Methodenartikel

Optimierung und Nutzung von Agrobacterium Transient-vermittelte Proteinproduktion in Nicotiana

DOI:

10.3791/51204

⸱

19. April 2014

 ,  ,  , 
1Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transient Proteinproduktion in Pflanzen Nicotiana basierend auf Vakuum-Infiltration mit Agrobakterien Buchstart-Vektoren (Tabak-Mosaik-Virus-basierten) ist ein schneller und wirtschaftlicher Ansatz für Impfstoff-Antigene und therapeutische Proteine ​​zu produzieren. Wir vereinfacht das Verfahren und die verbesserte Ziel Akkumulation durch die Optimierung der Bedingungen von Bakterien Anbau, Auswahl Wirtsarten, und Co-Einführung von RNA-Silencing Unterdrücker.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agrobacterium-vermittelte transiente Proteinproduktion in Pflanzen ist ein vielversprechender Ansatz zur Impfstoffantigene und therapeutische Proteine ​​in kurzer Zeit zu produzieren. Allerdings ist diese Technologie erst am Anfang, um die Großproduktion, wie viele technologische Hindernisse, Scale-up aufgetragen werden nun überwunden werden. Hier zeigen wir eine einfache und reproduzierbare Methode für die industrielle transiente Protein-Produktion auf Basis von Vakuum-Infiltration von Nicotiana Pflanzen mit Agrobakterien Bucheinführung Vektoren. Optimierung von Agrobacterium Anbau in AB-Medium ermöglicht die direkte Verdünnung der Bakterienkultur in Milli-Q-Wasser, die Vereinfachung der Infiltrationsprozess. Unter drei getesteten Arten von Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) wurde als der vielversprechendste Host aufgrund der Einfachheit der Infiltration ausgewählt, die hohe Reporterprotein Produktion, und etwa zwei-falt höhere Biomasseproduktion unter kontrollierten Umweltbedingungen. Induktion von Agrobacterium pBID4-GFP (Tabak-Mosaik-Virus-Basis) unter Verwendung von Chemikalien wie Acetosyringons Monosaccharid und hatte keine Auswirkungen auf die Produktionsebene Protein. Eindringen Pflanze unter 50 bis 100 mbar für 30 oder 60 Sekunden zu einer etwa 95% Infiltration von Pflanzenblattgewebe. Infiltration mit Agrobacterium Laborstamm GV3101 zeigten im Vergleich zu Agrobakterien LBA4404 Laborstämme und C58C1 und Wildtyp-Agrobakterien-Stämme AT6, AT10, AT77 und A4 die höchste Proteinproduktion. Co-Expression einer viralen RNA-Silencing-Suppressor, p23 oder p19, in N. benthamiana führte in früheren Akkumulation und erhöhte Produktion (15-25%) des Zielproteins (Influenza Virus Hämagglutinin).

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Pflanzen werden nun als eine sichere, zuverlässige, skalierbare und kostengünstige Plattform für die Herstellung von heterologen rekombinanten Biopharmazeutika und industrielle Proteine ​​3.1 erkannt und haben wichtige Vorteile gegenüber mikrobiellen und tierischen Zellexpressionssysteme 4. Pflanzen sind in der Lage, korrekt gefalteten Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen, einschließlich montiert multimeren Antikörper 5-7 auszudrücken. Mehrere Pflanzen gewonnene rekombinante pharmazeutische Proteine ​​werden in der klinischen Evaluation 8. Dazu gehören Patienten-spezifischen rekombinanten Impfstoffe Idiotyp (scFv) für die Behandlung des Non-Hodgkin-Lymphom 9, Hämagglutinin-Basis-Pandemie und die saisonale Grippe-Impfstoff-Kandidaten 10,11 (Cummings et al., Um Impfstoff eingereicht), Anti-Streptococcus-Oberflächenantigen I / II-Antikörpers zur Behandlung von Zahnkaries 12 und Human-Insulin zur Behandlung von Diabetes 13. Außerdem menschlichen recombinant Glukozerebrosidase für die Enzymersatztherapie bei Patienten mit Gaucher-Krankheit hat in Israel und in den USA zugelassen und wird unter dem Expanded-Access-Programm außerhalb der USA 14,15 vorgesehen.

Heterologe Proteine ​​können in stabil transformierten (transgene oder transplastomischer) oder transient transformierte Pflanzen produziert werden. Transient Proteinherstellung bietet mehrere Vorteile gegenüber der Produktion in transgenen Pflanzen, einschließlich kurzer Zeit, um die Expression und Akkumulation 16 zu erreichen, und kann durch die Einführung von bakteriellen binären Vektoren oder rekombinanten Pflanzenvirusvektoren in Pflanzengewebe 4 erreicht werden. Das am weitesten fortgeschrittene transienten Expressionssystem beruht auf der Verwendung von "Start-Vektoren", die Komponenten von Pflanzenviren und binären Plasmide kombinieren und durch Agroinfiltration 17,18 geliefert basiert. Agroinfiltration von einem Startvektor auf Basis von Tabakmosaikvirus (TMV) wurde erfolgreich am Labor angewendetskalieren, um Impfstoffantigene gegen Krankheitserreger wie Human Papilloma Virus 19, Yersinia pestis 20 produzieren, Viren Influenza A 21,22, Bacillus anthracis 23 und Pocken-Virus 24 in N. benthamiana Blättern. Agrobacterium-vermittelte transiente Expression ist auch ein vielversprechendes Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von mehreren Proteinen 2,25-27. Zum Beispiel haben Pflanzen vorübergehende Expressionssysteme verwendet worden, um Tumor-spezifische rekombinante Antikörper 28,29, ein glycosyliertes rekombinantes Antikörpers gegen den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 30 und einen monoklonalen Antikörper, der für Anthrax-Schutzantigen 31,32 erzeugen. Co-Infiltration von Nicotiana benthamiana Pflanzen mit einer Ziel-Gen und Suppressor der Gen-Silencing führt zu einer erhöhten Expression des Zielproteins 33,34.

Agroinfiltration ist eine gängige Methode zur gleichmäßigen introduCING Bakterien beherbergen, ein Gen von Interesse in pflanzlichen Geweben 35-37. Vakuum-Infiltration von Agrobacterium für transiente Genexpression in intakten Pflanzenblättern ist eine schnelle, skalierbare und nützliche Methode für die Produktion von Fremdproteinen, ohne dass transgene Pflanzen 38-41 generieren. Während Vakuum Agroinfiltration werden die Pflanzen auf den Kopf gestellt und oberirdischen Teile in Agrobacterium-Suspension getaucht. Dann Vakuum angelegt, wodurch Gase aus Blattinterzellulären Räumen durch Spaltöffnungen zu evakuieren. Schnelle Wieder Druckbeaufschlagung nach Freigabe des Vakuums führt die Infusion von Agrobacterium-Suspension in das Blatt. Nach Vakuuminfiltration von Agrobakterien werden die Pflanzen weiter kultiviert und Zielausdruck wird überwacht. Die höchsten Zielausdruck werden in der Regel 2-3 Tage nach beobachtet Infiltration (dpi) mit einer binären Vektor und 4-7 dpi bei einer Einführung Vektor, nach der das Expressionsniveau in der Regel abnehses 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens ist der am häufigsten verwendete Träger für die Abgabe eines Gens von Interesse in eine Anlage zur Herstellung von Proteinen. Agroinfiltration funktioniert außerordentlich gut in N. benthamiana aber relativ schlecht in den meisten anderen Pflanzen, darunter 46 Arabidopsis thaliana.

In dieser Studie wurde ein einfaches, effizientes und wirtschaftliches Verfahren für die transiente Proteinproduktion in 5-6 Wochen alten N. entwickelten wir benthamiana mit A. tumefaciens Infiltration. Der Hauptnachteil von Industrie Skalierung der Agroinfiltration Technik ist die Zentrifugation der geernteten Bakterien und Resuspension des Bakterienpellets in einem Medium, 4'-Hydroxy-3 ', 5'-Dimethoxyacetophenon (Acetosyringon) Monosaccharide, und 2 - (N-Morpholino) -ethansulfonsäure (MES)-Puffer für die Induktion der vir-Gene. Wir waren in der Lage, diese Probleme durch die Optimierung der Agrobacterium überwinden Wachstum in AB-Medium (Minimalmedium), gefolgt von Verdünnung direkt in Milli-Q-Wasser und durch Steuern der Infiltrationszeit und Bedingungen. Wir haben auch Zielprotein-Produktion im Vergleich zu dem Wildtyp-Tabakwirtsarten N. benthamiana und N. Holzwolle, als auch in Hybrid N. excelsiana.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Plant Growing

Für die Folgeagroinfiltration werteten wir zwei Wildtyp Nicotiana-Arten (N. benthamiana und N. excelsior) und ein Hybrid (N. excelsiana) hydroponically auf Steinwolle in Indoor-Anlagen gewachsen.

  1. Genießen Steinwolle-Platten in einer Anlage Düngerlösung.
  2. Aussaat der Samen von Wildtyp N. benthamiana, N. Holzwolle und N. excelsiana (Hybrid von N. benthamiana × N. excelsior) auf die Nährstoffe getränkten Steinwolle Oberfläche.
  3. Wachsen Pflanzen aus den Samen unter kontrollierten Bedingungen (24 ° C und 40-65% relativer Luftfeuchtigkeit) und eine langfris Tag Photoperiode (14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit, mit Beleuchtung von 130-150 uE m -2 s -1) für 4-5 Wochen für N. benthamiana und N. excelsiana und 5-6 Wochen für N. Excelsior.

2. Konstruktion von Vektoren für AgroinfiltratIon

  1. Setzen Sie einen synthetischen Reporter-Gen (green fluorescent protein [GFP]), in voller Länge Hämagglutinin (HA) aus dem A/California/04/2009 Stamm von Influenza-Virus (HAC1) und re-engineered Lichenase Enzym (LicKM) 18 getrennt in die Einführung Vektor pBID4 18 (TMV-basierten Vektor) zu pBID4-GFP, pBID4-HAC1 und pBID4-LicKM bzw. 18,32,41,47 erhalten.
  2. Führen 10-50 ng pBID4 Durchführung GFP oder HAC1 in elektro Zellen von A. GV3101 und LicKM in elektro Zellen von A. tumefaciens-Stämme GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, AT77 und A4 mit dem Gen MicroPulser Elektroporator.
  3. Verwenden Sie die transformierte Agrobakterien zur Infiltration Experimente sofern nicht anders angegeben.

3. Vakuum-Infiltration von Agrobacterium in Nicotiana Pflanzen

  1. Wachsen A. tumefaciens-Stämme über Nacht (O / N) in LB-Medium, YEB med.ium-oder AB-Medium mit 50 mg / l Kanamycin bei 28 ° C mit 200 bis 250 Umdrehungen pro Minute zittern.
  2. Verdünnen Agrobakterien in Milli-Q-Wasser auf eine optische Dichte bei 600 nm (A 600) von 0,5 oder Zentrifuge Agrobacterium-Zellen in LB oder YEB oder AB bei 4.000 × gezüchtet g für 10 min bei 4 ° C, Resuspendieren in Induktionsmedium (1 x MS-Salz, 10 mM MES, 200 &mgr; M Acetosyringon, 2% Saccharose [MMA]), um eine 600 von 0,5, gegeben und bei Raumtemperatur für 1-3 h, sofern nicht anders angegeben.
  3. Infiltrieren Pflanzen in einer Vakuumkammer durch Eintauchen Pflanze Nicotiana Luft Gewebe in Agrobacterium-Suspension und Auftragen einer 50-400 mbar Vakuum für 30 oder 60 Sekunden. Die optimale Infiltration wird routinemäßig bei 50-100 mbar für 60 Sekunden aufgebracht.
  4. Sobald das Vakuum gebrochen ist, entfernen Sie Pflanzen aus der Vakuumkammer, in Wasser abspülen, und wachsen für 5-7 Tage unter den für Pre-Infiltration Wachstum verwendet gleichen Wachstumsbedingungen.
  5. Um die Wirksamkeit zu testenChemikalien induzieren Agrobacterium vir-Gen, verschiedene Konzentrationen von Acetosyringon (0, 100, 200 oder 400 &mgr; M) zu der Agroinfiltration in Puffer (1x MS, 10 mM MES, 2% Glucose) zugegeben. Um den Effekt der Induktion von Monosaccharid zu vir-Gen verschiedenen Prozentsätzen von Glucose (0, 1, 2 oder 4%) wurden in Agrobakterien zugesetzt N. in der Infiltrationspuffer (1x MS, 10 mM MES, 200 &mgr; M Acetosyringon) suspendiert. benthamiana Pflanzen wurden infiltriert, wie oben in den Schritten 3.3 und 3.4) erwähnt.
  6. Agrobacterium-Stämme GV3101 Labor, C58C1 und LBA4404 und Wildtyp-Stämme A4, AT06, AT10 und AT77 beherbergen die pBID4 LicKM-Vektor wurden in Milli-Q-Wasser auf A 600 von 0,5. N. verdünnt benthamiana Pflanzen wurden mit jedem einzelnen Stamm, wie oben in den Schritten 3.3 und 3.4 genannten infiltriert.

4. Co-Agroinfiltration Verfahren für die Viral Silencing Suppressor

  1. Mix die Milli-Q-Wasser verdünnt Agrobacterium GV3101 Kulturen trägt das GFP-Gen und den viralen Silencing-Suppressor p19 Tomaten buschigen Stunt-Virus (TBSV) 1:1, 2:1, 3:1 und 4:1-Verhältnisse. Infiltrieren N. benthamiana-Pflanzen, wie oben beschrieben.
  2. Infiltrieren N. benthamiana Pflanzen mit einer Mischung von zwei Milli-Q-Wasser verdünnt Agrobacterium GV3101 Kulturen: Die erste Durchführung der pBID4 HAC1-Plasmid und die zweite Durchführung einer der Silencing-Unterdrücker - p19 oder p23 der TBSV von Citrus-Tristeza-Virus, in der pCassp Plasmid ( pCassp19) und PGR binäre Plasmid unter der 35S-Promotor (PGR-P23) verbunden sind, im Verhältnis 4:1 ist.

5. Western-Blot-Analyse

  1. Sammeln Zufallsblattproben von N. benthamiana, N. Holzwolle oder N. excelsiana Pflanzen bei 4-7 dpi pulverisieren und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver.
  2. In drei Bänden 1x PBS-Puffer, 0,5% TritonX-100 zu jeder Probe.
  3. Schütteln Sie die extrahierten Proben für 15 min bei 4 ° C
  4. Drehen Sie das Extrakt für 5 min und sammeln gesamten löslichen Proteins in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen.
  5. Verdünnen Sie die Extrakte einer geeigneten Verdünnung (1:50 1:100) in 1x PBS Extraktionspuffer, und mit 5 × Probenpuffer (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% Bromphenolblau, 50% Glycerin v / v, und 500 mM DTT) bis zu einer endgültigen Konzentration 1 ×.
  6. Kochen Sie die Proben für 5 min.
  7. Separate Proteine ​​durch 10% SDS-PAGE, Transfer auf Immobilon-P Transfermembran und der Block mit 0,5% I-Block.
  8. Erkennen GFP unter Verwendung von Kaninchen polyklonalen Anti-GFP-Antiserum bei 1:5.000 und HAC1 mit Maus-Anti-Poly-Histidin monoklonalen Antikörper bei 1:1000 in Blockierungslösung für 1 Stunde.
  9. Nach der primären Antikörpermarkierung, waschen Sie die Membranen dreimal für 10 min mit jeweils 1 × PBST-20 und Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Anti-Kaninchen-Antikörper bei 1:5000 oder eine HRP-Konjugatd-Anti-Maus-Antikörper bei 1:10.000 1 h, für GFP und HAC1 Erfassungs sind.
  10. Prozess Western-Blots mit dem Supersignal West-Pico Chemilumineszenz Substrat.
  11. Verwenden Sie die Genetools Software der Bandenintensität des Proteins zu analysieren und zu erhalten, die Band kalibriert Menge.

Proteinproduktion: (kalibrierte Menge x Verdünnung der Probe) / Probenmenge geladen) x 4 = mg / kg.
Gleichung: Protein-Produktion (P), kalibrierte Menge (C), Verdünnung der Probe (D) und die Menge der Probe geladen (S).

6. Zymogramm Assay

  1. Sammeln pBID4-LicKM-infiltriert N. benthamiana Zufallsgewebeproben.
  2. Extrahieren von Proteinen unter Verwendung der gleichen oben für Western Blot-Analyse beschriebenen Verfahren und dann durch 10% SDS-PAGE-Analyse mit 0,1% Lichenan in den Gelen enthalten.
  3. Nach der Elektrophorese, waschen Sie die Gele zweimal für jeweils 10 Minuten in Waschpuffer (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] und 0,1% Triton X-100) Und dann inkubiert in Waschpuffer bei 65 ° C für 1 Stunde.
  4. Nach der Inkubation der Waschpuffer verworfen und färben die Gele mit 0,5% Kongorot für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Dreimal Spülen der Gele in Milli-Q-Wasser für jeweils 10 min, und fügen Sie 1 M NaCl auf Lichenase Aktivität visualisieren. Die gereinigte bakterielle Lichenase Protein wurde als positive Kontrolle für die Enzymaktivität verwendet.

7. GFP Imaging

  1. Führen visuellen Nachweis von GFP-Fluoreszenz ganz transient transformierten Pflanzen mit einer Handlangwelligen UV-Lampe.
  2. Foto transient transformierten Pflanzen mit einer Digitalkamera über einen Yellow 8, ES 52 Filter (Belichtungszeit 15 s).
  3. Erhalten Sie Bilder von Western-Blot-Analysen unter Verwendung der Software auf einem GeneSnap GeneGnome und zu quantifizieren, die Ergebnisse mit Hilfe der Genetools-Software, mit einer Eichkurve auf Basis gereinigt GFP-Standard.
  4. Quantifizierung HAC1-Protein unter Verwendung einer Eichkurve basierend auf Abreinigunged HAC Proteinstandard aus der A/Indonesia/05/05 Stamm von Influenza-Virus.
  5. Berechnen Mittelwerte 3-4 Wiederholungen für alle Experimente.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nährstoffbedarf für das Pflanzenwachstum. Die Verwendung von Hydrokultur-Pflanzenwachstumsmedium (Rockwool) und Nährstoff-Lösung gewährleistet Einheitlichkeit der N. benthamiana Wachstum und beseitigt Komplexitäten (mechanisch, regulatorischen und Effizienz) mit der Verwendung von Boden für die Pflanzenzucht verbunden. Wir wuchsen N. benthamiana auf Steinwollmatten in handelsüblichen Düngemittel getränkt, um die optimalen Bedingungen für das Pflanzenwachstum und die Akkumulation von Biomasse zu bestimmen. Wir haben beobachtet, 95-100% Keimung der Samen. Man sollte beachten, dass darunter Phosphor ist entscheidend, um die Keimung zu erreichen, weil wir fanden, dass Nährlösung fehlt Phosphor versäumt, Keimung und Wachstum von N. unterstützt benthamiana Samen (Abbildung 1A).

Auswirkungen von Agrobacterium Wachstum und Infiltration Medien auf die Pflanzengesundheit und die Proteinproduktion. Wir haben mehrere Medien Bedingungen getestet, um die Effizienz zu optimieren ter Agroinfiltration Technik für die Großproduktion. Bakterien (A. tumefaciens GV3101 Stamm) beherbergen die pBID4-GFP-Konstrukt wurden in verschiedenen Medienbedingungen (YEB, LB oder AB) kultiviert O / N und entweder zentrifugiert und in Induktionsmedium (MMA) (mit 1 × Murashige & re-suspendiert Skoog [MS] Basalsalzmischung, 10 mM MES pH 5,6, 20 g / l Saccharose und 200 uM Acetosyringon) oder in Milli-Q-Wasser auf A 600 von 0,5 vor der Verwendung von Pflanzen Infiltration verdünnt. Wir beobachteten, dass Vakuum-Infiltration von Pflanzen mit Bakterien in Wasser verdünnt führte zu Proteinproduktion vergleichbar, die mit jeder Infiltration Medien in früheren Berichten 42,48 erreicht. Im Gegensatz dazu Infiltration mit Agrobakterien in YEB unverdünnt oder LB-Medium gezüchtet führte zu einer vollständigen Welken der N. benthamiana Blätter in weniger als 24 Stunden nach der Infiltration, während unverdünnt Agrobakterien in AB-Medium keine Auswirkungen auf die Gesundheit der Pflanzen infiltriert hatte (datein nicht gezeigt). Wie in 1B dargestellt ist, Pflanzen mit Agrobacterium-Kulturen in YEB, LB oder AB-Medium gezüchtet und mit Milli-Q-Wasser (1:5, 600 A von 0,6-0,8 oder 1:10, A 600 von 0,3-0,4) zeigte verdünnt infiltriert keine Symptome und wiesen eine durchschnittliche GFP-Produktion von 1645, 1520 und 1839, beziehungsweise. Agrobakterien zentrifugiert und in Induktionsmedium resuspendiert (MMA) zeigten keine Symptome und keinen signifikanten Unterschied in der Proteinproduktion im Vergleich zu Agrobakterien in Milli-Q-Wasser verdünnt direkt ( 1671 ± 102 und ± 131 1.667 mg / kg). Deshalb wird Milli-Q-Wasser für die Agrobacterium-Kulturen für Pflanzen Infiltration Verdünnung empfohlen und wurde routinemäßig in unserem nachfolgenden Experimenten verwendet, um eine A 600 von 0,5 zu erreichen.

Auswirkungen von Agrobacterium-Suspension Zelldichte und Zeit Kurs auf Zielausdruck. Nächstes untersuchten wir, ob Bakterienzelldichtebeeinflusst die Effizienz der Infiltration und der Zielexpressionsniveaus. Hierzu untersuchten wir vier verschiedene Zellsuspensionsdichten von Agrobacterium Durchführung pBID4-GFP, A 600 von 1,0, 0,5, 0,1 und 0,05. Nach Infiltration, N. benthamiana Pflanzen wurden auf sichtbare Symptom Entwicklung und Zeitverlauf der Zielausdruck durch das Sammeln von Proben bei 4, 7 und 10 dpi überwacht. Bei 4 dpi beobachteten wir deutliche Unterschiede in GFP-Fluoreszenz unter den Pflanzen mit unterschiedlichen Zelldichten von Agrobacterium-Suspension infiltriert (keine GFP-Expression wurde bei A 600 von 0,05 beobachtet). Um 7 dpi, GFP-Fluoreszenz war in Pflanzen am Zellsuspension Dichten von A 600 1.0, 0.5 und 0.1 infiltriert, aber niedriger war in Pflanzen an einem A 600 von 0,05 infiltriert. Wie in 1C gezeigt, wurden diese Daten durch Western-Blot-Analysen bestätigt der Proben bei 4 dpi gesammelt, welche sehr niedrige Proteinproduktion bei einem 600- 600 von 1,0 (1.739 mg / kg). Um 7 dpi, Pflanzen zeigten keine signifikanten Unterschiede in den geschätzten GFP-Produktion bei A 600 von 1,0, 0,5 und 0,1 (1662, 1870 und 1890,), während die A 600 von 0,05 zeigten geringere GFP-Produktion (1.199 mg / kg). Im Gegensatz dazu ist bei 10 dpi keine Unterschiede in der GFP-Produktion wurden unter den Pflanzen mit einem der vier Zellsuspension Dichten (1.218, 1.181, 1.197 und 1.304) infiltriert beobachtet.

Infiltration mit alternativen Stämme von Agrobacterium. Um die Vielfalt der Agrobacterium-Stämme für transiente Protein-Produktion zur Verfügung zu erhöhen, haben wir getestet, Wildtyp-Isolaten. Diese Stämme, von der Krone-Galle der natürlichen Wirten isoliert wurden freundlicherweise von Dr. Gelvin (Purdue University, West Lafayette, Indiana) zur Verfügung gestellt. Um ihren Nutzen in transienten Protein-Produktion zu untersuchen, wir infiltriert N. benthamiana mit den folgenden Stämme carrying pBID4-LicKM 18: A. rhizogenes (A4) und A. tumefaciens-Wildtyp-Stämme Nester A348, A208, A281 und (benannt AT6, AT10 und AT77, beziehungsweise), sowie technisch Laborstämme von A. tumefaciens GV3101, C58C1 und LBA4404. Die infiltrierten Blätter wurden bei 7 dpi gesammelt und das Niveau der LicKM Expression wurde durch Western-Blot-Assay bestimmt. , Wie in 2A, der höchsten Ebene der LicKM Produktion gezeigt mit der Stämme GV3101, A4 und LBA4404 (~ 1.750 ± 163, 1650 ± 26 und 1450 ± 117 mg / kg), mit leichten Unterschieden erreicht werden die unterste Ebene der Ausdruck (~ 900 ± 102 mg / kg) mit C58C1; und Zwischen Produktion mit AT6, AT10 und AT77 (~ 1.250 ± 19, ± 42 und 1100 ± 111 1.200 mg / kg). Die Lichenase enzymatische Aktivität wurde mit Zymogramm Test gezeigt. 2B zeigt, dass in Lichenase infiltrierten Pflanzengewebe mit einer der die erzeugteAgrobacterium-Stämmen war enzymatisch aktiv. Man sollte auch beachten, dass N. benthamiana Pflanzen mit A4 und infiltriert AT77-Stämme zeigten Krankheitssymptome (Wachstumsstörungen, Blattstiel Dehnung und Eisstockschießen, Curling und Blatt), während mit AT10 belasten die Symptome waren mild. Keine Symptome wurden in N. benthamiana Pflanzen mit Laborstamm GV3101 (2C) infiltriert beobachtet.

Infiltration von alternativen Nicotiana-Arten. Wir verglichen die Preise von Biomasseerzeugung und Proteinproduktion in zwei Wildtyp-Arten der Gattung Nicotiana (N. benthamiana und N. excelsior) und in einer Hybrid-Arten, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior). Von den getesteten Arten, N. benthamiana, eine weit verbreitete Host für transiente Proteinproduktion unter Verwendung von Agrobacterium-basiert oder auf Viren basierenden Expressionssysteme 2,34,49, erreicht Infiltration Bereitschaft innerhalb von 4-5 Wochen nach der Keimung. Die notwendige Wachstumsperiode, um die optimale Höhe der Biomasse zu erzeugen, ist auch 4-5 Wochen für N. excelsiana aber länger (6-7 Wochen) für N. Excelsior. Darüber hinaus ist für N. relativ kurz sind die Pflanzen Internodien Holzwolle im Vergleich zu anderen Nicotiana-Arten.

Außerdem beobachteten wir, dass die Vakuuminfiltration von N. benthamiana und N. excelsiana bei 50-250 mbar für 60 Sekunden ist hoch effizient für Agroinfiltration von ganzen Blättern, während N. Holzwolle ist schwierig, aufgrund ihrer geringeren Baldachin und ledrigen Blättern infiltrieren, selbst wenn ein Vakuum wurde dreimal für jeweils 1 min in Gegenwart von nicht-ionische Tenside, wie Sillwet-77 oder S240 angewendet. Auch die Keimfähigkeit von N. excelsiana und N. excelsior Samen war ~ 40-50%; um die Keimrate 90-100% zu erhöhen, müssen Samen mit 10% blea behandelt werdench 1 Stunde vor Aussaat. Unter den gleichen Wachstumsbedingungen, dem höchsten Blattbiomasse, die aus N erzeugt werden kann, excelsiana etwa zwei-fach höher im Vergleich zu N. benthamiana (Tabelle 1).

Die Proteinproduktion wurde in N. untersucht benthamiana, N. Holzwolle und N. excelsiana mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101 beherbergen pBID4-GFP infiltriert. GFP-Akkumulation wurde bei 7 dpi ganz infiltrierten Blätter mit UV-Licht, gefolgt von Western-Blot-Analyse untersucht. 3A zeigt eine gleichmäßige Verteilung von GFP in N. benthamiana und N. excelsiana und ungleiche Verteilung in N. Holzwolle (aufgrund einer Schwierigkeit der Infiltration einer gesamten Blattfläche von N. excelsior). 3B zeigt die Höhe der GFP-Produktion durch UV-Licht leuchten in infiltrierten Blätter von den drei Nicotiana-Arten bei 7 dpi gesammelt geschätzt. Die GFP kumuliertennung Ebene war in N. höher benthamiana (~ 2,23 g / kg) als N. excelsiana und N. Holzwolle (~ 1,89 und 1,54 g / kg). Das niedrige Niveau der Proteinproduktion in N. Holzwolle ist aufgrund der ungleichmäßigen Verteilung der Infiltration und angesammelt GFP in der gesammelten Blatt.

Wir beobachteten, dass oberen Blätter direkt dem Licht ausgesetzt zeigen oft die frühesten und höchste transiente GFP Ansammlung (bei 2-4 dpi) als Blätter unter dem Vordach. Doch in unserer Studien war GFP-Akkumulation der höchste bei 7 dpi und gleichmäßig über die meisten Blätter verteilt, mit Ausnahme uninfiltriert neu wachsenden Blätter, die keine GFP-Akkumulation zu zeigen.

Auswirkungen von Unterdruck und Dauer auf die transiente Proteinproduktion. Vacuum Infiltration erhöht transiente Expressionsniveaus im Vergleich zu Druck von Hand Injektion mit einer nadellosen Spritze 42 angelegt. Die Anwendung einerVakuum bewirkt, dass Gase aus Unterwasserpflanze Blätter durch Spaltöffnungen zu evakuieren. Wenn das Vakuum unterbrochen und der Druck rasch ansteigt, wird die Suspension von Agrobacterium in die Blätter getrieben, um die evakuierten Gase 50 zu ersetzen.

Um die Wirkung von Unterdruck auf den Blättern von N. testen benthamiana infiltriert wir Pflanzen mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101 beherbergen pBID4-GFP unter verschiedenen Vakuum-Druck (50 bis 400 mbar) für 30 oder 60 Sekunden. Es wurde gezeigt, dass die stärkere Vakuum (unter 50 mbar) angelegt für 30 oder 60 Sekunden resultiert in mechanische Beschädigung des infiltrierten Blätter, kurz nach der Infiltration (24-48 Stunden), was zu Gewebe Verwelken und Absterben der Pflanze. Andererseits ist die Anwendung der milderen Vakuum (400 mbar) ergibt Infiltration von nur 50% der Blattfläche und einem verminderten Maß an GFP-Produktion (303 ± 90 mg / kg) (Fig. 4A). Wichtig ist, nach 50, 10 beobachteten wir keine Unterschiede in der GFP-Produktion0 und 200 mbar (1651 ± 107, 1688 ± 40, 1594 ± 26 mg / kg) (4A) und leichte bis keine nachteilige Auswirkungen auf die Pflanzengesundheit beim Unterdrücken von 50 bis 200 mbar wurden für 30 oder 60 angewendet sek. Daher wird von 50 bis 100 mbar Unterdruck für die Infiltration Experimente empfohlen.

Die Wirkung der Dauer der Vakuum auf Ziel-Expression wurde durch die Infiltration einer Flach von N. bewertet benthamiana Pflanzen jede Stunde mit einem A 600 von 0,5 von GV3101 beherbergen pBID4 -. GFP für 8 h in der gleichen Agrobacterium Kultur 4B zeigt, dass das Niveau der GFP-Produktion war ähnlich auf Allzeitpunkten bis zu 8 Stunden, was darauf hindeutet, dass über diese Zeit, die der Agrobacterium behält seine Fähigkeit, ein Einzelstrang-DNA zu starten.

Wirkung von chemischen Induktion auf die Proteinproduktion. Bestimmte pflanzliche phenolische Metaboliten und Zucker kann induce Virulenz-Gene von A. tumefaciens 1,52. Als Folge sind viele Chemikalien und monosaccharaides berichtet transienter Protein-Produktion in verschiedenen Pflanzenarten zu verbessern. Acetosyringon wird üblicherweise zu Kulturen von A. hinzugefügt tumefaciens, das vir-Operon vor Agroinfiltration 40,53-57 induzieren.

Wir haben die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von Acetosyringon (0, 100, 200 und 400 &mgr; M) und Glucose (0-4%) auf die transiente GFP-Protein-Produktion in N. beurteilt benthamiana infiltriert mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101 beherbergen pBID4 - GFP. Zu diesem Zweck wir resuspendiert Agrobacterium-Zellen in MMA Induktionsmedium enthaltend unterschiedliche Konzentration von Acetosyringon und Glucose für 1-3 Stunden vor der Infiltration. Nach den Ergebnissen von sowohl visuelle Beobachtung (Daten nicht gezeigt) und Western-Blot-Analyse (Fig. 4C), keines der getesteten Konzentrationdieser Verbindungen führte zu einer signifikanten Zunahme der GFP-Fluoreszenz und Proteinproduktion im Vergleich zu Kontroll dem Induktionsmedium enthielt kein Acetosyringons oder Glucose.

Wirkung von Co-Infiltration eines Silencing Suppressor auf transiente Produktion von GFP und HAC1 Gene in N. benthamiana Blätter. Es wurde bereits gezeigt, dass die gleichzeitige Expression eines Silencing-Suppressor (p19 Tomaten buschigen Stunt-Virus [TBSV]) stört posttranskriptionale Gen-Silencing (PTGS), was zu einer erhöhten Produktion von Reporter-Proteine ​​34.

Wir haben die Wirkung von Co-Infiltration von N. ausgewertet benthamiana mit der Einführung Vektor, der GFP-Reporter-Gen (pBID4-GFP) und p19. Vor der Infiltration, ein A 600 von 0,5 Verdünnungen von A. tumefaciens GV3101 Kulturen beherbergen pBID4-GFP und p19 wurden jeweils in Verhältnissen von 1:1, 2:1, 3:1 und 4:1. Express gemischtIonen der Silencing-Suppressor durch den Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor kontrolliert. Wie die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse bei 7 dpi (5A) angedeutet, hat die Anwesenheit von p19 nicht erhöhen oder verringern GFP-Produktion in N. benthamiana, in einem beliebigen Verhältnis der beiden Agrobacterium Suspensionen.

P23and p19 - - zur Prävention von PTGS für HAC1 Wir haben auch die Wirkungen von zwei viralen Gen-Silencing-Unterdrücker verglichen. Kulturen von Agrobacterium-Vektor trägt die Einführung pBID4 HAC1-(H1N1 A/California/04/2009) und einem der beiden viralen Silencing-Suppressor-Plasmide wurden in einen A 600 von 0,5 verdünnt, in einem Verhältnis von 4:1 gemischt sind, und in 4-5-Wochen alte N. gemeinsam infiltriert benthamiana. Eine Suspension von A. tumefaciens mit pBID4 - HAC1 allein wurde als Kontrolle infiltriert. Die infiltrierten Blattproben wurden 3 bis 8 dpi gesammelt. Das Experiment war repeATED dreimal und Durchschnittswerte der HAC1 Expression durch Western-Blot-Analyse bestimmt.

Wie in 5B, Co-Infiltration von N. nachgewiesen benthamiana mit p23 oder p19 führte zu (642 ± 157 und 764 ± 108 mg / kg) einen Anstieg der Produktion im Vergleich mit HAC1 ohne Verwendung Silencing Suppressor (ca. 15-25%, respectively) bei 6 dpi. Dies legt nahe, dass p23 und p19 sind effizient in unserem System. Es sollte jedoch angemerkt, dass die Akkumulation von HAC1 aufgetreten einen Tag früher als pBID4-HAC1 wurde mit p19 co-infiltriert werden. Daher zeigen unsere Ergebnisse, dass die Wirkungen der Silencing-Suppressor p19 auf HAC1-und GFP-Akkumulation sind unterschiedlich, was darauf hindeutet, selektive Verstärkung der transienten Expression und / oder Stabilität einiger Proteine ​​in N. benthamiana.

Wir beobachteten auch, dass sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit eines Silencing-Suppressor der Pegel des HAC1-Proteins production begann zu sinken auf 7 dpi. Dies zeigt, dass der Zeitpunkt der Abnahme der transienten Protein-Produktion in N. benthamiana mit der Einführung Vektor infiltriert ist zielspezifisch.

Die Zellbank des Agrobacterium-Vektor wurde die Einführung jedes Jahr für Zielgens Stabilität, Agrobacterium Lebensfähigkeit und der Ebene der Proteinakkumulation bewertet. Das Glycerin Lager der Zellbank des GV3101 Stamm mit pBID4-HAC1, die bei -80 ° C gelagert wurde, verändert hat sich gezeigt, dass für mehr als drei Jahren als sehr stabil, ohne Veränderungen in der Höhe von transienten Protein-Produktion in infiltrierten N. benthamiana Pflanzen. 5C zeigt, dass die HAC1 Proteinproduktion durch Western-Blot in den Jahren 2010, 2011, 2012 und 2013 geschätzt, war 670, 685, 566 und 683 mg / kg. Die durchschnittliche HAC1 Produktion in N. benthamiana Pflanzen war 651 ± 49,4 mg / kg.


Tabelle 1. Vergleich von N. benthamiana und N. excelsiana pflanzlicher Biomasse-Produktion.

figure-results-1
Fig. 1 ist. Western Blot-Analyse der transienten Genexpression in N. benthamiana. (A) Sechs Wochen alten N. benthamiana 1) Pflanzen wachsen in einem Düngerlösung, die 4,8% Phosphor und 2) Pflanzen wachsen in einem Düngerlösung mit 0% Phosphor. Fünfundzwanzig ug frisches Blatt Gewichtsäquivalent wurden pro Spur in Anlagen mit Vakuum infiltriert pBID geladen. (B) Vergleich der GFP-Produktion4-GFP-tragenden Agrobacterium GV3101 Kulturen in drei verschiedenen Medien gezüchtet: YEB, AB und LB. GV3101 Kulturen gezüchtet O / N in YEB oder LB-Medien wurden bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und in Induktionsmedium resuspendiert (MMA) (Spuren: MMA-1-und MMA-2 bezeichnet), oder gewachsen O / N in YEB, LB oder AB Medien und direkt bis 1:5 oder 1:10 mit Milli-Q-Wasser verdünnt (Spuren: YEB / 5 und YEB/10; AB / 5 und AB/10; LB / 5 und LB/10) (C) Vergleich. der GFP-Expression nach 4, 7 und 10 dpi folgenden Vakuuminfiltration mit verschiedenen Konzentrationen (A 600 von 1,0, 0,5, 0,1 und 0,05) von A. tumefaciens GV3101 Stamm, pBID4-GFP.

figure-results-2
Abbildung 2. Vergleich der transienten Lichenase Produktion und Aktivität nach Vakuuminfiltration von N. benthamiana Pflanzen mit untermieten Stämme von Agrobakterien. Kulturen von Agrobakterien-Stämme (GV3101, A4, AT77, C58C1, AT6, AT10 und LBA4404) beherbergen, die Markteinführung Vektor-pBID4 LicKM wurden einzeln in Blätter von N. infiltriert benthamiana. Infiltrierten Blätter wurden bei 7 dpi gesammelt. (A) Lichenase Produktion durch Western-Blot quantifiziert. (B) Zymogramm Assay demonstriert Lichenase Produktion durch enzymatische Aktivität. (C) Effekt von Agrobacterium (Wildtyp A4, AT10, AT77 und Laborstamm GV3101) Infiltration auf N. benthamiana Pflanzengesundheit bei 7 dpi. Fünfundzwanzig ug frisches Blatt Gewichtsäquivalent wurden pro Spur geladen.

figure-results-3
3. Transient GFP-Expression in Blättern von N. benthamiana, N. und N. excelsiana excelsior bei 7 dpi nach Vakuuminfiltration mit A. tumefaciens beherbergen die Einführung Vektor pBID4 - GFP. (A) Die visuelle Untersuchung der GFP-Expression unter UV-Licht. (B) Western-Blot-Analyse der GFP-Akkumulation.

figure-results-4
Abbildung 4. (A) Auswirkungen von Unterdruck auf die transiente GFP-Expression und Pflanzengesundheit. N. benthamiana Pflanzen wurden mit pBID4 infiltriert -. GFP unter Vakuumdruck von 400, 200, 100 oder 50 mbar, bei Vakuumhaltezeit von 30 oder 60 Sekunden (B) Stabilität und Infektiosität von A. tumefaciens in N. benthamiana infiltriert mit Agrobacterium GV3101 beherbergen pBID4-GFP in AB-Medium und einem A 600 von 0,5 verdünnt. Agroinfiltration wurde durch die Infiltration einer Wohnung von N. durchgeführt benthamiana Pflanzen pro Stunde in der gleichen verdünnten Agrobacterium-Kultur (Bahnen 0-8). (C) Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von Acetosyringon und Glucose auf eine transiente Expression von GFP. Der Agrobacterium-Stamm GV3101 beherbergen pBID4 - GFP wurde gezüchtet O / N in YEB Medium, zentrifugiert und mit einer A 600 von 0,5 entweder in MMA, das 2% Glucose mit Acetosyringon bei 0, 100, 200 oder 400 &mgr; M oder in MMA resuspendiert, das 200 uM Acetosyringon mit Glukose bei 0, 1, 2 oder 4%. Die Agrobacterium-Suspension wurde für 3 h bei Raumtemperatur vor der Infiltration gehalten.

figure-results-5
Abbildung 5. Auswirkungen von Silencing-Unterdrücker auf die transiente Proteinproduktion in N. benthamiana Blätter. (A) Western-Blot-Analyse der GFP-Protein nach Co-Infiltration pBID4-GFP und p19 in verschiedenen Verhältnissen. Proben, die bei 7 dpi (25 ug von frischem Blattgewichtsäquivalent wurde pro Spur geladen). (B) Eine Kultur von Agrobacterium Durchführung pBID4-HAC1 gesammelt wurde einzeln in einem Verhältnis von 4:1 mit einer Kultur Tragen des p19 oder p23-Silencing-Suppressor gemischt Plasmide. Die daraus resultierenden Kombinationen von Agrobacterium-Kulturen wurden in Pflanzen Vakuum infiltriert. Infiltrierten Gewebe HAC1 wurden täglich bis zu 8 dpi für rekombinante Proteinquantifizierung gesammelt. (C) Stabilität der Agrobacterium Zellbank. Die Pflanzen wurden mit der gleichen Charge des Agrobacterium-Zellbank jedes Jahr infiltriert, um die Proteinakkumulation auszuwerten. Fünfzig ug frisches Blatt Gewichtsäquivalent wurden pro Spur geladen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen thist Figur.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll für Agroinfiltration Routine transiente Proteinproduktion in ausgewählten Nicotiana-Arten mit Hilfe von Agrobacterium-Stämme, die die Markteinführung Vektor entwickelt. Darüber hinaus haben wir die optimalen Bedingungen ermittelt, die höchste Produktion rekombinanter Proteine ​​Ebene in unserem vorübergehenden Pflanzenexpressionssystem zu erreichen.

Vakuum-Infiltration der verdünnten A. tumefaciens Stamm GV3101 beherbergen die Startvektor pBID4 in N. benthamiana, N. excelsiana und N. excelsior in höheren Ebenen der Zielproteinproduktion innerhalb 7 dpi im Vergleich zu anderen Pflanzenarten, wie Pisum sativum mit GV3101 beherbergen, Alfalfa-Mosaik-Virus infiltriert - oder Cucumber-Mosaik-Virus-basierte Vektoren, die das GFP-Reporter-Gen unter der 35S-Promotors 41, oder Lactuca sativa, Solanum lycopersicum und Arabidopsis thaliana mit dem C58C1 Stamm von A. infiltriert tumefaciens mit dem beta-Glucuronidase-Reportergens 57. N. benthamiana und N. excelsiana waren einfach zu infiltrieren Vakuum bei 50 mbar für 30-60 sec, mit 90-95% Infiltration Effizienz. Die verbleibenden 5-10% der Blattfläche nicht wegen irgend Floating der Blätter auf der Oberfläche des Agrobacterium-Suspension während des Aufbringens des Vakuums infiltriert. Seit der Einführung Vektor hat die Fähigkeit für Zell-zu-Zell-Bewegung 18, tritt transiente Proteinakkumulation in ganze Blätter sowie Blattstiele bei 7 dpi. Bei 10 dpi, war die geschätzte GFP Produktion etwas niedriger, weil die pBID4 Expressionsvektor ist in der Lage, von Zelle zu Zelle bewegen, aber nicht systemisch 18 zu bewegen; daher neu gewachsene Blätter enthalten den Vektor nicht und nicht um die Produktion von Ziel beitragen. Zusätzlich Abbau des rekombinanten Proteins mit der Zeit may reduziert Proteinebene beitragen bei 10 dpi. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Infiltration des A. tumefaciens Stamm GV3101 vermittelte hohe transiente Proteinproduktion in N. benthamiana. Ferner können Zielprotein als N-terminale, C-terminale oder interne Fusionen Lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-Glucanase, welche ein thermostabiles Enzym aus Clostridium thermocellum ist und Thermostabilität verleiht vielen Ziel konstruiert werden, Protein-Fusion 18. Die Infiltration von N. benthamiana mit A. tumefaciens-Wildtyp-Stämme (AT6, AT10 und AT77) beherbergt das Gen von Interesse hervorgerufen milde oder schwere Symptome: Blatteisstockschießen, Blattstiel Dehnung und Eisstockschießen. Keine pathologischen Symptome wurden in N. beobachtet benthamiana infiltriert mit dem Laborstamm GV3101 beherbergen leer pBID4 Vektor, während einige Gene in pBID4 eingeführt und in Labor-Stämme GV3101, C58C1 oder LBA4404 ausgelöst milden nekrotischen Antworten und BlattChlorose / Vergilbung Symptome bei infiltriert Regionen der Blätter. Necrotic Symptome, die durch Wildtyp-Stämmen Agrobacterium oder unscharf in Nachtschattengewächse verursacht haben bisher 56,57 berichtet. Die nekrotische Reaktion konnte von Virulenzfaktoren des Sekretionssystem vom Typ III, bakteriellen Proteinen in die Pflanzenzelle durch die Typ IV-Sekretionssystem übertragen und / oder Empfindlichkeit für Flagellin 58-60 führen. Wir haben festgestellt, dass transiente Produktion von heterologen Proteine ​​können auch entlocken Pathogenität und eine hypersensible Reaktion in infiltriert Anlage verlässt. Viele Forscher berichtet, dass die Agroinfiltration von verschiedenen Pflanzenarten mit Pflanzen binären Vektoren bis zu 5-20 mal höhere transiente Proteinproduktion im Vergleich zu stabil transformierten Pflanzen 28,57 hergestellt. Unsere Daten zeigen, dass N. benthamiana infiltriert mit GV3101 beherbergen pBID4-GFP transient exprimierten hohe Niveaus von GFP, die ähnlich der GFP Ausbeute für gemeldeteN. benthamiana mit Agrobakterien Durchführung der Pich-GFPSYS viralen Vektor (bis zu 80% des gesamten löslichen Proteins) 44 infiltriert. Agroinfiltration mit unserem Start-Vektor führte zu hohen Produktion von thermostabilen Protein LicKM, 50-fach höher als die Verwendung eines binären Standard-Plasmid-18 beobachtet.

Um die Infektiosität von A. Test tumefaciens und die Stabilität der Markteinführung Vektor, ein Flach von N. infiltriert wir benthamiana jede Stunde für bis zu 8 Stunden mit dem gleichen Milli-Q-Wasser verdünnten Kultur der GV3101 beherbergen die pBID4-GFP-Plasmid. Unsere Daten zeigten, dass der Stamm GV3101 effizient für mindestens 8 h und pBID4 (die Einführung Vektor) infektiös ist während der 8 Stunden lang Infiltration sehr stabil.

Glycerin Lager von GV3101 Stamm, der den Start-Vektor pBID4 HAC1 (Zellbank) bei -80 ° C gelagert wurde gezeigt, dass für drei Jahre als sehr stabil, ohne die Änderungen in transienten protein der Produktion in Pflanzen infiltriert.

N. benthamiana Pflanzen unter optimalen Bedingungen und zwischen 35 und 42 Tage nach der Aussaat gewachsen waren optimal für Vakuuminfiltrations-vermittelte transiente Genexpression 40. Jungpflanzen (3-4 Wochen alt) nicht vollständig, weil der schwimmenden Blätter auf der Zellsuspensionsoberfläche und Gewebeschäden von der mechanischen Wirkung des Anlegens eines Vakuums infiltriert werden. In Anlagen, die älter als 45 Tage, N. benthamiana Verschrauben der Bühne, unter den verwendeten optimalen Lichtverhältnissen, ist das Niveau der transiente Expression gering.

Niedermolekulare phenolische Verbindungen (Acetosyringon) und monosaccharaides (Glukose) sind dafür bekannt, vir-Gene in A. tumefaciens 55,61 induzieren. Außerdem Infiltration von N. benthamiana mit dem binären Vektor pCAMBIA (GFP) in Anwesenheit von Acetosyringon bei Konzentrationen von 50-600 &mgr; M gezeigt, geringfügig vorübergehende ZunahmeGenexpression 40. Wir untersuchten die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von Acetosyringon und Glucose in unserem System durch Zugabe dieser Verbindungen zu GV3101 Kulturen beherbergen pBID4-GFP in MMA für 3 h, und fand keinen Unterschied in der GFP-Expression. Interessanterweise GV3101 Kulturen beherbergen pBID4-GFP und in Milli-Q-Wasser auf eine A 600 von 0,5 verdünnt und infiltriert ohne die vir-Gen Induktion exprimiert die gleichen Mengen an GFP als diejenigen mit induzierten Kulturen infiltriert. Die A. tumefaciens vir-Gen (n) könnte möglicherweise durch Pflanzen phenolische Verbindungen (Acetosyringon und Sinapinsäure) und Pflanzen monosaccharaides (Glucose und Fructose) in Blattgewebe vorhanden induziert werden. Daher spekulieren wir, dass ähnliche Niveaus der GFP-Expression in Gegenwart oder Abwesenheit von exogenen Induktoren vir-Gen kann ein Ergebnis der Wirkung der zytoplasmatischen vir-Gen Induktoren während der Replikation der GFP-exprimierenden Vektor Einführung in Pflanzenzellen vorliegen.

Wildtyp N. benthamiana als Modell-Host für transiente Proteinproduktion 49 verwendet worden. Jedoch relativ niedrigen Biomasseertrag N. benthamiana 's behindert seine Anwendung für die Großproduktion von rekombinanten Proteinen. Die optimale Host sollte eine hohe transiente Expression, einfach Wachstum im Gewächshaus zu kombinieren und anfällig sein Agrobacterium Infiltration 2. Um eine alternative Host auswählen, infiltriert wir zwei verschiedene Arten Wildtyp von Nicotiana (N. benthamiana und N. excelsior) und ein Hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) mit der A. GV3101 beherbergen die pBID4-GFP-Plasmid. Unter diesen drei Arten, die Höhe der GFP-Expression in N. geringfügig höheren benthamiana. N. excelsior Pflanzen zeigten Schwierigkeiten im Vakuum Agroinfiltration aufgrund ihrer ledrigen Blättern, und N. excelsianaproduziert etwa zwei-mal Biomasse unter den gleichen Wachstumsbedingungen. Die transiente Produktion von GFP bei 7 dpi in N. relativ ähnlich ist benthamiana und N. excelsiana. Daher N. excelsiana kann ein geeigneter Wirt für die Produktion rekombinanter Proteine ​​sein.

Agrobacterium-vermittelte transiente Proteinproduktion durch PTGS 26, die durch Co-Expression von Gen-Silencing-Suppressoren des Pflanzenvirus Ursprungs 62 überwunden werden kann, begrenzt. Transiente Proteinproduktion wurde zuvor gezeigt, um das 50-fache in Gegenwart der p19-Protein von TBSV, die PTGS in infiltrierten Geweben hemmt 34 verbessert werden. In unserer Studie untersuchten wir die Wirkung von zwei viralen Silencing Unterdrücker (p19 und p23) mit der Einführung pBID4 Vektor-HAC1 separat Zusammenarbeit infiltriert. Der Co-Infiltration dieser Silencing-Suppressoren schien wenig Einfluss auf transiente Expression HAC1 haben, mit nur einer leichten Erhöhung der HAC1Protein-Akkumulation (15-25%) in Gegenwart von Co-infiltrierten p23 oder p19. Um positiv auf die Proteinproduktion, muss zum Schweigen Drücker gezielt ausgewählt, um effektiv für die gezielten Pflanzenarten und viralen Vektor 63 sein werden. TMV Helikase hat einen Suppressor der RNA-Silencing-Aktivität 64,65. Unsere Daten bestätigen diese Beobachtung als Co-Infiltration von p23 oder p19 mit pBID4-HAC1 führte zu keiner Erhöhung der GFP oder einem leichten Anstieg in der Übergangs HAC1 Proteinproduktion.

Zusammenfassend haben wir geändert und optimiert Anlagen und Agrobacterium Wachstumsbedingungen und verbessert die Effizienz der Vakuum-Infiltration. Diese Technologie ermöglicht es uns, in ein paar Stunden zu wachsen und zu infiltrieren Hunderte von Kilogramm Pflanzenmaterial. Wir die Anlage transiente Expression Technik für die Hochdurchsatz-Impfstoff-Produktion im industriellen Maßstab unter current Good Manufacturing Practices (cGMP) Bedingungen erfolgreich automatisiert. Für weitere Informationen about Automatisierung und Auslastung der Anlage transiente Protein-Produktionsanlage für die Produktion von rekombinanten Proteinen, einschließlich Subunit-Impfstoff-Kandidaten, unter cGMP-Bedingungen werden die Leser auf die Website verwiesen www.fhcmb.org/ .

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, iBio, Inc. und der Defense Advanced Research Projects Agency (Zuschuss # HDTRA1-07-C-0054) unterstützt. Die Autoren erkennen die großzügige Geschenke von Drs.. Stanton Gelvin von Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens-Stämme) und Wayne Fitzmaurice von Large Scale Biology Corporation (N. excelsiana Samen) sowie Jennifer Nicholson US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior Samen ). Die Autoren danken Margaret Shillingford und Christopher Hull zur Versorgung von Pflanzen und ausgezeichnete technische Hilfe. Die Autoren bedanken sich auch DRS. Stephen Streatfield und Natasha Kushnir für die redaktionelle Unterstützung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Nicotiana benthamianaTobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State UniversityPI 555478 TW16Infiltration
Nicotiana excelsiorTobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State UniversityPI 555685 TW47Infiltration
Nicotiana excelsianaDr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CALSBC EBA 042304.02Infiltration
Vacuum SkidAbbas, Ashland, MAMaßgeschneidertePflanzeninfiltration
RockwoolGrodan Inc., Ontario, KanadaAO 50/40Hydrokulturmedien für den Anbau von Pflanzen
2-(N-Morpholino) EthansulfonsäureAcros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ172595000Buffer
Murashige & Skoog-Salz (MS-Salz)Phyto Technology LabM524Gewebekulturmedien
AcetosyringonSigma-Aldrich, St. Louis, MOD134406-5GAgrobacterium-Induktion
Immobilon-P-TransfermembranMillipore, Billerica, MAIPVH00010Western-Blotting
I-BlockApplied Biosystems, Foster City, CAT2015Western-Blotting
Kaninchen polyklonales Anti-GFP-Antiserum Washington Biotechnology, Baltimore, MDWestern Blot
Maus Anti– monoklonaler Poly-Histidin-AntikörperQiagen GmbH, Hilden34670Western Blot
Meerrettichperoxidase-konjugierter Anti-Kaninchen-AntikörperJackson ImmunoResearch, West Grove, PA111-035-003Western Blot
Meerrettichperoxidase-konjugierter Anti-Maus-AntikörperJackson ImmunoResearch, West Grove, PA115-035-003Western Blot
SuperSignal® West Pico chemilumineszierendes SubstratThermo Scientific Pierce, Rockford, IL34078Western Blot
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)Megazyme, Bray, Co. Wicklow, IrlandP-LICHNLichenase Aktivität
Kongo Rot Sigma-Aldrich, St. Louis, MOC6277Gelfärbung
Digitalkamera Olympus, Center Valley, PAC-8080Chemilumineszenz-Bildgebung
GeneGnomeSyngene, Frederick, MDChemilumineszenz-Bildgebung 
GFP-Norm Hergestellt in der hauseigenenChemilumineszenz-Bildgebung
PflanzendüngerlösungGriffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE67-23-20Pflanzenanbau
Lichenase StandardGereinigt im HausWestern Blot
MicroPulser ElektroporatorBioRad, Hercules, CA165-2100Agrobacterium Transformation 

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, , Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Agrobacterium mediated Transient Protein ProductionVacuum Infiltration TechniqueNicotiana Species SelectionAgrobacterium Strain OptimizationHydroponic Plant GrowthViral RNA Silencing SuppressorGFP Expression AnalysisWestern Blot DetectionFluorescence Assay QuantificationIndustrial scale Protein Production

Verwandte Artikel