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Methodenartikel

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

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DOI:

10.3791/51220

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11. April 2014

 , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Zusammenfassung

Chromatin ist ein hochdynamisches Nukleoprotein-Komplex von DNA und Proteinen, die verschiedene DNA-abhängige Prozesse kontrolliert werden. Chromatin-Struktur und Funktion in bestimmten Bereichen durch die lokale Anreicherung von Histon post-translationale Modifikationen (hPTMs) und Varianten, Chromatin-bindende Proteine, einschließlich Transkriptionsfaktoren und DNA-Methylierung reguliert. Die Proteom-Charakterisierung von Chromatin Zusammensetzung an unterschiedlichen Funktionsbereiche wurde bisher durch das Fehlen effizienter Protokolle, um solche Domänen an der entsprechenden Reinheit und Menge für die anschließende eingehende Analyse durch Massenspektrometrie (MS) bereichern behindert. Wir beschreiben hier eine neu gestaltete Chromatin Proteomik Strategie, genannt ChroP (Chro matin roteomics P), wobei ein Präparat Chromatinimmunpräzipitation wird verwendet, um verschiedene Chromatin-Regionen, deren Merkmale in Bezug auf hPTMs, Varianten und Co-assoziierte Nicht-Histon-Proteine ​​zu isolieren, sind MS analysiert. Wir veranschaulichen, erre die Einrichtung von ChroP zur Anreicherung und Analyse von transkriptionell stillen heterochromatischen Regionen, durch die Anwesenheit von Tri-Methylierung von Lysin 9 am Histon H3 markiert. Die erzielten Ergebnisse zeigen das Potenzial der ChroP gründlich Charakterisierung des Proteoms Heterochromatin und beweisen Sie es als ein leistungsfähiges Analyse-Strategie zu verstehen, wie die unterschiedlichen Protein Determinanten von Chromatin interagieren und Synergie zu Locus-spezifischen strukturellen und funktionalen Konfigurationen zu etablieren.

Einleitung

Chromatin ist eine hoch dynamische Nukleoproteinkomplex, die als Vorlage für alle primären DNA-vermittelten Prozessen beteiligt ist. Das Nukleosom ist die Grundwiederholungseinheit des Chromatins und besteht aus einem proteinhaltigen oktameren Kern zwei Moleküle jeder kanonischen Histon H2A, H2B, H3 und H4, um die 147 bp DNA gewickelt 1,2 enthält. Alle Core-Histone sind als globuläre Domäne und eine flexible N-terminalen "Schwanz", die außerhalb der Nukleosomen ragt strukturiert. Einer der Hauptmechanismen zur Regulierung Chromatin-Struktur und Dynamik auf kovalente post-translationale Modifikationen (PTM), die hauptsächlich auf den N-Termini von Histonen 3,4 auftreten basiert. Histon-Modifikationen kann entweder durch Änderung der Chromatinstruktur höherer Ordnung, indem die Kontakte zwischen Histon-DNA oder zwischen Nukleosomen, und steuert somit die Zugänglichkeit der DNA-bindenden Proteinen (cis-Mechanismen) funktionieren, oder als DockIn wirkendeng Stellen für regulatorische Proteine, entweder als Einzelgeräte oder in multimere Komplexe eingebettet. Wie regulierende Proteine ​​ihre Funktion in verschiedener Weise ausüben: durch Modulation direkt Genexpression (dh Proteine ​​TAF) oder durch Änderung der Nukleosomen Positionierung (dh Chromatin-Remodeling-Komplexe) oder durch Änderung anderer Histon-Reste (dh Proteine, die mit Methyl-oder Acetyl-Transferase Transferase-Aktivität) (trans-Mechanismen) 5. Die Beobachtung, dass unterschiedliche Muster PTM-Cluster zu bestimmten Chromatin Loci führte zur Ausarbeitung der Hypothese, dass verschiedene Modifikationen an bestimmten Stellen können Synergie, um einen molekularen Code der Vermittlung der Funktionszustand des zugrunde liegenden DNA zu erzeugen. Die "Histon-Code-Hypothese" hat großen Konsens in den Jahren gewonnen, aber seine experimentelle Überprüfung ist wieder durch technische Beschränkungen 6,7 statt.

Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomik als ein hervorleistungsfähiges Werkzeug zur Histon-Modifikation Muster abzubilden und Chromatin-bindende Proteine ​​8 zu charakterisieren. MS detektiert eine Änderung als eine spezifische Δmass zwischen der experimentellen und theoretischen Masse eines Peptids. Auf der Ebene der einzelnen Histone, bietet MS eine unvoreingenommene und umfassende Methode zur Karte PTMs, so dass die Erkennung von neuen Modifikationen und aufschlussreiche Wechselspiel zwischen ihnen 9-14.

In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Strategien entwickelt, um die proteomische Zusammensetzung von Chromatin zu sezieren, einschließlich der Charakterisierung von intakten mitotischen Chromosomen 15, die Identifizierung von löslichen HPTM-bindenden Proteinen 16-18 und die Isolierung und Analyse von spezifischen Chromatin-Bereiche (dh Telomere) 19,20. Allerdings ist die Ermittlung der Ortsspezifische Synergien zwischen Histon PTMs, Varianten und Chromatin-assoziierte Proteine ​​noch unvollständig. Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, mit dem Namen ChroP (Chro matin roteomics P) 21, die wir entwickelt haben, um effizient zu charakterisieren funktionell unterschiedlichen Chromatin-Domänen. Dieser Ansatz passt Chromatinimmunpräzipitation (Chip), eine gut etablierte Protokoll in der epigenetischen Forschung, für die effiziente MS-basierten Proteomanalyse der angereicherten Probe. Wir haben zwei verschiedene Protokolle entwickelt, abhängig von der Art des Chromatins als Eingabe und die Frage gerichtet MS verwendet wird; insbesondere: 1) ChIP von nicht fixierten nativen Chromatin mit MNase verdaut wird eingesetzt, um Mono-Nukleosomen zu reinigen und die Co-Zuordnung hPTMs (N-ChroP) sezieren; 2)-Chips aus vernetzten Chromatin durch Ultraschall fragmentiert wird in Kombination mit einem SILAC Basis Interactomics Strategie, um alle Co-Anreicherung Chromatin-Bindungsproteine ​​(X-ChroP) charakterisieren. Wir veranschaulichen hier die Kombination von N-und X-ChroP zur Anreicherung und Studieren Heterochromatin mit H3K9me3 als Köder für die Immunpräzipitation Schritte. Die Verwendung von ChroP verlängert werdenentweder verschiedene Regionen auf Chromatin, oder Änderungen in der Zusammensetzung des Chromatins innerhalb der gleichen Region während der Übergang zu einem anderen Funktionszustand zu untersuchen, um so den Weg für verschiedene Anwendungen in der Epigenetik.

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Protokoll

1. Zellkultur

  1. Standardmedium für native ChIP
    1. HeLa-Zellen wachsen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Glutamin, 1% Pen / Strep und 10 mM HEPES, pH 7,5, ergänzt.
  2. SILAC Kennzeichnung für die Vernetzung ChIP
    1. HeLa-Zellen wachsen in SILAC DMEM-Medium, Lysin und Arginin verarmt, mit 10% dialysiertem FBS, 1% Glutamin, 1% Pen / Strep, 10 mM HEPES, pH 7,5, und entweder dem Licht L-Lysin (Lys 0) und L-ergänztem Arginin (Arg 0) oder ihre schweren Gegen, L-Lysin (Lys 8) und L-Arginin (Arg 10) (Materials Table), um die Endkonzentrationen von 73 mg / l und 42 mg / L auf.
    2. Wachsen Zellen, die für bis zu acht Generationen in SILAC Medium, um die vollständige isotopencodierten Aminosäuren Einarbeitung zu gewährleisten. Pass-Zellen alle zwei Tage, wenn sie eine Dichte von 1,0 bis 1,5 x 10 6 Zellen / ml erreichen, Säen sie zu aconcentration von 3 x 10 5 Zellen / ml.
    3. Bewerten Zellen Wachstum und Rentabilität in SILAC Medium, um jede mögliche Änderung von der Physiologie, die aus der ärmeren Zusammensetzung des SILAC Medium führen kann individualisieren; um dies zu tun:
      1. Sichtprüfung Zellen jeden Tag am Mikroskop Morphologie während der Etikettierung.
      2. Zählen von Zellen und Handlung Wachstumskurven von Zellen, die in SILAC gegenüber Standardmedium.

2. Ureinwohner Chromatin Immunopräzipitation (N-Chip)

  1. Kerne Herstellung von kultivierten Zellen
    1. Verwenden Sie 1-2 x 10 8 unmarkierten HeLaS3 Zellen pro Experiment. Ernten Sie die Zellen, stellen Aliquot von 50 x 10 6 Zellen in 50 ml Zentrifugenröhrchen und bei 340 g für 10 min bei 4 ° C, waschen Sie sie mit eiskaltem PBS.
    2. Resuspendieren jeder Zellpellet in 8 ml Lysepuffer (Tabelle 1) und Inkubation für 10 min bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad. Gießen Sie ca.refully jedem Zelllysat auf einem Saccharose-Kissen (Tabelle 1) und die Zentrifuge in einem Ausschwingrotor bei 3.270 × g für 20 min bei 4 ° C, um Kerne von Zytoplasma zu trennen.
    3. Überstände verwerfen, halten Kernpellets und zweimal waschen Sie sie in eiskaltem PBS durch Zentrifugation, Überstand verwerfen bei jedem Waschgang.
  2. Mikrokokken-Nuclease (MNase) Verdauung (Klein) und Qualitätskontrolle von Chromatin nach der Verdauung
    1. Resuspendieren gewaschen Kernpellet in 1 ml Aufschlusspuffer (Tabelle 1); teilen in zwei Aliquots von 500 ul und auf Eis zu halten.
    2. Die optische Dichte (OD) bei 260 nm eines Aliquots, 1:200 verdünnt in 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS). Hinweis: OD = 1 entspricht etwa 50 &mgr; g / ml von Chromatin-DNA. Typischerweise ausgehend von 2 x 10 8 Zellen, ist die OD im Bereich von 40-60.
    3. Nehmen 1% Kerne, fügen MNase Enzym bis zu einer Endkonzentration von 0.005 U Enzym / &mgr; l der Zellkerne und bei 37 ° C für verschiedene Zeitspannen (0, 10, 20, 40, 60 min).
    4. Zu jedem Zeitpunkt, sammeln 4 ul der verdauten Kerne und fügen Sie 1 mM EDTA, um die MNase Reaktion zu stoppen. Halten Sie auf dem Eis.
    5. Extrahieren von DNA-Proben durch PCR Purification Kit und eluieren sie in 50 &mgr; l TE-Puffer (Tabelle 1).
    6. Nehmen Sie 20 ul jeder DNA-Probe, mit 10 ul Ladepuffer (Tabelle 1) und laden Sie die Proben auf 1% (w / v) Agarose-Gel mit Ethidiumbromid mit PCR-Marker als Größenkontrolle.
    7. Überprüfen Sie die Verdauung der Bewertung der Chromatin Nukleosomen Leiter von MNase Inkubation produziert.
    8. Wählen des optimalen Zeitpunkts für die Verdauung, bezogen auf die Prävalenz von Nukleosomen in Mono-Zubereitung. . Typisch für 0.005 U Enzym / ul der Kerne der optimale Zeitpunkt der MNase Verdauung ist 60 min (Abbildung 1B, links) Hinweis: Die optimale Konzentration MNase / Uhrzeit der Verdaulichkeitauf je nach dem gewünschten Zelltyp und von der Größe der Nukleosomen Strecke eingestellt werden.
  3. Large-scale/preparative MNase Verdauung und Verwertung von Chromatin löslichen Fraktionen
    1. Hinzufügen zu jedem Aliquot (siehe 2.2.1) 5 ul MNase, entsprechend einer Endkonzentration von 0,005 U Enzym / &mgr; l der Zellkerne; Vorsichtig mischen und bei 37 ° C für 60 Minuten (oder im allgemeinen für die optimierte Zeitintervall, bezogen auf das im kleinen Maßstab).
    2. 1 mM EDTA, um die Reaktion zu stoppen und auf Eis zu halten. Pellet die verdauten Kerne durch Zentrifugation bei 7.800 × g bei 4 ° C für 10 min. Die Überstände (Fraktion S1) in ein neues Röhrchen und Lagern bei 4 º C. Bemerkung: S1 enthält das erste lösliche Fraktion von Chromatin, das Mono Nukleosomen. Fügen Sie die Proteaseinhibitoren (Tabelle 1).
    3. Vorsichtig resuspendieren Pellets in 1 ml Dialyse-Puffer (Tabelle 1) und Dialyse über Nacht bei 4 ° C (cut off der Dialyseschlauch ist 3,5 kDa), in 3 l Dialysepuffer, mit konstantem leichtem Rühren. Dialysierte Material sammeln und Zentrifuge bei 7.800 × g für 10 min bei 4 ° C Den Überstand (S2 Fraktion) in einem neuen Eppendorf-Röhrchen und Lagern bei 4 º C. Bemerkung: S2 umfasst Di-bis epta-Nukleosomen, je nach Ausmaß der Verdauung MNase.
  4. Qualitätskontrolle von Chromatin vor Immunpräzipitation
    1. Einen aliquoten entsprechend 5 ug S1 und S2 Chromatin Fraktionen (durch Messung der OD bei 260 nm in einem ND-System quantifiziert). Extrahieren DNA durch PCR Purification Kit und Eluieren in 50 ul TE-Puffer (Tabelle 1).
    2. Nehmen Sie 20 ul S1 und S2 DNA, mit 10 ul Ladepuffer (Tabelle 1) mischen und laden Sie sie auf 1% (w / v) Agarose-Gel. Prüfen Sie die Qualität und Effizienz der MNase Verdauung durch visuelle Inspektion der Nukleosomen Leiter. Hinweis: Fraktion S1 ist hochin Mono-Nukleosomen angereichert, während S2 Fraktion enthält hauptsächlich poly-Nukleosomen (1B, rechts).
  5. Inkubation von Chromatin mit Antikörper
    1. Lagerung bei -20 ° C 50 ul S1-Fraktion für die anschließende Massenspektrometrie-Analyse.
    2. 1 Volumen ChIP Verdünnungspuffer (Tabelle 1), um Bruch S1.
    3. Hinzufügen des Antikörpers gegen das HPTM (oder Protein) von Interesse; Inkubation über Nacht auf einem rotierenden Rad bei 4 º C. Bemerkung: Normalerweise verwenden 10 ug bis 20 ug des Antikörpers für 2 x 10 8 Zellen. Das optimale Verhältnis zwischen der Menge an Antikörper und Ausgangszellen Nummer muss sorgfältig von Fall zu Fall festgelegt werden, abhängig von der Fülle der HPTM / Protein als Köder in der Probe verwendet, und auf dem Antikörper Effizienz. Optimierung ist experimentell, basierend auf den folgenden Kriterien:
      1. Vergleichen Sie die Menge der Hauptmann / Protein von Interesse zwischen Ein-und Durchfluss (FT,siehe 2.7.2) durch Western Blot oder MS, ob die Immunpräzipitation bereichert einen erheblichen Anteil der spezifischen Chromatin Region. Hinweis: Dies wird im allgemeinen erreicht, wenn mindestens 50% der HPTM / Protein-Köder im FT (Fig. 1C) abgereichert .
      2. Überprüfen Sie, dass die immun Protein von Interesse auf SDS-PAGE-Gel, das gewährleistet, dass eine ausreichende Menge an Material ist für die MS-Analyse zur Verfügung nachweisbar. Hinweis: Die Anwesenheit auf dem Gel der Bands, die den vier Core-Histone an der richtigen Stöchiometrie zeigt an, dass das intakte Nukleosomen wurde von N-ChroP (1D) immunpräzipitiert worden. Mangel an der richtigen Stöchiometrie ist in der Tat, der eine partielle Unterbrechung / Entfaltung der Nukleosomen.
    4. Parallel dazu bereiten die G-Protein-gekoppelten magnetischen Beads (siehe 2.6).
  6. Die Gleichgewichtseinstellung und Blockierung von Protein G-gekoppelten magnetischen Beads
    1. Ins Gleichgewicht 100 ul von Protein G-gekoppelten magnetischen Beads Gülle in Blocking Solution (Tabelle 1), dreimaliges Waschen und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad. Hinweis: Nach der Bindungskapazität von Perlen, verwenden 100 ul von Gülle für 2-20 ug Antikörper.
    2. Mit Blocking Solution und dann zweimal mit ChIP Verdünnungspuffer (Tabelle 1) Waschen Sie die Perlen einmal blockiert.
  7. Isolierung von Chromatin mit magnetischen Beads
    1. 100 l blockiert Perlen S1 Chromatin Probe und Inkubation sie auf einem rotierenden Rad bei 4 ° C für 3 Stunden. Zentrifugieren bei 340 g für 1 min aus dem Deckel der Tipps Spin-Down der Probe. Legen Sie in einem magnetischen Rack, um die Perlen zu pelletieren.
    2. Den Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen. Dies ist die Strömung durch (FT), nämlich der Anteil des Chromatins, die nicht an den Antikörper gebunden haben.
    3. Waschen der Kügelchen viermal in Waschpuffer (Tabelle 1) Erhöhung der Salzkonzentration bei jedem Waschgang (75, 125 und 175 mM NaCl).
    4. Um die immun Chromatin eluieren, brüten die Perlen in 30 ul LDS-Probenpuffer mit 50 mM Dithiothreitol (DTT) für 5 min ergänzt bei 70 ° C Trennen Sie die eluierten Proteine ​​auf einem 4-12% Bis-Tris-Acrylamid-SDS-PAGE-Fertig Gradient Gel und färben das Gel mit kolloidalem Coomassie-Färbung Kit (Abbildung 1D).

3. Vernetzung Chromatin Immunopräzipitation (X-ChIP)

  1. Vernetzung der Zellen mit Formaldehyd
    1. In 0,75% Formaldehyd zu SILAC-markierten Zellen, kurz mischen und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Abschrecken der Formaldehyd durch Zugabe von 125 mM Glycin und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
    2. Teilen Sie Zellen in 5 x 10 7 Aliquots; spülen Sie sie dreimal mit eiskaltem PBS durch Zentrifugation bei 430g für 5 min bei 4 º C und Verwerfen des Überstandes nach jedem Waschen. Bei der letzten Wäsche, Überstand verwerfen und das Pellet zu halten. Hinweis: Wenn Zellen vernetzt sind, können sie bei -80 ° C gelagert werden, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
  2. Kerne Vorbereitung
    1. Resuspendieren jeder Zellpellet in 10 ml Lysis-Puffer (Tabelle 1). Inkubation für 10 min bei 4 ° C unter Rotation. Zentrifuge bei 430 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Überstände verwerfen; Kernpellets halten.
    2. Resuspendieren jedes Kernpellet in 10 ml Waschpuffer (Tabelle 1). Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min auf einem rotierenden Rad.
    3. Zentrifuge bei 430 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Überstände verwerfen und sammeln die Pellets.
    4. Resuspendieren jeweils Kernpellets in 3 ml ChIP Inkubationspuffer (Tabelle 1). Halten Sie auf dem Eis.
  3. Chromatin Beschallung und Qualitätskontrolle
    1. Ultraschallbad ch. romatin bei 200 W (Zyklen von 30 Sekunden "an" und 1 min "aus"), in einem gekühlten Bioruptor, Chromatin-Fragment Anmerkung: Die Anzahl der Zyklen und Beschallung Intervallen abhängig vom Zelltyp und von der durchschnittlichen Länge der nukleosomalen strecken gewünscht. Typischerweise 30 min Ultraschallbehandlung notwendig sind, um DNA-Fragmente von 300-500 bp zu erzeugen, in Längen, entsprechend di-und tri-Nukleosomen. Die Wahl der Größe der Fragmente hängt von der Art der Chromatin-Domäne untersucht.
    2. Nehmen Sie 2% der Gesamteingangs, kehren Sie die Vernetzung durch Inkubation bei 65 ° C für mindestens 1 Stunde in ChIP Inkubationspuffer. Extrahieren Sie die DNA durch PCR Purification Kit, Elution in 50 ul TE-Puffer und laden Sie die DNA auf Agarose-Gel auf Chromatin Fragmentierung zu überprüfen.
  4. Inkubation von Chromatin mit Antikörper
    1. 1/10 Volumen 10% Triton X-100 zu beschallenden Chromatin. Zentrifuge bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C pelletiert deBris.
    2. Sparen Sie 50 ul von Chromatin Eingabe von schweren Zellen, die für die Prüfung der Aufnahme Niveau SILAC Aminosäuren in markierten Zellen und für Protein-Profiling.
    3. In den Antikörper der Wahl, um die verbleibende schwere und leichte beschriftet beschallt Chromatin und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf dem sich drehenden Rad. Im Lichtkanal, fügen Sie auch einen Überschuss fache des löslichen Peptid. Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad. Hinweise: Der optimale Zustand zwischen der ug Antikörper und dem Ausgangsmaterial der Zellen wird von Fall zu Fall entschieden, wie in 2.5.3 diskutiert. Der optimale Überschuß fach Molarität der löslichen Peptid in bezug auf die Antikörper muß sorgfältig von Fall titriert Fall.
  5. Isolierung von Chromatin mit magnetischen Beads
    1. Ins Gleichgewicht und Block G-Protein-gekoppelten magnetischen Beads, indem Sie die in 2.6 beschriebenen Schritten und mit ChIP Inkubationspuffer.
    2. 100 l blockiert bEADS Chromatin Proben und Inkubation auf einem rotierenden Rad für 3 h bei 4 ° C. Zentrifugieren bei 340 g für 1 min aus dem Deckel der Tipps Spin-Down der Probe. Legen Sie in einem magnetischen Rack, um die Perlen zu pelletieren. Der Überstand ist der Fluss durch (FT), enthaltend ungebundenes Nukleosomen. Wasch Perlen viermal in Waschpuffer (Tabelle 1) mit zunehmender Salzkonzentration (zwei Waschungen mit 150 mm und zwei mit 300 mM NaCl).
    3. Perlen inkubieren in 30 ul SDS-PAGE-Loading-Probenpuffer (Tabelle 1) und für 25 min bei 95 ° C sowohl eluieren und de-Vernetzungs immunpräzipitierten Proteine. Separate Proteine ​​auf 4-12% Bis-Tris-Acrylamid-SDS-PAGE vorgefertigten Gelen (Abbildung 3D).

4. Probenvorbereitung Vor der MS

  1. In-Gel Verdauung von Histonen aus N-ChIP angereichert
    Hinweis: Während der Proteinverdauung und Peptid-Extraktionsschritte kümmernKeratin Verunreinigungen, die mit LC-MS/MS stören, wie zuvor beschrieben, 22, 23 zu minimieren.
    1. Schnitt Gelstücke entsprechend der Core-Histone Bänder (Fig. 1D). De-färben die Gel-Stücke mit 50% Acetonitril (ACN) in ddH2O, abwechselnd mit 100% ACN, das Gel schrumpft. Wiederholen, bis Gele Stücke sind komplett entfärbt und trocknen Sie sie in einer Vakuumzentrifuge.
    2. Hinzufügen D 6-Essigsäureanhydrid 1.09 (v / v) in 1 M Ammoniumbicarbonat (NH 4 HCO 3) (in der Regel das Endvolumen 60-100 &mgr; l) und 3 &mgr; l Natriumacetat (CH 3 COONa), als Katalysator. Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C mit starken Erschütterungen. Hinweis: Die Probe kann Blasen in den ersten Minuten nach der Montage der Reaktion zu erzeugen: es wichtig, mit Vorsicht handhaben und lösen das erzeugte Gas, Öffnung von Zeit zu Zeit die Röhren während der Inkubation.
    3. Spülen Sie die Gel-Stücke mehrmals with NH 4 HCO 3, wechseln sich mit ACN bei steigenden Prozentsatz (50% bis 100%), um vollständig zu beseitigen Rückstände von D 6-Essigsäureanhydrid.
    4. Schrumpf die Gelstücke in 100% ACN; trocknet sie in einer Vakuumzentrifuge, um vollständige Dehydratisierung zu gewährleisten. Re-Gel-Stücke mit eiskaltem 100 ng / ul Trypsin-Lösung in 50 mM NH 4 HCO 3 und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. Hinweis: Die Kombination der chemischen Modifikation von Lysinen mit deuterierten Essigsäureanhydrid und Trypsin Verdauung erzeugt ein "Arg- C wie "In-Gel Verdauungsmuster von Histonen 21,24.
    5. Entsorgen Sie die überschüssige Lösung und fügen Sie ein Volumen von 50 mM NH 4 HCO 3, um die Gelstücke vollständig abdecken; Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
    6. Sammeln löslich verdauten Peptide in einem neuen Eppendorf-Röhrchen. Lyophilisieren Peptiden. Resuspendieren sie in 0,5% Essigsäure acid/0.1% Trifluoressigsäure (TFA). Desalt und konzentrierenPeptide auf einem Reversed Phase C 18 / Carbon "Sandwich" und Ionenaustausch-Chromatographie (SCX) auf handgeschöpftem Mikrosäulen (StageTip) 25.
    7. Bereiten Sie die StageTip Mikrosäulen indem Geflecht Festplatten mit Teflon immobilisiert C 18 / Kohlenstoff ("Sandwich") und SCX-Perlen in einem 200-ul-Tipps. Beziehen Sie die "Sandwich" durch das Laden der C 18 Mikrosäule auf einem zweiten Spitze mit Kohlefilter geladen. Hinweis: Die sehr kurze Peptide, die nicht auf der C-18-Filter zurückgehalten werden, übergeben in der Durchfluss, die direkt auf geladen Carbon Spitze, die in der Regel hält sie. SCX StageTips können spezifische Peptide, wie H3 (3-8)-Peptid, nicht effizient durch Umkehrphasenchromatographie gehalten bereichern.
    8. Last 50% der Peptide auf den C 18 / Carbon "Sandwich StageTip" und 50% auf SCX StageTips. Eluiere sie von den C 18 / Carbon-Tipps mit 80% ACN/0.5% iger acid und der SCX Tipps mit 5% Ammoniumhydroxid (NH 4 OH) / 30% Methanol. Nach der Lyophilisation resuspendieren Peptide in 0,1% FA und mittels LC-MS/MS analysiert.
  2. In-Gel-Verdau von Proteinen immun
    In-Gel-Verdauung der Proteine ​​erfolgt, wie zuvor beschrieben 22 durchgeführt, mit geringfügigen Modifikationen.
    1. Schneiden Sie jede Spur in zehn Scheiben (3D) und jede Scheibe in kleine Würfel von 1 mm 3. De-färben die Gelstücke mit 50 mM NH 4 HCO 3/50% Ethanol und fügen absolutem Ethanol um die Gele schrumpfen. Wiederholen, bis die Gele komplett de-gefärbt.
    2. Hinzufügen Reduktionspuffer (Tabelle 1) mit den Gelstückchen für 1 h bei 56 ° C, gefolgt von der Zugabe von Alkylierungs-Puffer (Tabelle 1) für 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. In Vakuumzentrifuge Waschen und trocknen Sie die Gel-Stücke.
    3. Rehydrate die Gelstücke mit eiskaltem 12,5 ng / ul Trypsin-Solution in 50 mM NH 4 HCO 3 und Inkubation auf Eis bis zur vollständigen Rehydrierung der Gel-Stücke. Entfernen Trypsin im Übermaß.
    4. In 50 mM NH 4 HCO 3, um die Gel-Stücke vollständig zu bedecken. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
    5. Sammeln Sie die flüssige Teil. Hinzufügen des Extraktionspuffer (Tabelle 1), um das Gel Stücke; Inkubieren unter starkem Rühren für 10 min bei Raumtemperatur. Zweimal wiederholen.
    6. Die Gelstücke in ACN Inkubation für 10 min unter starkem Rühren. Zweimal wiederholen und alle Überstände zu bündeln.
    7. Lyophilisieren die Peptide. Resuspendieren getrocknet Peptide in 0,5% Essigsäure acid/0.1% TFA.
    8. Entsalzen und konzentrieren Peptide auf einem Reversed Phase C 18 StageTip, wie beschrieben, 26, 27.
    9. Eluiere Peptide aus dem C 18 StageTip mit 80% ACN/0.5% Essigsäure. Entfernen des organischen Lösungsmittels durch Verdampfung in einer Vakuumzentrifuge und Resuspendieren der Peptide in 0,1% FA (typischerweise 5-10 &# 181; l), wenn Sie bereit sind, um die MS-Analyse.

5. LC-MS-Analyse

  1. Flüssigkeitschromatographie-Analyse
    1. Pack die Analysesäule in einem 15 cm Quarzglasstrahler (Innendurchmesser 75 &mgr; m, 350 &mgr; m Außendurchmesser) unter Verwendung von Umkehrphasen-(RP) C-18, 3 &mgr; m Harz in Methanol, bei einer konstanten Heliumdruck (50 bar) unter Verwendung eines Bombe-loader-Gerät, wie zuvor 28 beschrieben.
    2. Koppeln der Emitter verpackt (C18 RP-Säule) direkt mit dem Auslass des 6-Wege-Ventil der HPLC durch eine 20 cm lange (25 &mgr; m Innendurchmesser) Quarzglas ohne Vorsäule oder Spaltvorrichtung.
    3. Laden der verdauten Peptide C18 RP-Säule bei einem Durchsatz von 500 Nl / min mobile Phase A (0,1% FA / 5% ACN in ddH 2 O).
    4. Nach dem Laden der Probe, trennen Sie die Peptide mit den folgenden Gradienten:
      1. Wenden 0-40% mobile Phase B (0,1% FA/99% ACNin ddH 2 O) in 250 nl / min über 90 min, gefolgt von einem Gradienten von 40-60% in 10 min 60-80% in 5 min, für die Elution von Peptiden, die aus Histonen (siehe 2).
      2. Wenden 0-36% mobile Phase B bei 250 nl / min über 120 min, gefolgt von einem Gefälle von 36-60% in 10 min und 60-80% innerhalb von 5 min für die Elution von Peptiden, die aus immun Proteine ​​(siehe 3).
  2. Massenspektrometrie-Analyse mit LTQ-FT-ICR-Massenspektrometer-Ultra-
    1. Betreiben Sie in einem datenabhängigen Erwerb (DDA)-Modus automatisch zwischen MS und MSMS Erwerb wechseln. MS Scan-Spektren von 200-1,650 erworben, typischerweise in der m / z-Bereich wird mit einer Auflösung von R = 100.000 bei 400 m / z erworben. Die fünf (Top5) intensivsten Ionen werden zur Fragmentierung in der linearen Ionenfalle isoliert unter Verwendung einer stoßinduzierten Dissoziation (CID) auf einem Sollwert von 5000.
    2. Verwenden Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Parameter for das "Tuning" Erwerb Datei.
    3. Stellen Sie die Standard-Einstellungen Nahme, wie in Tabelle 2 aufgeführt.

6. Datenanalyse

  1. Beschriften Sie kostenlos Quantifizierung von Histon-Modifikationen in Chromatindomänen Zusammenarbeit bereichert
    1. Konvertieren Sie die erworbenen Raw-Dateien, um Dateien mit mgf Raw2msm-Software (Version 1.10) 29.
    2. Suche die Histon-Modifikationen mit Maskottchen-Deamon (Version 2.2.2), die Einstellung der in Tabelle 3 beschriebenen Parameter.
    3. Auf der Maskottchen-Ausgang Peptid Liste entfernen Peptide mit Score von weniger als 15 oder mehr als 5 mutmaßlichen PTMs 29. Hinweis: Für jedes einzelne Peptid-ID, wählen Sie das Peptid mit der höchsten Punktzahl Maskottchen und filtern alle anderen redundanten Peptide mit gleicher ID .
    4. Konstruieren Sie die extrahierten Ionenchromatogramme (XIC) für jeden Vorläufer entsprechend alle modifizierten Peptide, based auf der m / z-Wert, mit dem QualBrowser. Berechnen der Fläche unter der Kurve (AUC) für jeden Peak (siehe Abbildung 2A).
    5. Validierung jeder identifizierten Peptide, die Modifikationen durch visuelle Inspektion der MS / MS-Spektren unter Verwendung des QualBrowser (2B).
    6. Berechnen Sie die relative Häufigkeit für jeden modifizierte Peptid. Der relative Anreicherung von jeder Änderung in dem Chip-ten Material. Hinweis: relative Häufigkeit als ein Verhältnis zwischen der AUC jeder spezifischen modifizierten Peptids über die Summe der AUC aller modifizierten und unmodifizierten Formen des gleichen Peptids, berechnet, während die relativen Anreicherung als Verhältnis der relativen Häufigkeit der spezifischen Änderung in dem Chip über den Eingang (Fig. 2C).
  2. Quantitative Proteomik-Analyse von Proteinen innerhalb von Chromatin-Domänen zusammen verbunden
    1. Für Proteine, Identifizierung und Quantifizierung verwenden MaxQuant Paket(Http://www. Maxquant.org /) 30. Konfigurieren Sie die integrierte Suchmaschine "Andromeda" mit dem AndromedaConfig.exe 31 und stellen Sie die in Tabelle 3 aufgeführt Suchmaske.
  3. Incorporation Test
    1. Schätzen Sie den Grad der Aufnahme von Schwer Aminosäuren in Proteine ​​in schwer markierten Chromatin-Eingang, mit MaxQuant Software wie folgt:
      1. Stellen Sie die wie in 6.2 beschrieben, aber das Deaktivieren der Option Wieder quantifizieren Parameter.
      2. Berechnen Sie die prozentuale Aufnahme folgender Formel zu nicht-redundanten Peptid-Verhältnisse:. Incorporation (%) = Verhältnis (H / L) / Verhältnis (H / L) + 1 x 100 (3B) Hinweis: Nehmen Sie nur dann, wenn Einarbeitung> 95 %.

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Ergebnisse

Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsfähige Technik verwendet, um die Lokalisation eines Proteins oder eines Histonmodifikation entlang des Genoms Profil. In einem Äquivalent Proteomik ist der Chip von MS-basierte Proteomik gefolgt, um qualitativ und quantitativ die hPTMs, Histonvarianten und Chromatin-bindende Proteine, die mit der Modifikation oder Protein von Interesse immunpräzipitiert werden, als "Köder" verwendet, zu identifizieren. In der N-ChroP Ansatz in 1A Amerikaner Chip, i...

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Diskussion

Wir haben kürzlich ChroP, eine quantitative Strategie für die großtechnische Charakterisierung der Proteinkomponenten von Chromatin. ChroP vereint zwei komplementäre Ansätze in der epigenetischen Bereich verwendet, Chip-und MS, profitieren von ihren Stärken und Überwindung ihrer jeweiligen Beschränkungen. ChIP tief Sequenzierung (ChIP-Seq) gekoppelt ermöglicht die genomweite Kartierung der Histon-Modifikationen bei der Auflösung von wenigen 35 Nukleosomen. Obwohl ihre Empfindlichkeit von Vorteil, sind Antikör...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde ursprünglich in Mol Cell Proteomics veröffentlicht. Soldi M. und T. Bonaldi Die Proteomik Untersuchung der Chromatin Funktions Domains enthüllt Novel Synergismen zwischen Distinct Heterochromatin-Komponenten MCP. 2013; 12: 64-80. © die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Wir danken Roberta Noberini (Italian Institute of Technology und IEO, Italien) für das kritische Lesen des Manuskripts. TB Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem Giovanni Armenise Harvard-Stiftung Career Development Program, der italienischen Vereinigung für Krebsforschung und dem italienischen Gesundheitsministerium unterstützt. MS Arbeit wurde durch ein Stipendium FIRC unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
dialysiertes FBSInvitrogen26400-044
Lysin 0 (12C6 14N2 L-Lysin)Sigma AldrichL8662
Arginin 0 (12C6 14N4 L-Arginin)Sigma AldrichA6969
Lysin 8 (13C6 15N2 L-Lysin)Sigma Aldrich68041
Arginin 10 (13C6 15N4 L-Arginin)Sigma Aldrich608033
Mikrokokken-NukleaseRoche10 107 921 001
Vollständige, EDTA-freie Proteasehemmer-CocktailtablettenRoche04 693 132 001
Spectra/Por 3 Dialyseschlauch, 3,5K MWCO, 18 mm flache Breite, 50 Fuß LängeSpectrumlabs132720
QIAquick PCR-AufreinigungskitQIAGEN28104
Anti-Histon-H3-Trimethyl K9-ChIP-QualitätAbcamab8898
Histon-H3-Peptid-Trimethyl K9 Abcamab1773
Dynabeads Protein GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                                                      Bis-Tris Gel InvitrogenNP0335BOX
Kolloidalblau-FärbekitInvitrogenLC6025
LDS-ProbenpufferInvitrogenNP0007
FormaldheydeSigma AldrichF8775
Acetianhydrid-d6Sigma Aldrich175641-1G
[header]
AmeisensäureSigma Aldrich94318-50ML-F
Iodacetamid > 99% (HPLC), kristallinSigma AldrichI6125
DL-DithiothreitolSigma Aldrich43815
Modifiziertes Trypsin in Sequenzierqualität, gefroren 100 μ g (5 & mal; 20 μ g)PromegaV5113
Nanospray OD 360μ m x ID 75μ m, Spitzen ID 8 μ m ungestrichen Pk 5Microcolumn SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & Mikro; M    15% CDr. Maisch GmbHr13.aq.
Kohle-Extraktionsscheibe, 47 mmAgilent Technologies12145040
Kationen-ExtraktionsscheibeAgilent Technologies66889-U

Referenzen

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