Überwachung der Montage einer sezernierte bakterielle Virulenz-Faktor mit Site-spezifische Vernetzung

Zusammenfassung

Dieser Artikel veranschaulicht die Verwendung von Pulse-Chase-Radiomarkierung in Kombination mit ortsspezifischer Photovernetzung, um Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen Faktoren in E. coli zu überwachen. Im Gegensatz zu herkömmlichen chemischen Vernetzungsmethoden erzeugt dieser Ansatz hochauflösende "Schnappschüsse" eines geordneten Assemblierungswegs in einer lebenden Zelle.

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zum Nachweis und zur Analyse dynamischer Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen Faktoren in vivo. Unsere Methode basiert auf der Bernsteinunterdrückungstechnologie, die ursprünglich von Peter Schultz und Kollegen¹ entwickelt wurde. Eine bernsteinfarbene Mutation wird zuerst an einem bestimmten Codon des Gens eingeführt, das für das Protein von Interesse kodiert. Die Bernsteinmutante wird dann in E. coli exprimiert, zusammen mit Genen, die für eine bernsteinfarbene Suppressor-tRNA und eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase kodieren, die von Methanococcus jannaschii abgeleitet ist. Mit diesem System wird das photoaktivierbare Aminosäureanalogon p-Benzoylphenylalanin (Bpa) am Amber-Codon eingebaut. Die Zellen werden dann mit ultraviolettem Licht bestrahlt, um den Bpa-Rest kovalent an Proteine zu binden, die sich innerhalb von 3-8 Å befinden. Die Photovernetzung wird in Kombination mit Pulse-Chase-Markierung und Immunpräzipitation des interessierenden Proteins durchgeführt, um Veränderungen in Protein-Protein-Wechselwirkungen zu überwachen, die über eine Zeitskala von Sekunden bis Minuten auftreten. Wir haben das Verfahren optimiert, um den Zusammenbau eines bakteriellen Virulenzfaktors zu untersuchen, der aus zwei unabhängigen Domänen besteht, einer Domäne, die in die äußere Membran integriert ist, und einer Domäne, die in den extrazellulären Raum transloziert ist, aber die Methode kann verwendet werden, um viele verschiedene Assemblierungsprozesse und biologische Signalwege sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen zu untersuchen. Prinzipiell können wechselwirkende Faktoren und sogar spezifische Reste von wechselwirkenden Faktoren, die an ein Protein von Interesse binden, durch Massenspektrometrie identifiziert werden.

Einleitung

Es ist oft wichtig, Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen zellulären Komponenten zu identifizieren und zu charakterisieren, um seine Rolle in einem biologischen Signalweg zu definieren, seine Assemblierung zu verstehen oder seinen Wirkmechanismus aufzuklären. Eine Vielzahl von Ansätzen wird häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, aber alle haben ihre Grenzen. Die einfachste unvoreingenommene Methode zur Identifizierung von Proteinen, die an ein Protein von Interesse binden, ist die Coreinigung (oder Coimmunpräzipitation), aber dieser Ansatz erfordert, dass ein Proteinkomplex während des Aufreinigungsverfahrens intakt bleibt. Schwache oder vorübergehende Proteinwechselwirkungen können durch chemische Vernetzung stabilisiert werden, aber diese Methode erfordert in der Regel die Verwendung von Verbindungen, die Proteine über primäre Amine verbinden, die in der Proteinsequenz weit verstreut sind. Komplizierte Vernetzungsmuster, die schwer zu interpretieren sind, können erzeugt werden, insbesondere wenn die interessierenden Proteine Bestandteile von Multiproteinkomplexen sind. Da die Spacerarme chemischer Vernetzer im Allgemeinen eine Länge von mehr als 10 Å überschreiten, können kovalente Bindungen mit Proteinen gebildet werden, die sich in der Nähe des interessierenden Proteins befinden, aber nicht direkt mit ihm interagieren. Methoden wie Affinitätschromatographie und Zwei-Hybrid-Screens sind ebenfalls oft nützlich, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren. Der erste Ansatz erfordert jedoch die Reproduktion von Bedingungen, die physiologisch signifikante Wechselwirkungen begünstigen und nicht zum Nachweis schwacher Wechselwirkungen verwendet werden können. Der letztere Ansatz setzt voraus, dass Bindungsinteraktionen im Wirtsorganismus repliziert werden können und aufrechterhalten werden, wenn ein Protein von Interesse und seine Bindungspartner in den Kontext eines Fusionsproteins gestellt werden. Zwei-Hybrid-Methoden neigen auch dazu, falsch-positive Ergebnisse zu generieren². Ist eine Protein-Protein-Wechselwirkung erst einmal festgestellt, ist oft erheblicher Aufwand erforderlich, um den Ort der Wechselwirkung zu kartieren. Der vielleicht bedeutendste Nachteil traditioneller Ansätze besteht darin, dass sie keine Informationen über die zeitliche Abfolge intermolekularer Wechselwirkungen oder die Kinetik der Bindung liefern.

Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, die einige der Einschränkungen anderer Ansätze überwindet, die zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden. Zunächst wird eine einzelne bernsteinfarbene Mutation in das Gen eingeführt, das für ein Protein von Interesse kodiert. Die bernsteinfarbene Mutante wird dann mit einer bernsteinfarbenen Suppressor-tRNA und einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase koexprimiert, die von Methanococcus jannaschii abgeleitet sind und so konstruiert wurden, dass sie das photoaktivierbare Aminosäureanalogon p-Benzoylphenylalanin (Bpa) nur an bernsteinfarbenen Codons³ einbauen. Die Bestrahlung von Zellen mit langwelligem ultraviolettem (UV) Licht (~365 nm) erleichtert dann die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen Bpa und Proteinen, die sich innerhalb von ~3-8 Å^4,5 befinden. In einigen experimentellen Kontexten können auch Quervernetzungen zwischen aktiviertem Bpa und Nichtproteinkomponenten von Zellen wie Lipiden und Nukleinsäuren gebildet werden⁶. Moleküle, die am bernsteinfarbenen Codon terminiert sind, sollten im Allgemeinen leicht von dem Protein in voller Länge auf SDS-PAGE unterscheidbar sein und können nicht mit anderen Proteinen vernetzt werden. Indem die Zellen vor der Vernetzung einer Pulsverfolgungs-Radiomarkierung unterzogen werden und anschließend immunpräzipitierende oder affinitätsreinigende Vernetzungsprodukte hergestellt werden, können die Abfolge und Dauer der Protein-Protein-Wechselwirkungen bestimmt werden. Die Fähigkeit, zeitliche Informationen über intermolekulare Wechselwirkungen zu generieren, ist besonders wertvoll, um die Progression eines Proteins von Interesse durch einen geordneten mehrstufigen Assemblierungs-, Transport- oder Signalweg zu untersuchen und Zwischenprodukte zu identifizieren. Wie die chemische Vernetzung erkennt auch die ortsspezifische Vernetzung Protein-Protein-Wechselwirkungen, die unter physiologischen Bedingungen auftreten, aber die Einführung eines Vernetzers an einer einzigen Position erleichtert die Analyse von Wechselwirkungen zwischen einzelnen Segmenten eines Proteins und anderen Faktoren. Diese einzigartige Eigenschaft der ortsspezifischen Vernetzung ist besonders vorteilhaft, wenn das Protein von Interesse mehrere Segmente oder Domänen aufweist, die das Potenzial haben, mit unterschiedlichen Bindungspartnern zu interagieren. Darüber hinaus kann die ortsspezifische Vernetzung in Kombination mit Methoden wie der Massenspektrometrie genutzt werden, um die Rückstände, die Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln, präzise zu kartieren. Obwohl diese Methode für den Einsatz in E. coli optimiert ist, wurde der Einbau von photoaktivierbaren Aminosäureanaloga in Proteine durch Bernsteinsuppression in Mycobacterium-, Hefe- und Säugetierzellen berichtet^7-11. Somit kann unsere Methode prinzipiell auch in anderen Systemen eingesetzt werden.

Wir haben diese Methode ausgiebig verwendet, um intermolekulare Wechselwirkungen zu identifizieren, die die Biogenese von EspP, einem E. coli O157:H7-Virulenzfaktor, erleichtern. EspP gehört zu einer Superfamilie von Proteinen, die als "Autotransporter" bekannt sind und eine große N-terminale extrazelluläre Domäne ("Passagierdomäne") und eine aC-terminale Domäne ("b-Domäne") enthalten, die sich zu einer zylindrischen b-Fassstruktur falten und das Protein an der äußeren Membran (OM) ^verankern12. Der Mechanismus, durch den der Passagierbereich über das OM verlagert wird, war lange Zeit ein Rätsel. Wie alle bakteriellen Zelloberflächenproteine muss EspP durch die innere Membran transportiert, durch das Periplasma (den Raum zwischen der inneren und äußeren Membran) transportiert und in einer Reihe von geordneten Ereignissen zum OM geleitet werden. Nach ihrer Translokation durch das OM wird auch die EspP-Passagierdomäne durch eine proteolytische Spaltung von der b-Domäne getrennt und von der Zelloberfläche freigesetzt. Durch die Kombination von ortsspezifischer Vernetzung mit Pulse-Chase-Radiomarkierung haben wir gezeigt, dass beide Domänen des Proteins zunächst mit dem molekularen Chaperon Skp im Periplasma interagieren⁶. Anschließend interagieren diskrete Segmente der b-Domäne auf stereospezifische Weise mit Komponenten eines Heterooligomers, dem sogenannten Bam-Komplex, der die Integration von b-Fassproteinen in das bakterielle OM durch einen unbekannten Mechanismus katalysiert. Am interessantesten ist vielleicht, dass wir herausgefunden haben, dass die Passagierdomäne mit einer der Untereinheiten des Bam-Komplexes (BamA) in Kontakt steht, während sie den OM¹³ durchquert. Unsere Ergebnisse haben es uns ermöglicht, ein detailliertes Modell für die Autotransporter-Montage¹⁴ zu konstruieren und den Bam-Komplex in den Transport des Passagierbereichs über den OM einzubeziehen.

Protokoll

1. Plasmid-Konstruktion

1. Nach der Klonierung eines Gens, das für ein Protein von Interesse kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor führen Sie Bernsteinmutationen an den gewünschten Stellen mit einem ortsgerichteten Mutagenese-Kit ein.
   HINWEIS: Strukturelle Informationen und Vorhersagen zur Oberflächenexposition können als nützliche Anhaltspunkte dienen, um die Positionen von Mutationen zu bestimmen. Da die Effizienz der bernsteinfarbenen Suppression und Vernetzung erheblich variieren kann, sollten bernsteinfarbene Mutationen an mehreren Stellen eingeführt werden. Da Bpa ein Analogon von Tyrosin und Phenylalanin ist, versuchen Sie außerdem, bernsteinfarbene Mutationen an Positionen einzuführen, die normalerweise große hydrophobe Aminosäuren kodieren, um Störungen der Proteinstruktur und -funktion zu minimieren. Bei der Auswahl eines Expressionsvektors ist zu berücksichtigen, dass die Überproduktion eines interessierenden Proteins auf einem sehr hohen Niveau die Effizienz des Bpa-Einbaus einschränken kann.

2. Vorbereitung der Kultur

1. Verwenden Sie die Elektroporation, um einen geeigneten E. coli-Stamm mit einem Plasmid zu transformieren, das für das bernsteinfarbene Suppressionssystem (pDULE-p Bpa; siehe Referenz⁴) kodiert, und einem kompatiblen Plasmid, das für das Protein von Interesse mit einer bernsteinfarbenen Mutation kodiert.
2. Plattenzellen auf LB-Agar, die geeignete Antibiotika enthalten (verwenden Sie 5 μg/ml Tetracyclin zur Selektion für pDULE-p Bpa). Die Platten O/N bei 37 °C inkubieren.
3. Am nächsten Tag beginnen Sie mit O/N-Kulturen aus Einzelkolonien in 3-5 ml M9 Medium¹⁴, das 0,2 % Glycerin, alle L-Aminosäuren außer Methionin und Cystein (40 μg/ml) und Antibiotika enthält. Inkubieren bei 37 °C.
4. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie O/N-Kulturen bei 2.500 x g für 5 min bei RT zu Pelletzellen. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml frischem M9-Medium und wiederholen Sie die Zentrifugation.
   HINWEIS: Dieser Waschschritt ist entscheidend für die Aufrechterhaltung von Plasmiden, die für eine Ampicillinresistenz kodieren, da kleine Mengen an b-Lactamase, die im Medium aus O/N-Kulturen vorhanden sind, frisch zugesetztes Ampicillin abbauen, bevor ein signifikantes Zellwachstum auftritt.
5. Resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml frischem Medium und messen Sie die Zellkonzentration in einem Spektralphotometer (OD₅₅₀).
6. Die Zellen werden in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben gegeben, der 50 ml M9-Medium und Antibiotika bei OD₅₅₀ = 0,03 enthält. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C in einem Schüttelwasserbad.

3. Bpa-Inkorporation und Vorbereitung für Photocrosslinking

HINWEIS: Das unten beschriebene Protokoll gilt für einen Beispielzeitverlauf mit drei Zeitpunkten (0, 1 und 5 Minuten). Passen Sie die Lautstärke entsprechend an, wenn eine andere Anzahl von Zeitpunkten gewünscht wird. Ein Überblick über das Vorgehen ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Während die Kulturen wachsen, bereiten Sie eine frische 1 M (1.000x) Lösung von Bpa in 1 M NaOH (27 mg Bpa in 100 μl 1 M NaOH) vor. Verwende ein dunkelwandiges Rohr, um die Lösung im Dunkeln zu halten.
2. Wenn die Kulturen die frühe bis mittlere logarithmische Phase (OD₅₅₀ = 0,2) erreichen, fügen Sie jeder Kultur 50 μl 1 M Bpa hinzu. Geben Sie Bpa tropfenweise hinzu, während Sie den Kolben schwenken, um Ausfällungen zu vermeiden. Fügen Sie als Nächstes alle Induktoren hinzu, die benötigt werden, um die Expression der Bernsteinmutante zu steuern. Inkubieren Sie die Kulturen weitere 30 Minuten lang bei 37 °C.
3. Während der 30-minütigen Einarbeitungszeit beschriften Sie sechs 15-ml-Einweg-Zentrifugenröhrchen mit dem Zeitpunkt (0 min, 1 min, 5 min) und entweder "+ UV" oder "- UV". Lege die Röhren auf Eis.
4. Füllen Sie einen zweiten Eiskübel mit Eis und legen Sie eine 6-Well-Gewebekulturplatte auf das Eis.
5. Tauen Sie die hohe spezifische Aktivität (1.000 mCi/mmol) ^{von 35}S-Methionin und ³⁵S-Cystein (oder eine vorgefertigte Mischung aus den beiden Verbindungen) für die Impulsmarkierung auf und bereiten Sie eine Lösung aus nicht-radioaktivem L-Cystein und L-Methionin (jeweils 100 mM) für die Jagd vor (oder tauen Sie
sie auf).
6. Schalten Sie die UV-Lampe fünf Minuten vor der Radiomarkierung ein.
   HINWEIS: Die Lampe sollte so verstellbar sein, dass sie ~3-4 cm von den Proben in der Multiwell-Platte entfernt positioniert werden kann.
7. Geben Sie Eis (~2 ml) in jedes Röhrchen mit der Bezeichnung "- UV" und in zwei der Vertiefungen in der Multiwell-Platte.
   HINWEIS: Eis sollte unmittelbar vor dem 5-Minuten-Zeitpunkt in eine dritte Vertiefung gegeben werden. Es ist wichtig, Eis direkt in die Röhrchen und Vertiefungen zu geben, um intrazelluläre Reaktionen zu jedem Zeitpunkt sofort zu stoppen und so genaue "Momentaufnahmen" eines bestimmten biochemischen Signalwegs zu erhalten.
8. Am Ende der 30-minütigen Induktionsphase werden 25 ml der Kultur in einen vorgewärmten 125-ml-Einweg-Erlenmeyerkolben überführt. Stellen Sie den Kolben in das 37 °C heiße Schüttelwasserbad.

4. Pulse-Chase-Markierung und UV-Bestrahlung

HINWEIS: Das Pulsverfolgungsmarkierungs- und UV-Bestrahlungsprotokoll besteht aus vielen Schritten, die zeitnah durchgeführt werden müssen und die eine beträchtliche Organisation und Vorbereitung im Voraus erfordern. Alle Reagenzien und Röhrchen sollten leicht zugänglich sein. Im Folgenden finden Sie ein Protokoll für ein Experiment mit Zeitpunkten von 0, 1 und 5 Minuten.

1. Zum Zeitpunkt 0:00 (min:sec) werden 25 ml Kultur in einen 125-ml-Kolben überführt.
2. Zum Zeitpunkt 0:30 werden 30 μCi/ml radioaktive Aminosäuren zugegeben; zum Mischen schnell schwenken. Stellen Sie den Kolben in das 37 °C heiße Schüttelwasserbad.
3. Um 1:00 Uhr werden 250 μl der 100 mM Methionin-Cystein-Lösung zugegeben; zum Mischen schnell schwenken.
   1. 4 ml der Kultur werden sofort in eine der Vertiefungen der gekühlten Multiwell-Platte pipettiert, die Eis enthält. Pipettieren Sie ein zweites 4-ml-Aliquot in das 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "0 min - UV". Stellen Sie den Kolben wieder in das Wasserbad.
4. Um 14:00 Uhr pipettieren Sie 4 ml der Kultur in die zweite Vertiefung der gekühlten Multiwell-Platte, die Eis enthält. Weitere 4 ml aliquot werden in das 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "1 min - UV" pipettiert. Der Kolben wird wieder in das Wasserbad gestellt.
5. Um 18:00 Uhr pipettieren Sie 4 ml der Kultur in die dritte Vertiefung der gekühlten Multiwell-Platte, die Eis enthält. Pipettieren Sie weitere 4 ml aliquot in das 15 ml Röhrchen mit der Aufschrift "5 min - UV".
6. Stellen Sie den Eiskübel mit der Multiwell-Platte unter die vorgeheizte UV-Lampe und bestrahlen Sie jede Probe einzeln für 4 min.
   HINWEIS: Bei Experimenten, bei denen die Zeitpunkte mindestens 4 Minuten voneinander entfernt sind, sollte jede Probe bestrahlt werden, sobald sie in die Multiwell-Platte pipettiert wird.
7. Übertragen Sie die Zellen in die gekühlten 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "0 min +UV", 1 min +UV" usw.
8. Zellen bei 2.500 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
9. Resuspendieren Sie jede Probe in 300 μl M9-Medium oder PBS und fügen Sie 33 μl 100 % kalte Trichloressigsäure (TCA) hinzu, um Proteine auszufällen. Die TCA-Ausfällungen in einer Mikrofuge bei Höchstgeschwindigkeit für 10 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei - 20 °C gelagert werden.

5. Immunpräzipitation und Nachweis von Vernetzungsprodukten

1. Geben Sie 50 μl Solubilisierungspuffer (15 % Glycerin, 200 mM Trisbase, 15 mM EDTA, 4 % SDS, 2 mM PMSF) zu jeder Probe und erhitzen Sie sie 5 Minuten lang unter Rühren bei 95 °C, um das gefällte Protein zu lösen.
2. Fügen Sie 1 ml RIPA-Puffer (Radioimmunoprecipitation Assay) hinzu (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0 % Igepal CA-630, 0,5 % Desoxycholat, 0,1 % SDS) und führen Sie Standard-Immunpräzipitationen¹⁵ mit einem Fünftel bis zur Hälfte jeder Probe durch.
   HINWEIS: Igepal CA-630 (Octylphenyl-Polyethylenglykol) wird anstelle von NP-40 verwendet, das nicht mehr im Handel erhältlich ist. Die beiden Verbindungen sind chemisch nicht zu unterscheiden.
3. Immunpräzipitierte Proteine mittels SDS-PAGE auflösen. Färben, entfärben und trocknen Sie Gele.
4. Setzen Sie Gele einem Phosphor-Screen-O/N aus und weisen Sie radioaktive Proteine (einschließlich Vernetzungsprodukte) mit einem Phosphorimager nach.

Ergebnisse

Wir haben ortsspezifisches Photovernetzen verwendet, um Proteine zu identifizieren, die mit EspP auf seinem Weg zum OM interagieren. In den Experimenten, die hier gezeigt werden, wurden Phenylalanin-Codons an den Resten 1113 und 1214 durch bernsteinfarbene Codons ersetzt. Beide Positionen befinden sich in der b-Domäne, die sich in das OM integriert und als Membrananker dient. Die Kristallstruktur der EspPβ-Domäne¹⁶ zeigt, dass sich die beiden Reste auf der periplasmatischen Seite des b-Zylinders befinden, aber...

Diskussion

In dieser Arbeit wird eine Methode beschrieben, die ortsspezifische Photovernetzung mit Pulse-Chase-Markierung kombiniert, um die Dynamik der Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen Komponenten einer lebenden Zelle zu untersuchen. Die Methode ist besonders nützlich, um mehrstufige Prozesse zu untersuchen, bei denen das Protein sequentiell mit anderen Faktoren interagiert. Im Gegensatz zu herkömmlichen chemischen Vernetzungsansätzen liefert die ortsspezifische Photovernetzung detaillierte Informa...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
QuikChange II Site-Directed Mutagenese Kit	Agilent	200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)	Bachem	F-2800
TRAN35S-LABEL, Reagenz für die metabolische Markierung (35S-L-Methionin und 35S-L-Cystein, >1.000 Ci/mmol)	MP Biomedicals	51006
Spektroline SB-100P Super-High-Intensity UV-Lampe, 365 nm	Spectronics Corporation	SB-110P
Spektroline Ersatzlampe 100S	Spectronics Corporation	11-992-15
Falcon Gewebekulturplatte, 6-well	Becton Dickinson Laborbedarf	353046
Einweg 125 ml Erlenmeyerkolben	Corning	430421
Innova 3100 Schüttelwasserbad	Neu Brunswick Scientific	n.a.