem Schlüpfen aus dem Ei. Während seines Lebenszyklus, C. elegans durchläuft vier Larvenstadien (L1-L4), vor Erreichen des Erwachsenenalters. Eine isolierte Zwitter erzeugen kann, im Durchschnitt 300 Nachkommen innerhalb von drei Tagen von Peak Fruchtbarkeit. In Geschlechtsreife C. elegans Hermaphroditen sind befruchtete Eizellen in der Gebärmutter für mehrere Stunden vor der Verlegung beibehalten. Dienormale Anzahl von Eiern in der Gebärmutter zu einem beliebigen Zeitpunkt gespeichert werden (während der Spitzenzeiten Fruchtbarkeit) zwischen zehn und fünfzehn ^12. Die Zahl der Eier in der Gebärmutter ist eine Funktion sowohl die Rate der Ei-Produktion und die Rate der Eiablage. Befruchteten Eier werden von der Gebärmutter durch die Kontraktion der Muskeln sechzehn vulval um die Öffnung der Vulva ¹³ angeordnet vertrieben. Zwitter-spezifische Motoneuronen (HSN) und VC Motoneuronen Synapse auf Vulva Muskeln beeinflussen Muskelkontraktion und damit Eiablageverhalten ^5,7,13,14. Vertreibung von Eiern aus der Gebärmutter tritt aufgrund koordinierte Aktivität von Nervenzellen und Muskeln.

Lab Kulturen von C. elegans sind in der Regel auf eine Diät von pathogenen Escherichia coli OP50 angehoben. In der natürlichen Umwelt, C. elegans kommen in Kontakt mit einer Vielzahl von Nahrungsquellen, wie pathogene Bakterien, die potenziell schädlich. Wenn schädliche Stoffe in exponiertendie Umwelt, C. elegans behalten Eier, bis die Umwelt günstiger wird. Vermutlich Ei Vorratsdatenspeicherung ist eine Anstrengung, um ihre Nachkommen zu schützen.

In diesem Ei in Wurm (EIW)-Assay, C. elegans mit den potentiell pathogenen Bakterien Enterococcus faecalis, die in der Umwelt ausgesetzt ist. Die Exposition gegenüber pathogenen Formen von E. faecalis kann anhaltende Darm-Infektion und sogar den Tod in C. elegans ^15. Die Exposition gegenüber anderen Formen von pathogenen Bakterien wurde gezeigt, dass Ei Retention ^16,17 beeinflussen, aber die Wirkung war nicht quantifiziert. Darüber hinaus belastet die Wirkung einer leicht pathogene E. faecalis hat Stämme, die nicht sofort tödlich, auf Eiablageverhalten nicht untersucht worden.

EIW Assays beinhalten Zählen der Anzahl der Eier in die Gebärmutter der C gehalten elegans ^4. Obwohl C. eleganstransparent sind, können Eier der sich in der Gebärmutter schwierig sein, in einer intakten Tier quantifizieren. Der Test umfasst EIW Bleichen schwangeren Erwachsenen C. elegans, die Bakterien für eine bestimmte Zeit ausgesetzt waren. Die Bleichmittel-Lösung löst sich die äußere Schuppenschicht verlassen die Eier hinter. Die Eier sind Brechungsindex der Auswirkungen der Bleiche durch die Gegenwart eines schützenden Eierschale. Nach dem Bleichen ist eine sehr leicht in der Lage, die Zahl der Eier aus dem Uterus der Würmer auf Bleichen freigegeben zählen.

Der beschriebene Test ist eine einfache, preiswerte und schnelle Methode, um die Anzahl der Eier im Uterus auf einmal zu quantifizieren, und somit die Quantifizierung der Effekte von E. faecalis auf Ei Retention. Dieser Test kann verwendet werden, um die Wirkung von anderen Arten von Bakterien, Umweltgifte oder Drogen auf Ei Retention zu quantifizieren. Dieser Test hat auch das Potenzial, um als Bildschirm für die bakterielle Pathogenität verwendet werden.

Protocol

1) Herstellung der Nematode Wachstumsmedien (NGM)

1. Um 50 Platten machen, fügen Sie 1,5 g NaCl, 8,5 g Reinstwasser Agar und 1,25 g Pepton zu einem 1 Lflask.
2. In 487,5 ml dH ₂ O zu überführen. Swirl sanft zu mischen und decken Eröffnung der Kolben mit einem Stück Alufolie.
3. Sterilisieren Sie die Lösung durch Autoklavieren bei Normalbedingungen (121 psi, 120 ° C, 20 min).
4. Lassen Sie die Lösung auf 45 ° C in einem Wasserbad abkühlen.
5. Zu der Lösung, fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge: 500 ul Cholesterin aus einer 5 mg / ml Stammlösung (gelöst in Ethanol), 500 ul 1 M CaCl _2, 500 ul 1 M MgSO ₄ und 12,5 ml KPO _4-Puffer (54,15 g KH ₂ PO ₄ und 17,8 g K ₂ HPO ₄ in 500 ml dH ₂ O), wie in ¹⁸ beschrieben.
6. Mit einer sterilen Pipetten, 10 ml Agar-Lösung zu jedem 60 mm Polystyrol-Petrischale. Lassen Sie die Medien bei Raumtemperatur erstarren overnight.

2) Herstellung von B Broth E. coli Medien

1. Um fünf 100 ml Kulturen machen, fügen Sie 5,0 g Bacto Tryptone, 2,5 g Hefeextrakt, 5,0 g NaCl in ein Becherglas.
2. In sterile, destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 500 ml. Die Lösung wird auf einer Heizplatte unter Rühren, bis die gelösten Stoffe aufgelöst haben.
3. Gießen Sie 100 ml Brühe B in fünf Glasflaschen (mindestens 200 ml Volumen).
4. Sterilisieren Sie die Lösungen durch Autoklavieren bei Normalbedingungen (121 psi, 120 ° C, 20 Minuten).
5. Erlauben B Brühe auf Raumtemperatur vor Gebrauch abkühlen.

3) C. Seeding elegans Wartung Plates

1. Nachdem man NGM-Platten bei Raumtemperatur für mindestens eine Woche getrocknet, zu inokulieren einem 100 ml B Kulturbrühe mit einigen Kolonien von E. coli (OP50).
2. Wachsen E. coli-Kultur bei 37 ° C über Nacht.
3. Pipette ein bis zwei Tropfen (ca. 10081, L) des OP50 Kultur auf die Mitte jedes NGM Platte. Die Platten werden in der Regel deckelseitigen gestapelt. Beim Pipettieren (Impfung), durch Pipettieren der Kultur auf die Platte an der Unterseite des Stapels zu beginnen. Arbeiten Sie sich jeden Stapel. Versuche nicht, die Platten nach der Aussaat zu bewegen, weil es wichtig ist, dass die Kultur nicht zu nahe an den Kanten der Platte erhalten.
4. Lassen Sie die gesetzte Platten bei Raumtemperatur für mindestens eine Woche trocknen, bevor Sie.
5. Gesetzt Platten gespeichert sind (invertiert) in versiegelten Plastikbehältern bei Raumtemperatur.

4) Die Aufrechterhaltung C. elegans Stämme

1. Um wohlgenährt C zu halten elegans hat, verwenden Sie einen Wurm holen, um drei oder L4s schwangeren Erwachsenen zu einer neuen, entkernt NGM Platte bewegen alle 3-4 Tage.
2. Shop Platten (invertiert) vorzugsweise in einem Brutschrank bei 15 – 22 ° C. Kulturen in den beschriebenen Assays wurden bei 20 ° C gelagert C. elegans Entwicklung ist temperaturabhängig. Wie Maintenance Temperatur zunimmt, nimmt Zeit zwischen Entwicklungsstadien.

5) Herstellung von CASO-Agar (TSA) E. faecalis Kultur Medien

1. Um 50 Platten zu machen, messen 500 ml sterilem, destilliertem Wasser in einen Kolben und zum Kochen bringen, unter Rühren auf einer Heizplatte.
2. 20 g pulverisierte TSA-Agar zu Kolben und erlauben Lösung zu lösen.
3. Sterilisieren Sie die Lösungen durch Autoklavieren bei Normalbedingungen (121 psi, 120 ° C, 20 Minuten).
4. Lassen Sie die Lösung auf 45 ° C in einem Wasserbad abkühlen.
5. Mit einer sterilen Pipetten, 10 ml Agar-Lösung zu jedem 60 mm Polystyrol-Petrischale. Lassen Sie die Medien, um über Nacht bei Raumtemperatur erstarren.

6) Herstellung von CASO-Bouillon (TSB) E. faecalis Kultur Medien

1. Um 250 Zellkulturröhrchen machen, messen 500 ml sterilem, destilliertem Wasser in einen Kolben und warm auf einer Heizplatte unter Rühren. </li>
2. In 15 g von TSB-Agar-Pulver in den Kolben und damit das Pulver aufzulösen.
3. Sterilisieren Sie die Lösungen durch Autoklavieren bei Normalbedingungen (121 psi, 120 ° C, 20 Minuten).
4. Anschließend Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, dann Pipette 2 ml in sterile 5 ml-Röhrchen.

7) Herstellung von Brain Heart Infusion (BHI) Medium mit Streptomycin, für E. faecalis Kultur

1. Messen Sie 500 ml sterilem, destilliertem Wasser in einen Kolben und zum Kochen bringen, unter Rühren auf einer Heizplatte.
2. In 26 g BHI-Medium in den Kolben und damit die Lösung aufzulösen.
3. Sterilisieren Sie die Lösungen durch Autoklavieren bei Normalbedingungen (121 psi, 120 ° C, 20 Minuten).
4. Anschließend Lösung auf 45 ° C in einem Wasserbad abgekühlt.
5. Mit einer sterilen Technik, fügen Sie 0,5 ml einer 10 mg / ml Streptomycin Stammlösung und Schwenken vermischen.
6. 10 ml der Lösung zu jedem 60 mm Polystyrol-Petrischale.
<li> Erlauben Medien über Nacht bei Raumtemperatur erstarren. Shop Platten (invertiert) bei 4 ° C bis ein paar Stunden vor dem Gebrauch.

8) Die Aufrechterhaltung E. faecalis Stämme

1. Um E. pflegen faecalis Aktien, eine sterile Schleife Streifen einzelnen Kolonien auf separate CASO-Agar (TSA) Platten.
2. Wachsen Kulturen bei 37 ° C über Nacht. Shop Platten (invertiert) in einer versiegelten Tüte oder Kiste bei Raumtemperatur mehrere Wochen.

9) vorbereiten E. faecalis Platten für EIW Assay

1. Impfen eine 2 ml TSB-Kultur mit einer Kolonie von E. faecalis beimpft und über Nacht bei 37 ° C
2. Je 20 ul E. faecalis Kultur auf die Mitte einer vorbereiteten BHI-Streptomycin Platte beimpft und über Nacht bei 37 ° C.

10) E. Vorbereitung coli Platten für EIW Assay (Control-Platten)

1. Impfen eine 100 ml B-broth Kultur mit einer Kolonie von E. coli OP50 und Inkubation über Nacht bei 37 ° C
2. Je 20 ul des OP50 Kultur auf die Mitte eines ungesetzte NGM Platte und damit die gesetzten Platten über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.

11) in Egg Worm Assay

1. Wähle 15-20 inszeniert-L4 C. elegans (Abbildung 1) auf die Mitte eines Rasens der Bakterien auf einem vorbereiteten BHI-Strep-E. faecalis Platte. Achten Sie darauf, nicht zu viel von OP50 zur BHI Platte übertragen. Wähle die gleiche Anzahl von L4s auf ein Steuersignal NGM-OP50 Platte.
2. Die Platten für 40 Stunden bei 20 ° C.
3. Es werden 20% Bleichmittel-Lösung. Mischen Sie eine handelsübliche Bleiche (6,0% Natriumhypochlorit) mit dem entsprechenden Volumen destilliertem Wasser.
4. In 10 ul Tropfen Bleichmittel-Lösung zu zehn verschiedenen Standorten auf einem Kunststoff-Deckel (von einem Wurm oder bakterielle Platte).
5. Mit einem Wurm Pick, zu übertragen, eine Schnecke in jedem Tropfen Bleichmittel. Vorsichtig schwenken die Spitze des EisbergsAbholung in der Bleiche Tröpfchen, um sicherzustellen, der Wurm hat sich das Ende der Wahl (zu bestätigen, indem Sie die Tropfen unter einem Binokular) gewaschen.
6. Lassen Sie die Nagelhaut für ca. 10 min oder auflösen, bis die Würmer aufplatzen, Vertreibung der Eier (Abbildung 2). Achten Sie darauf, Eier von der Platte zu übertragen.
7. Mit einem Binokular, zählen Sie die Eier in jedem Tropfen Bleichmittel.

Representative Results

Discussion

Die wichtigsten Schritte bei der erfolgreichen Durchführung dieses Tests sind: 1) mit wohlgenährt Bestände von C. elegans, 2) Kultivieren einzelne Arten von Bakterien auf der Assay-Platte, 3) genau identifiziert inszeniert L4 Würmer für die Exposition gegenüber E. faecalis, 4) halten Belichtungszeit auf E. faecalis konsistent über alle Studien und 5) Bleichen Zeit sollte nicht mehr als zehn Minuten, um Ei Zerfall zu verhindern.

Für diesen Test ist es wichtig, gesunde, gut genährte Würmer holen. Mütterliche Hunger beeinflussen kann Fruchtbarkeit und das Wachstum der Nachkommen ^19,20, daher ist es wichtig, dass Würmer wurden sehr gut für mehrere Generationen vor der Durchführung dieses Tests zugeführt. Ein gut gefüttert werden stock von Würmern wird einfach durch die Übertragung ein paar erwachsenen Würmer auf eine neue Platte ausgesät NGM alle 2-3 Tage gehalten. Zwei Tage vor dem Test sollte erwachsenen Würmern auf einem frischen Rasen OP50 platziert werden, um eine ausreichende L4 Nachkommen für den Assay haben.

<p class = "jove_content"> Es ist auch wichtig, dass EIW Assayplatten das Wachstum von nur einer einzigen Art von Bakterien zu fördern. E. faecalis Stämme wurden auf BHI-Platten gezüchtet. Streptomycin wurde zu den Platten gegeben, um gegen E. wählen coli OP50, die mit den L4 Würmer übertragen, wie sie von der Wartung NGM-Platten auf die Testplatten übertragen werden. OP50 wächst auch auf BHI-Platten. Wenn nicht gegen, C. ausgewählt elegans würde auf zwei Arten von Bakterien (E. coli und E. faecalis), während auf den Platten BHI zuzuführen. Die Stämme von E. faecalis in diesem Test verwendet werden, sind gegen Streptomycin. Wenn verschiedene Arten von Bakterien für diesen Test, einem anderen Antibiotikum, und vielleicht verschiedene Nährmedien verwendet wurden, sollten verwendet werden, um für die Bakterien der Wahl wählen und gegen E. coli OP50.

Präzise Auswahl inszeniert Würmer für diesen Test ist von entscheidender Bedeutung aus mehreren Gründen. Zunächst ist es wichtig, Ei Retention während t zählen er Zeit von Ei-Produktion / Verlegung in die Selbst-Düngung C. elegans. Eierproduktion tritt nur in den ersten fünf Tagen nach C. elegans Erwachsenenalter (Höchststand rund 40 Stunden nach der L4) und schnell sinkt danach ^4,21. Erwachsene Würmer leben im Durchschnitt zwei bis drei Wochen, so leben viele erwachsene Würmer für mindestens eine Woche, während nicht befruchtete Eier produzieren. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass die EIW Assay nicht auf unstaged erwachsenen Würmer unbekannten Alters durchgeführt.

Der zweite Grund ist es wichtig, zu bedienen inszeniert Tiere im EIW Assay ist so, dass die Zeit in der Entwicklung, bei der Würmer zu den Bakterien ausgesetzt waren, Toxin oder Drogen fest gesteuert wird. Kulturen von C. elegans sind in der Regel auf das Ei, L1 oder L4 Stadien synchronisiert. Die L4-Stadium wurde für diesen Test wegen der Besorgnis eingesetzt, dass längere Exposition gegenüber E. faecalis würde Letalität führen vor Würmern wurde schwangeren Erwachsenen.

Zelt "> Die Dauer der Zeit Würmer sind in der Bleich-Lösung übrig bleibt, ist auch wichtig, zu überwachen. Worms sollte in der Regel in weniger als zehn auflösen Minuten obwohl diesmal von Wurm Wurm variieren nicht. befruchteten Eier schließlich durch Bleichmittel gelöst, aber der Prozess langsamer ist als die Kutikula durch das Vorhandensein einer schützenden Eierschale. Die Eierschale beginnen, durch die Bleiche aufgelöst werden, wenn in der Lösung mehr als 10-15 min verlassen.

Egg Retention spiegelt das Gleichgewicht zwischen Ei-Produktion und Eiablage. Die EIW Test allein nicht unterscheiden, ob die Anzahl der Eier im Uterus zurückgehalten aufgrund von Veränderungen der Legeleistung oder Eiablage ist. Dies ist insbesondere ein Problem, wenn Viren mit einem Bakterienstamm oder Toxin behandelt weniger Eier als die in der Kontrollgruppe erhalten. In diesen Fällen vor allem, sollte ein Follow-up Brutgröße Test durchgeführt werden. Brood Größe Assays quantifiziert die Anzahl der Eier des Wurms über reproduktive Lebensdauer ⁴ festgelegten </sup>. Wenn die Brut Größe der Würmer in den Versuchs-und Kontrollgruppen gleich sind, dann Unterschiede in Ei Zurückbehaltungsrecht kann zu Unterschieden in Eiablageverhalten zugeschrieben werden. Da es unwahrscheinlich ist, dass schwach pathogene Bakterienstämme wie E. faecalis handeln würde die Eierproduktion zu erhöhen, ist es vernünftig anzunehmen, dass eine Erhöhung der Ei-Retention nach Exposition gegenüber E. faecalis (wie in 3 zu sehen) ist eine Folge der verminderten Eiablage Verhalten.

Die EIW Assay auch nicht bestimmen, durch welchen Mechanismus Bakterien Ei Retention verändern können. Es ist möglich, dass C. elegans kann Eier behalten, weil die pathogenen Bakterien wirkt Fütterung durch Kolonisierung in und die Blockierung der Mundöffnung oder weil es eine schlechte Nahrungsquelle ist. Es ist auch möglich, dass die Bakterien besiedeln und blockieren die Vulva Öffnung oder Einfluss auf die Funktion von Zellen in der Eiablage System. Eine weitere Analyse erforderlich ist, um den Mechanismus, durch whi bestimmench Ei Retention verändert wird.

Diese EIW Test kann leicht geändert werden, um die Auswirkungen von vielen Arten von Verbindungen auf Ei Retention zu bestimmen. Außerdem ist dieser Test einfach, dass es in ein Bild aufgenommen werden könnte, um Gene zu identifizieren, in entweder dem Host (C. elegans) oder Pathogens (E. faecalis), um den Effekt des Erregers erforderlich. Die EIW Assay kann auch zum Screening auf Gene zur Regulierung Eiablage selbst erforderlich sind. C. elegans Eiablageverhalten moduliert wird durch Neurotransmitter wie Serotonin und Acetylcholin ^5-9 und erfordert die koordinierte Aktivität von Neuronen und mehrere Muskelgruppen ^12. EIW Assays wurden und weiterhin verwendet werden, um Gene wichtig für Neurotransmitter-Signalisierung und / oder Muskel-Aktivität zu identifizieren. EIW Assays bieten quantitative statt qualitative Analyse eines wichtigen C. elegans Verhalten.

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
<em>C. elegans</em>, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for <em>C. elegans</em>	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for <em>E. faecalis</em>	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
<em>E. coli </em>(OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
<em>E. faecalis</em> strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
<p>all strains grew at 44.5 &ordm;C and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified&nbsp;<span style="line-height: 1.6em;">dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">(arabinose, mannitol, methyl-&alpha;-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">presumptive identification of all <em>E</em>. <em>faecalis</em> strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).</span></p>
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000