Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen mechanischen Schneideverfahren, das die Erweiterung der sphärischen neuralen Stamm-und Vorläuferzellaggregate ohne Dissoziation zu einer Einzelzellsuspension ermöglicht. Die Aufrechterhaltung Zell / Zell-Kontakt ermöglicht eine schnelle und stabile Wachstum seit über 40 Passagen.

Zusammenfassung

Ein Zellexpansion Technik, um eine große Zahl von Zellen, die aus einer einzelnen Probe für Forschungsexperimente und klinische Studien sammeln würde die Stammzell Gemeinschaft profitieren. Viele aktuelle Erweiterung Methoden sind aufwendig und teuer, und solche, die vollständige Dissoziation kann dazu führen, mehrere Stamm-und Vorläuferzelltypen, die Differenzierung oder frühen Seneszenz. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir einen automatisierten mechanischen Passagieren Verfahren als "Hacken", das einfach und kostengünstig ist bezeichnet entwickelt. Diese Technik vermeidet chemische oder enzymatische Dissoziation in Einzelzellen und ermöglicht die großflächige Erweiterung des suspendiert, Sphäroid-Kulturen, die konstant Zell / Zell-Kontakt zu halten, statt. Die Schneideverfahren hat sich vor allem für fötale Gehirn-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen oder Neurosphären verwendet wurden, und wurde kürzlich für die Verwendung mit neuronalen Stammzellen aus embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen veröffentlicht. Das Verfahren involves Aussaat Neurosphären auf einer Gewebekultur Petrischale und anschließend vorbei einen scharfen, sterilen Messer durch die Zellen effektiv die Automatisierung der mühsame Prozess der manuell mechanisch distanziert jede Kugel. Suspendieren der Zellen in der Kultur ein günstiges Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis; wie mehr als 500.000 Zellen können in einer einzelnen Neuro von weniger als 0,5 mm im Durchmesser wachsen. In einem Kolben T175 kann über 50 Millionen Zellen in Suspensionskulturen wachsen im Vergleich zu nur 15 Millionen in adhärenten Kulturen. Wichtig ist, dass das Hackverfahren gemäß der aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) eingesetzt, wodurch Massenmenge Produktion von klinischem Zellprodukte.

Einleitung

Es gibt eine lange Geschichte der Erweiterung Nagetier neuralen Stammzellen in Kultur entweder als Monoschicht oder allgemeiner Neurosphären ^{1-3 4-7.} Zusätzlich wurden menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems zu entwickeln ^8-17 isoliert in vitro expandiert wurden. Diese Zellen sind bi-potent, und zur Differenzierung zu beiden Astrozyten und Neuronen und haben ein sehr nützliches Werkzeug bei der Untersuchung der neuralen Entwicklung ^18,19 und ^20,21 Krankheitsmechanismus. hNPCs sind auch in vielen verschiedenen Tiermodellen der Krankheit des zentralen Nervensystems mit unterschiedlichen Stufen der Integration, das Überleben und die funktionalen Wirkungen ^22-24 verpflanzt worden.

Oft epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und / oder Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) ^25-28 - - und beide haft ²⁹ und drei Traditionell Nagetier oder menschliche fötale NSC an Wachstumsfaktoren ausgesetztSphäroid-dimensionalen Systemen werden typischerweise unter Verwendung der enzymatischen Spaltung in eine Einzelzellsuspension ^30-34 agiert. Die Standard-Methode, um Zellen für die Forschung oder die klinische Anwendung zu erweitern ist als Anhänger Monoschicht durch einfache Manipulation. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Passage Mono und Neurosphäre hNPCs mit enzymatische oder chemische Lösungen, führte im frühen Seneszenz ^35. Darüber hinaus kann die enzymatische Spaltung bei erhöhten Differenzierung und karyotypischen Anomalien anhand von Daten mit embryonalen Stammzellen ^36-38 gezeigt, führen. Obwohl die Standardmethode der Passage hat hNPCs aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) hochwertige Produkte, die in Phase 1 der klinischen Studien (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.) gegangen produziert, erlaubt die Methode nur ein paar Runden Zellamplifikation, die Begrenzung der Bank Potenzial.

Natürlich könnte große Forschungsexperimente und zukünftigen klinischen Studien von der Möglichkeit profitierenpropagieren Zellen in der Masse und mit verzögerter Seneszenz zu großen Wachstums-und Zellbanken zu ermöglichen. Um diesem Bedarf zu begegnen, haben wir ein neues und automatisierten Weise mechanisch Passage intakter Neurosphären durch "Zerhacken" sie in kleinen Clustern auf Zell-Zell-Kontakt. Dieses Verfahren stark erhöht deren Lebensdauer ³⁹ und Suspensionskultur ermöglicht eine effizientere Nutzung der Inkubator Platz im Vergleich zu Monolayer-Kulturen, wie bei einem alternativen 3D-Bioreaktor-Kultur-Methode ⁴⁰ gesehen. Die zur Verfügung gestellten Hack-Protokoll ermöglicht die Produktion von großen Banken von einem fetalen Probe größer als Durchgang 10, eine unwahrscheinliche Leistung mit Standard-Methoden Passagieren. Während diese Methode für das Passagieren hNPCs ist unkonventionell, wird er immer beliebter, und wurde vor kurzem mit anderen Zelltypen wie neuronale Stammzellen aus menschlichen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen, so dass groß angelegte Erweiterung für verschiedene Anwendungen, einschließlich in v veröffentlichtitro Krankheit Modellierung ^41-46. Wichtig ist, dass ein cGMP-grade hNPC Zellbank bereits mit dem Schneideverfahren hergestellt wurde, zeigt, dass die Technik zur zukünftigen klinischen Anwendungen verwendet werden.

Protokoll

1. Ethische Erklärung und Sicherheit

1. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung von Zellkulturprodukte von Menschen oder Tieren. Alle abgeleiteten Gewebe müssen vor Gebrauch mit dem entsprechenden Institutional Review Board (en) und / oder der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (n) genehmigt werden.
2. Alle Bio-gefährliche Abfälle müssen nach den auf der jeweiligen Institution entschieden Sicherheitsbestimmungen entsorgt werden. Kennen und befolgen Sie alle Sicherheits-und treffende Entsorgungsrichtlinien im Rahmen dieses Verfahrens.

2. Herstellung von Ausrüstung, Zubehör, Reagenzien und Beobachtungen

1. Vorbereitung
   1. Besorgen Sie sich eine Glaspetrischale, 8,5 cm Filterpapier Kreise und zweischneidiges Messer prep.
   2. Legen Sie ein Stück Filterpapier in der Petrischale übertragen und mehrere Messer gezückt auf das Filterpapier in der Petrischale.
   3. Wiederholt Schicht Filterpapier und Klingen, bis der Petrischale ist in etwa 75% gefüllt, mit Abdeckung Witzh Petrischale Deckel und Autoklaven. Bewahren Sie in einem sterilen oder geschlossenen Umgebung, um die Sterilität zu bewahren.
   4. Autoklav 18 cm Pinzette und ein autoklavierbares Mutter-Fahrer in einem Sterilisationsbeutel. Für cGMP-Produktion, Autoklavieren mehrere Shim-Scheiben aus Edelstahl in Sterilisationsbeutel. Für weitere Informationen bezüglich der Shim Scheibe, siehe Schritt 3.5.
   5. Reinigen Sie das Bio-Sicherheitsschrank (BSC) mit 70% Isopropylalkohol (IPA).
   6. Alle Vorgänge in einer BSC durchgeführt werden, um die Sterilität zu erhalten. Aseptischen Bedingungen wird die folgende in den BSC:
      1. McIlwain Tissue Chopper (Chopper). Wischen Sie alle Oberflächen mit 70% IPA, insbesondere den Chopper Arm (Abbildung 1B). Die gesamte Chopper kann mit Ethylenoxid falls dekontaminiert werden.
      2. Eine autoklaviert Mutter-oder Mutter-Fahrer Schlüssel (mit dem Chopper, 1I enthalten), ein 18 cm Pinzette, ein Satz von Standardgröße Mikropipetten (20 ul-1, 000 ul), ein pipetaid und Glaseinsätze.
      3. Sterile Einweg serologischen Pipetten, Pipettenspitzen Barriere, 15 ml konische Röhrchen, 60 mm Petrischalen, Doppel-Rand prep Klingen und entsprechend großen T-Flaschen. VORSICHT: Nur behandeln die scharfen Klingen mit einer Pinzette.
2. Reagenzien
   1. Erweitern hNPCs im Wartungs Medien (MM), bestehend aus Neural Stem Cell Expansion Medium, EGF bei 100 ng / ml und Leukämie (LIF) bei 10 ng / ml. Übertragung der Reagenzien und Filtrationseinrichtung (en) erforderlich ist, um Medien in die BSC vorzubereiten.
   2. Re-suspend des gefriergetrockneten EGF mit Neural Stem Cell Expansion Medium und bereiten Aliquots bei 100 ug / ml bei -80 ° C für bis zu 1 Jahr zu speichern. LIF wird gespeichert, wie bei 4 ° C für bis zu 6 Monate oder das Verfallsdatum des Herstellers erhältlich.
   3. Übertragen MM Reagenzien in die BSC. Kombinieren Sie alle Reagenzien in einem entsprechend dimensionierten Filtervorrichtung und Filter mit einem Vakuumgerät. Lagern bei 4 ° C bis zu 3 Wochen.
3. hNPC Beobachtungen
   1. Die zwei wichtigsten Faktoren, die vor Hacken Adresse ist Kugeldurchmesser und Medienanlage oder Farbe. Konditioniertes Medium (CM) als Medium, das durch die hNPCs in Kultur unter Bedingungen Inkubator (37 ° C, 5% CO _2, 95% Luftfeuchtigkeit) metabolisiert wurde definiert. Da die Zellen verstoffwechseln die Medien das Phenol Rot-Komponente wird von einem rosa zu gelb Farbverschiebung bedeutet eine saure Umgebung (5D).
   2. Halten Sie die Flasche (n) des hNPCs gegen das Licht, um das Medium Farbe ansprechen (siehe Diskussion für Details).
   3. Abtastung durch den Kolben, der mit einem Mikroskop, um die Zellen zu beobachten. Verwenden Sie ein Fadenkreuz zu Kugelgröße zu untersuchen. Wenn viele Kugeln haben einen Durchmesser von 300 um oder mehr, fahren Sie mit dem Hackprozess. Hacken Sie die Zellen alle 7-10 Tage.
   4. Wenn ein Kotelett nicht gerechtfertigt ist, den Austausch von 25 bis 75% der CM mit frischem Medium alle 3-4 Tage, je nachdem wie schnell die Zellen Metabolisierung die Medien. Conweiterhin zu Medien austauschen, bis die Kugeln die groß genug ist, um den Durchgang sind.
   5. hNPCs werden typischerweise in einem Verhältnis von 1:2 zerkleinert, von kleineren zu größeren Kolben Kolben. Verwenden Sie Tabelle 1 als Nachschlagewerk für Kolben, Größe und Volumen Empfehlungen.

Flasche	Volumen der gesamten Medien-	Pre-Chop-	→	Post-Chop-
1 T12.5	5 ml	1 T12.5	→	1 T25
1 T25	10 ml	1 T25	→	1 T75
1 T75	20 ml	1 T75	→	1 T175
1 T175	40 ml	1 T175	→	2 T175s
80 ml	2 T175s *	→	4 T175s
* 2 T175s ist die maximale Anzahl von Kolben, die zu einer Zeit zerkleinert werden können. Hacken Sie in Gruppen von 2 T175s und beziehen sich auf Schritt 7 fort.

2 T175s

Tabelle 1. HNPC Expansion Paradigma. Beschreibung eines typischen Expansionsschema für hNPCs. Es ist Standard zu erweitern zweifach volumetrisch alle 7-10 Tage.

3. Chopper-Setup

Abbildung 1. McIlwain Tissue Chopper. A) hacken Dickeneinstellung Mikrometer, B) Chopper Arm Basis und Arm befestigt, C) Haken auf Platte Halter für Petrischale, D) Tabelle Freigabeknopf und Fach, E) Klingenkraft-Steuerknopf, F), Reset-Schalter, G) Plattenhalter, H) Schraubbefestigung für Blade-, Verschluss und Mutter, I) Muttergreifer mit Chopper, J) Schild / Wurfmutter, K) Blade-Verschluss, L enthalten ) automatische Schneidegeschwindigkeitsregler, M) Manuelle Schneide Arm Bedienknopf, N) Netzschalter.

1. Stecken Sie den Hubschrauber in eine Steckdose in der BSC und schalten Sie den Netzschalter (Abbildung 1 N). Stellen Sie den Schneidspalt bis 200 um (Abbildung 1A). Stellen Sie die Messerkraft auf 270 ° oder 09.00 Uhr, wenn der Knopf war eine Uhr (1E). Bestätigen Sie, dass die automatische Drehzahlknopf so weit wie möglich gegen den Uhrzeigersinn gedreht. (Fig. 1L).
2. Bewegen Sie den Tisch Release alle den Weg nach rechts bestätigen der Plattenhalter stabil (1D) ist.
3. Drehen Sie den Herstelleral Arm Manipulator im Uhrzeigersinn, um den Arm zu ihrer maximalen Höhe (Abbildung 1 M) zu erhöhen. Das Handbuch Arm Manipulator darf nur im Uhrzeigersinn gedreht werden.
4. Eine sterile, zweischneidige Hackmesser aseptischen Bedingungen auf den Arm Chopper Schraube mit einer Pinzette (Abbildung 1H).
5. Führen Sie diesen Schritt nur für die cGMP-Passage, als die Petrischale allein reicht für Forschungsqualität Verarbeitung. Wie in Schritt 2.1.4 beschrieben, werden Shim Scheiben innerhalb der Petrischale gelegt Basis für cGMP erforderlich. Das Abstandsscheibe verhindert, dass Kunststoffsplitter von der Einbeziehung in die Sphären während des Schneideverfahren. Für jede geplante hacken, übertragen eine Scheibe Scheibe in der Basis jeder Petrischale und Deckel.
6. Aseptisch platzieren Sie den Verschluss (Abbildung 1K) über die Klinge mit der Zange. Der gekrümmte Abschnitt des Hakens muss über die Oberkante des Arms sein. Der Verschluss wird nicht auf dem Arm bleiben, bis die Mutter ist sicher gestaltet. Verwenden Sie die Zange, um die klassischen haltenp auf den Arm und die Mutter (Bild 1J) sichern auf den Bolzen mit dem sterilen Mutter-Fahrer. Lassen Sie die Mutter ¼ Drehung locker.

4. Pre-chop Ordnung

1. Übertragen Sie die vorgeschlagenen Volumen von MM in die neue Flasche (n) nach Tabelle 2, Spalte C.
2. Die Zellen aseptischen Bedingungen aus dem Inkubator in die BSC. Die Flasche (n) Lean an einer Rohrgestell (2A) und lassen die Kugeln in der Flasche (n) zu begleichen.
3. Einmal abgeschlossen, absaugen bis 12 ml des Überstands mit 5 ml oder 10 ml serologische Pipette und spülen alle locker anhaftenden Kügelchen von der Oberfläche der Flasche (n). Bei Bedarf wiederholen und sich die Kugeln zwischen Spülungen.
4. Übertragen Sie die vorgeschlagenen Volumen von CM in die neue Flasche (n) nach Tabelle 2, Spalte D. Passagieren Wenn zwei oder mehr T175-Flaschen, siehe Schritt 7.1.
5. Übertragen Sie alle verbleibenden CM und Kugeln in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. Lassen Sie die Kugeln zu settle und die verwendete Flasche (n) zu verwerfen.
6. Critical Schritt: Langsam übertragen Sie die Kugeln aus den 15 ml konischen Röhrchen auf die 60 mm Petrischale oder Shim Scheibe in der niedrigsten Lautstärke machbar; 0,1-0,5 ml empfohlen (Fig. 2B). Halten Sie das verbleibende Volumen von CM wie es wird verwendet, um die Zellen von der Schale Post-chop spülen. Versuchen Sie, die Oberfläche, die durch die Medien und die Kugeln auf dem Teller (2C) abgedeckt minimieren.

Abbildung 2. Sphere Vorbereitung für das Hacken. A) die Flasche (n) Lean gegen einen Rohrgestell oder ähnlichen Gegenstand die Kugeln in der Ecke des Kolbens. Begleichen B) Bringen Sie die Kugeln so dicht wie möglich von der konischen Rohr an der Petri Gericht. C) Pool die Kugeln aus dem konischen Rohr in ter Mitte der Petrischale. D) Entfernen Sie so viel wie möglich von Überstand der Spitze der vereinigten Sphären. E) Verbreiten Sie die Kugeln mit Hilfe der Seite eines Kunststoff-Mikropipettenspitze. F) vorsichtig bewegen die Kugeln auf der einen Seite des Pools . G) Beispiel von Kugeln, die auf der einen Seite des Pools verschoben wurden Medien Entfernung zu erleichtern. H) Condensed Kugeln ausgebreitet auf der Petrischale, bereit zum Hacken. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

7. Als nächstes müssen die Kugeln durch Entfernen des Überstandes über die in Schritt 4.6 übertragen kondensiert werden. Den Überstand wieder in die 15 ml konischen Röhrchen mit einem Aerosol barriere gekippt Mikropipette (2D), vermeiden Sie die Entfernung der Kugeln. Beginnen Sie, indem Sie so viel wie möglich von Medien der Spitze der media / Zellpool. Wenn es nicht möglich ist,Medien ohne Kugeln zu entfernen, mit dem folgenden Schritt fort.

Spalte A		Spalte B	Spalte C	Spalte D	Spalte E	Spalte F
Pre-Chop-Flask Größe	→	Post-Chop-Flasche (n) Größe	Empfohlene Volumen von MM auf neue Kolben (e) vorge hacken übertragen	Empfohlene Volumen von CM auf neue Flasche (n) vorge hacken übertragen	Empfohlene Volumen von Kugeln / media in neue Flasche (n) Post-chop übertragen	Schluss Volume Gesetzte / Flask
T12.5	→	T25	5 ml	0 ml	5 ml	10 ml
T25	→	T75	10 ml	0 ml	10 ml	20 ml
T75	→	T175	20 ml	10 ml	10 ml	40 ml
1 T175	→	2 T175s	20 ml pro Flasche	15 ml pro Flasche	5 ml pro Flasche	40 ml
2 T75s	→	4 T175s	20 ml pro Flasche	17,5 ml pro Flasche	2,5 ml pro Kolben	40 ml

Tabelle 2. Medienübertragungsführungs Pre / Post-hacken. Empfohlene Volumina während des Schneideprozesses zu verwenden.

8. Verbreiten Sie den Pool aus mit der Seite der Pipettenspitze, um die Oberfläche (Abbildung 2E) zu erhöhen.
9. Critical Schritt: Kippen Sie die Petrischale leicht zu sich hin und verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze vorsichtig slide alle Kugeln auf der einen Seite des Beckens (2F, G).
10. Critical Schritt: Wenn alle Zellen wurden verlegt, langsam Spitze der Petrischale die entgegengesetzte Richtung. Während des Prozesses werden die Medien allein von den Kugeln fließen. Übertragen Sie die Medien wieder in die 15 ml konischen Röhrchen. Minimale Entfernung Sphäre ist akzeptabel.
11. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze zu schieben Sie alle Kugeln wieder in die Mitte der Petrischale so der Pool hat einen Durchmesser von 0,5 bis 2,4 cm (2H). Es ist wichtig, um die Tiefe der Kugel flach Pool zu halten. Wenn der Pool ist zu tief, die Kugeln werden einfach beiseite geschoben werden während hacken. HINWEIS: Der Durchmesser der Kugel Pool kann nicht mehr als 2,5 cm sein, oder die Klinge die Ränder der Petrischale zu kontaktieren, fehlt die Zellen.

5. Chop-Verfahren

1. Übertragen Sie die Petrischale auf den Plattenhalter (1G) und sorgen für die Schalewird unter den Plattenhalter Haken (1C) gesichert.
2. Die Tabelle Auslöseknopf weist Kerben, wo es in die Gänge passen. Verwenden Sie die Tabelle Auslöseknopf, um den Plattenhalter nach links schieben, so dass die Klinge ist klar, der Sphären und in Gang (1D) gesperrt.
3. Critical Schritt: Senken Sie den Arm Chopper durch Drehen des Hand Manipulator Knopf (Abbildung 1 M) im Uhrzeigersinn drehen, bis das Messer schnappt sich flach auf die Petrischale. Mit einer Hand auf den Arm Halterung (1B) nach unten drücken, während das Anziehen der Mutter mit dem Steckschlüssel.
4. Drücken Sie den Reset-Taste einmal (1F). Stabilisieren die Petrischale mit einer Hand, während Sie den automatischen Arm Manipulator Knopf (Abbildung 1 l) im Uhrzeigersinn in die 90 °-Position oder 12.00 Uhr, wenn der Knopf war eine Uhr. ACHTUNG: Halten Sie die Finger weg von der Laufschaufel zu allen Zeiten.
5. Übergeben Sie die Klinge vollständig durch den Pool von Kugeln. Drehen Sie den Plattenhalter90 ° ist.
6. Lösen Sie die Schraube und wiederholen Sie Schritt 5,3 bis 5,5.
7. Die Petrischale aseptischen Bedingungen wird von der Plattenhalter auf einen Arbeitsraum in der BSC.

6. Post-chop Ordnung

1. Prime 10 ml serologische Pipette mit dem CM im konischen Rohr von Schritt 4.6 und übertragen dann 1 ml auf den gehackten Sphären. Vorsichtig resuspendieren und übertragen in eine neue 15 ml konischen Röhrchen. Vermeiden Sie Blasen und wiederholen Sie so oft wie nötig, um die gehackten Kugeln zu sammeln.
   TIPP: Minimieren Abkratzen der Kunststoffschale als Fragmente können abheben. Dies ist kein Problem, wenn mit Hilfe der Einstellscheibe Edelstahlscheiben. Hüten Sie sich vor Zellen Befestigung an der Innenseite der Kunststoff serologischen Pipette. Wenn dies auftritt, absaugen Blasen intermittierend durch Medien in der Pipette, um die Zellen abzulösen.
2. Messen des Volumens des CM und gehackte Kugeln. Fügen Sie den entsprechenden Volumen von MM, die in Tabelle 2 aufgeführten Lautstärke, Spalte E zu erreichen.
3. Man reibt dieKugeln 2-3x um jegliche lose verschmolzen Sphären.
4. Critical Schritt: aliquotieren die Kugel Suspension in jeder neuen Flasche. Nur die Kugel Suspension Transfer in ein Kolben in einer Zeit, und wieder aussetzen die Kugeln zwischen den Übertragungen. Aliquotierung mehrere Flaschen zu einer Zeit, führt zu einer unverhältnismäßig hohen Anzahl von Kugeln in jeder Flasche. Das Endvolumen in jedem Kolben sollten die Mengen in Tabelle 2, Spalte F entsprechen. Siehe Schritt 7.2 bei der Aussaat von mehr als zwei T175-Flaschen.
5. Entfernen Sie die Mutter mit der Mutter-Treiber und dann die Spange mit den sterilen Pinzette. Dekontaminieren entsprechend mit 70% IPA oder gleichwertig. ACHTUNG: nur mit einer Zange entfernen verwendet Hackmesser und entsorgen in einem Bio-Hazard Behälter für scharfe Gegenstände.
6. Dekontaminieren alle Oberflächen des Choppers mit 70% IPA.

. 7 Prozess Variationen - Mehrere Flaschen

Es gibt einige Unterschiede, wenn mehr als zwei Passagieren T175s. Der Schritts unten sind Änderungen des referenzierten Schritt.

1. Referenzen zu Schritt 4.4:
   1. Wenn zwei Passagieren T175s, kombinieren alle Medien und Kugeln in einem T175-Flaschen. Lassen Sie die Kugeln in jede der neuen Flaschen absetzen und dann aliquotiert das entsprechende Volumen von CM wie in Tabelle 2 angegeben, Spalte D. Gehen Sie zu Schritt 4.5.
   2. Wenn Passagieren größer als zwei T175s, T175 eine neue Flasche und Etikett zu erhalten, wie die CM-Kolben. Führen Sie Schritt 7.1.1, sondern übertragen die CM in die CM-Kolben. Lagern Sie den Kolben auf der Seite des BSC verwendet, um die CM von allen Flaschen sammeln, bis alle Flaschen wurden gehackt. Dann wird der CM wird gleichmäßig in jede der neuen Flaschen aliquotiert werden.
2. Referenz Schritt 6.4 - Wenn hacken die gleiche Zelllinie mehrfach, übertragen Sie die gehackte Kugel Suspension in eine neue T75-Flasche beschriftet Sphären post hacken und notieren Sie die Lautstärke übertragen. Weiter, um die Zellen in diese kombinierenFlasche nach jedem Hieb und der Kolben in den Inkubator zu speichern, auf 37 ° C, 5% CO _2, 95% Luftfeuchtigkeit. Nachdem alle Koteletts abgeschlossen sind, aliquotiert die Kugel Suspension in Volumen in jeder neuen Flasche. Fahren Sie mit Schritt 6.5.

8. Kryokonservierung

Das folgende Protokoll ist für die Erhaltung kryogenisch hNPCs.

1. Auftauen Zellgefriermedium in einem sauberen Wasserbad bei 37 ° C und dann auf Eis zu speichern. Zellgefriermedium können aliquotiert und bei -80 ˚ C gelagert werden für bis zu 6 Monate.
2. Feuer Lack Glas Pasteur Pipetten durch Drehen der Öffnung der Pipette in einer Flamme. Bereiten Sie mindestens zwei große und zwei kleine Bohrung feuerpolierten Pipetten (Abbildung 3). Die Kugeln werden durch den Übergang von großen zu kleinen Bohrung Pipetten getrennt werden.
3. Platzieren TrypLE Select im Wasserbad bei 37 ° C für 5 min. Bringen und bei Raumtemperatur bis zur Verwendung.

Abbildung 3. Brand Polieren von Glas Pasteur Pipetten. A) Halten Sie die Pipette in den oberen Teil der Flamme und Spin, um gleichmäßig um die Kanten der Glaspipette. B) Beispiel eines großkalibrigen feuerpolierte Glaspipette. C) Beispiel eines Kleinkaliberfeuerpolierte Glaspipette.

4. Die Neurosphären aseptischen Bedingungen in die BSC. Lassen Sie die Kugeln auf, indem er sich die Flasche (n) gegen einen Rohrgestell absetzen und spülen Sie den Boden des Kolbens, alle lose anhaftenden Kugeln zu entfernen. Lassen Sie die Kugeln die Niederlassung.
5. Übertragen Sie alle aber 5-10 ml CM in eine sterile Flasche und messen Sie die Gesamtlautstärke. Die restlichen Kugeln und Medien in einer konischen Röhre.
6. Nachdem alle Zellen angesiedelt haben, übertragen Sie alle, aber einer kleinen Meniskus des CM in die Flasche und summieren die volume.
7. Aseptischen Bedingungen 5-10 ml warmem TrypLE Wählen Sie in den konischen Rohr und erneut zu suspendieren das Zellpellet. Übertragen des konischen Rohrs in das 37 ° C Wasserbad für 15-20 min. Nach 7,5 bis 10 min, schütteln die konischen Rohr zu mischen.
8. Verwenden Sie die gemessenen CM Volumen von Schritt 8.5 und bereiten ein gleiches Volumen MM. Kombinieren und filtern Sie die 50% und 50% CM MM-Lösung (CM / MM-Lösung).
9. Ein 40 um Sieb in einem 50 ml konischen Röhrchen aseptischen Bedingungen.
10. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, drehen die 15 ml konische Röhrchen für 15 Sekunden bei 100 x g.
11. Vorsichtig absaugen und entsorgen Sie die TrypLE auswählen und jede faden Substrat. Einen kleinen Meniskus. Sanft fügen 2-4 ml CM / MM, um die verbleibende TrypLE Wählen verdünnen, während nicht störende Pellets. Lassen Sie alle Zellen verdrängt vor der Entsorgung des Wasch neu zu regeln.
12. In 2-5 ml CM / MM-Lösung zur Rohr Sphären. Distanzieren die Kugeln mit einer 5 ml Pipette durch Verreiben maximal 10x. Lassen Sie den undissoziierten Kugeln nieder für 1-2 min. Übertragen Sie die dissoziierten Zellsuspension auf die 40 um Sieb, um vollständig undissoziierter Cluster entfernen.
13. Wiederholen Sie Schritt 8.12 mit einer feuerpolierten großer Bohrung Glaspipette und dann einem Kleinkaliberglaspipette.
14. Spülen Sie das Sieb mit 5.2 ml CM / MM-Lösung.
15. Mischen Sie die Zellsuspension und Proben zu entfernen für die Lebensfähigkeit Analyse.
16. Verdünnen Sie die Proben mit Trypanblau in einer entsprechenden Verdünnungsfaktor und zu zählen. Verwenden Sie die Standard-Gleichung aus, um den durchschnittlichen Lebendzellkonzentration berechnen und berechnen die Gesamtkeimzellen.
    
17. Berechnen des Gesamtvolumens des Zellgefriermedium erforderlich zum Resuspendieren der Zellen mit 5,0 × 10 ⁶ Zellen / ml. 1 ml der Zellen in jeder Kryoröhrchen ausgesät werden. Übertragen Sie die Kryoröhrchen in die BSC.
18. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C in 15 ml konische Röhrchen für die beste Ausbeute. Wenn 50 ml konischen Röhrchen werden in großem Umfang einfrieren unten verwendet wird, erhöhen Rate und Zeit, um 400 g für 10 min.
19. Resuspendieren des Zellpellets unter Verwendung der Zellgefriermedium bei 5,0 x 10 ⁶ Zellen / ml. Aliquote von 1 ml der Zellsuspension in jede Kryoröhrchen. Für eine gleichmäßige Verteilung, absaugen 6 ml Suspension und aliquoten 5 x 1 ml Kryoröhrchen. Übertragen Sie die restlichen 1 ml Suspension wieder in den Pool der Zellen. Wiederholen, bis alle Fläschchen gefüllt wurden.
20. Aseptisch Dichtung alle entkernt Kryoröhrchen und übertragen Sie sie auf Eis für 5-10 min.
21. Verwenden Sie eine der folgenden für die Kryokonservierung Strategien, um die hNPCs bewahren: Isopropylalkohol Kammer
    1. Bitte geben Sie die gewünschte Anzahl der Kammer (n) mit 100% IPA bei Raumtemperatur.
    2. Übertragen Sie die gesäten Kryoröhrchen aus Eis in die Kammer (n) und der Kammer (n) zu übertragen in eine -80 ° C-Gefrierschrank über Nacht. Die Zellen werden bei -80 ° C für bis zu eine Woche stabil, jedochwird vorgeschlagen, die Fläschchen zu langfristigen Lagerung in flüssigem Stickstoff über am folgenden Tag.

    Kontrollierte bewerten Gefrierschrank

    3. Laden Sie ein geeignetes Programm zum Einfrieren der Software des kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierschrank ist. Ein Beispiel-Programm in Tabelle 3 aufgeführt. Fig. 4 zeigt eine typische Kurve für Gefrier hNPCs. Allerdings wird das genaue Programm für jeden Gefrierschrank Modell variieren. Die Standard-Gesamtsamplerate sollte in der Nähe -1 ° C / min bis -40 ° C erreicht, wo die Gefriergeschwindigkeit kann wesentlich erhöht werden, um mindestens -80 ° C

Schritt	Rate (° C)	Endtemperatur (° C)	Halten (min sec)	Trigger-
1	-	-	5 min 0 sec	Kammer
2	- 1,3	- 5	-	Probe
3	-	-	1 min 0 sec	Kammer
4	- 45	- 58	-	Kammer
5	+ 10	- 26	-	Kammer
6	+ 3	- 23	-	Kammer
7	- 0,8	- 40	-	Probe
8	- 10	- 100	-	Kammer
9	- 35	- 160	-	Kammer

Tabelle 3. Schritte zum Einfrieren hNPCs kontrolliert raß Gefrierschrank. Programmvorschlag für hNPC Kryokonservierung auf einer kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierschrank.

Abbildung 4. Probengefrierkurve. Typische Gefrierkurve für hNPCs auf einer kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierschrank.

21. 4. Übertragen Sie die Kryoröhrchen aus Eis in den Körben mit dem Steuersatz Gefrierschrank verbunden. Achten Sie darauf, ein Kryoröhrchen mit nur Zelle gefrierenden Medien, um für die Probentemperaturfühler verwenden zu laden. Übertragen Sie die Körbe in die Gefrierkammer und legen Sie die Probensonde in die Sonde Fläschchen. Starten Sie das Programm.
    5. Wenn das Protokoll abgeschlossen ist, übertragen Sie die Fläschchen in langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff.

9. Auftauen

Das folgende Protokoll ist zum Auftauen tiefkalt phNPCs vorbehalten.

1. Übertragen Sie die Kryoröhrchen aus Flüssigstickstofflager sofort auf Trockeneis. ACHTUNG: Die Fläschchen können Risse oder lose Deckel ermöglicht flüssigem Stickstoff, um das Fläschchen zu betreten. Wenn von Tiefkühlbedingungen entfernt, kann die Flüssigkeit zu kochen, sofort explodiert das Fläschchen. Verwenden Sie geeignete PSA beim Entfernen der Fläschchen.
2. Vorbereitung Alle Reagenzien und Materialien unten vor der Zeit. Sobald das Auftauen begonnen hat, ist es wichtig, durch effizient zu folgen.
   1. Übertragen Neural Stem Cell Expansion Medium, MM, 15 ml konischen Röhrchen, ein 2 ml und 10 ml einer serologischen Pipette für jedes Kryoröhrchen in die BSC.
   2. Ein Minimum von 9 ml Nervenzellenexpansionsmedium und 5 ml MM wird für jedes Fläschchen erforderlich. Bereiten Sie mehr von einzelnen Medien, falls erforderlich.
3. Nur auftauen ein Fläschchen hNPCs zu einer Zeit. Übertragen Sie die gefrorenen Zellen aus Trockeneis in einen sauberen 37 ° C Wasserbad und rühren Sie die Fläschchen im Wasserbad kontinuierlich. Überwachen Sie die LautstärkeEis, das geschmolzen ist. Wenn es ein Stück Eis etwa 0,5 cm in der Flasche gelassen, sprühen und wischen Sie mit 70% igem Alkohol und übertragen in die BSC.
4. Übertragen des Inhalts der Kryoröhrchen in ein 15 ml konisches Röhrchen mit 2 ml serologische Pipette. 1 ml der Neural Stem Cell Expansion Medium auf die leere Kryoröhrchen und dann übertragen 8 ml Neural Stem Cell Expansion Medium auf die aufgetauten Zellen in einer langsamen, tropfenweise Weise unter leichtem Schütteln der Röhre. Dies erfolgt, um das Risiko osmotischer Schock zu verringern.
5. Übertragung der Spülung aus dem Kryoröhrchen mit den 9 ml Zellsuspension. Übertragen Sie die konische Röhrchen auf Eis und wiederholen Sie die Schritte 9,4-9,5 für alle übrigen Fläschchen.
6. Zentrifugieren konische Röhrchen bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Während der Zentrifugation, bereiten Sie die entsprechende Anzahl von Flaschen für die Aussaat auf Basis von Tabelle 4.

# Von Vials	Insgesamt Seeding Volumen (ml)	Flasche
1	5	T12.5
2	10	T25
3	15	T75
4	20	T75
5	25	T75
6	30	T175
7	35	T175
8	40	T175
8 +	-	Kombination von Flaschen

Tabelle 4. Kolbengrößen basierend auf der Anzahl der Tieftemperaturampullen aufgetaut. Empfohlene Volumen und Kolbengröße zu hNPCs nach dem Auftauen Saatgut.

7. Re-suspendieren und alle Rohre in dem entsprechenden Volumen von MM auf Basis von Tabelle 4 zu kombinieren. Gut mischen und neubewegen, eine Probe für die Lebensfähigkeit Zählen. Siehe Schritte 8,15-8,16 zum Zählen Details. Die Standard-Aussaat Bereich liegt zwischen 160,000-320,000 Zellen / cm ^2.
8. Mischen Sie die Zellen gut und aliquotiert die Zellen in Flaschen. Übertragen Sie die Flaschen zu einer 5% CO _2/37 ° C/95% Luftfeuchtigkeit Inkubator. Mischen Sie die Flasche durch leichtes Schütteln hin und her, um gleichmäßige Verteilung der Zellen.
9. Die Zellen werden innerhalb von 24-48 h Kugeln zu bilden. Gelegentlich werden die Zellen auf der Kunststoffoberfläche haften und bilden eine wabenartige Kolonie Verteilung. Wenn dies der Fall ist, lassen Sie die Zellen für 3 Tage vor dem Spülen der Zellen locker, Beihilfe in der Sphäre Bildung. Spülen Sie alle 1-3 Tage, bis es keine adhärenten Zellen. Ggf. Übertragung der Zellen in einen neuen Kolben.
10. Wechsel 25-75% der Medien mit MM alle 3-4 Tage, bis die Zellen bereit sind, hacken, in der Regel 7-14 Tage nach dem Auftauen.

Ergebnisse

Abbildung 5. Repräsentative Daten. A) Projizierte Zellzahlen von hNPCs an p19 eingefroren, aufgetaut und dann als Anhänger Monolayer mit enzymatischen Dissoziation im Vergleich zu Neurosphären über den Hack Verfahren agiert erweitert. Tag 0 stellt, wenn die Zellen aufgetaut p20 bei B.) Repräsentative Bilder von Kugeln vor, hacken, 10X.

Diskussion

Abbildung 6. Chopping Schema. Erweiterung Sphäroid Stammzellen / Vorläuferzellen in Kultur mit Hilfe der mechanischen Hackmethode.

Kritische Schritte

Eine Übersicht des Hackexpansions Paradigma ist in Fig. 6 gezeigt. HNPC Kugelgröße ist einer der wichtigen Kriterien, die bei Passage der...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Becherglas, 50 ml	Fisherbrand	FB-100-50	mehrere Hersteller/Lieferanten
Bio-Sicherheitswerkbank, Klasse II	Baker	SG-603A	4 Fuß oder 6 Fuß Modell.  6 Fuß Modell empfohlen; mehrere Hersteller/Lieferanten
Klingen, Doppelschneidig Prep	Personna	74-0002	mehrere Hersteller/Lieferanten.  ACHTUNG: Sharp
Cell Freezing Media	Sigma-Aldrich	C6295-50ML	DMSO, serumfreie
Zentrifuge, Schwenkeimer mit 15 ml Einsätzen	Eppendorf	5810 R	mehrere Hersteller/Lieferanten
Konische Röhrchen, 15 ml	Fisherbrand	S50712	mehrere Hersteller/Lieferanten
Konische Röhrchen, 50 ml	BD Falcon	352074	mehrere Hersteller/ Lieferanten
Controlled Rate Freezer	Planer	Kryo 750	mehrere Hersteller/Lieferanten
Kryofläschchen, 2 ml	Corning	430488	mehrere Hersteller/Lieferanten
Kulturflasche, belüftet, T12.5	BD Falcon	353107	mehrere Hersteller/Lieferanten
Kulturflasche, belüftet, T25	BD Falcon	353081	mehrere Hersteller/Lieferanten
Kulturflasche, belüftet, T175	BD Falcon	353045	mehreren Herstellern/Lieferanten
Kulturflasche, belüftet, T75	BD Falcon	353110	mehrere Hersteller/Lieferanten
Filter, 0,22 & Mikro; m, angebauter Becher, 1 L	Millipore	SCGPU11RE	verschiedenen Herstellern/Lieferanten
Filter, 0,22 & micro; m, Aufsatzbecher, 150 ml	Millipore	SCGVU01RE	verschiedenen Herstellern/Lieferanten
Filter, 0,22 & Mikro; m, Aufsatzbecher, 500 ml	Millipore	SCGPU05RE	diverse Hersteller/Lieferanten
Filter, 0,22 & Mikro; m, beigefügter Becher, 50 ml	Millipore	SCGP00525	diverse Hersteller/Lieferanten
Filterpapier, 8,5 cm Kreise	Whatman/GE	1001-085
Pinzette, Standardmuster - gezahnt/gebogen/18 cm	Fine Science	11001-18
Gefrierkammer, Isopropylalkohol	Nalgene	5100-0001	"Mr. Frosty"
Inkubator, 37 > C/5% CO2	Forma	370 Serie	mehrere Hersteller/Lieferanten
Hemazytometer, Phase	Hausser Scientific	1475	mehrere Hersteller/Lieferanten
McIlwain Tissue Chopper	Lafayette Instruments	TC752-PD&	nbsp; Modifikation der Petrischale erforderlich.   VORSICHT:  Bewegliche, scharfe Klinge.
Mikropipette, 1-10 μ l	Gilson	F144562	mehrere Hersteller/Lieferanten
Mikropipettor, 100-1.000 μ l (Starterkit)	Gilson	F167700	mehrere Hersteller/Lieferanten
Mikropipettor, 2-20 μ l (Starterkit)	Gilson	F167700	mehrere Hersteller/Lieferanten
Mikropipettor, 20-200 μ l (Starterkit)	Gilson	F167700	mehrere Hersteller/Lieferanten
Steckschlüssel, autoklavierbar, 5/16"	Steritool	10302
Pasteurpipetten, mit Baumwollstecker	Fisherbrand	13-678-8B	mehrere Hersteller/Lieferanten
Petrischale, Glas, autoklavierbar	Corning	3160-100
Pipettierhilfe	Drummond	4-000-101	mehrere Hersteller/Lieferanten
Unterlegscheibe	McMaster-Carr	VARIABLE	mehrere Hersteller/Lieferanten
Pipettenspitzen mit Sterilbarriere, 10 μ l	AvantGuard	AV10R-H	mehrere Hersteller/Lieferanten
Pipettenspitzen mit Sterilbarriere, 1.000 μ l	AvantGuard	AV1000	mehrere Hersteller/Lieferanten
Pipettenspitzen mit Sterilbarriere, 20 μ l	AvantGuard	AV20-H	mehrere Hersteller/Lieferanten
Sterilbarriere Pipettenspitzen, 200 μ l	AvantGuard	AV200-H	mehrere Hersteller/Lieferanten
Sterile Einwegpipetten, Vollkunststofffolie, 10 ml	Fisherbrand	13-676-10J	mehrere Hersteller/Lieferanten
Sterile Einwegpipetten, Vollkunststofffolie, 2 ml	Fisherbrand	13-675-3C	mehrere Hersteller/Lieferanten
Sterile Einwegpipetten, Vollkunststofffolie, 25 ml	Fisherbrand	13-676-10K	mehrere Hersteller/Lieferanten
Sterile Einwegpipetten, Vollkunststofffolie, 5 ml	Fisherbrand	13-676-10H	mehrere Hersteller/Lieferanten
Sterilisationsbeutel, 19 x 33 cm	Crosstex	SCL	mehrere Hersteller/Lieferanten
Sieb, 40 & micro; m	BD Falcon	352340
Gewebekulturschalen, 60 mm	BD Falcon 351007
Röhrchengestelle, ineinandergreifende Vierwege	Fisherbrand	03-448-17
Wasserbad	Fisherbrand	S52602Q	mehrere Hersteller/Lieferanten
Neuronale Vorläuferzellen Zellspezifische Verarbeitungsreagenzien
Neuronale Stammzelle Expansion Medium (Stemline)	Sigma-Aldrich	S3194-500ML	Wichtig für die Verwendung der Marke Stemline
Rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Millipore	GF316	mehrere Hersteller/Lieferanten
Rekombinanter humaner Leukämie-Hemmfaktor (LIF)	Millipore	LIF1010	mehrere Hersteller/Lieferanten
Trypan Blue (0,4%)	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	mehrere Hersteller/Lieferanten
TrypLE Select (1x)	Life Technologies	12563-011