Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

Zusammenfassung

In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet.

Zusammenfassung

RNA-Viren sind für die wichtigsten Krankheiten wie Grippe, Bronchitis, Dengue-Fieber, Hepatitis C oder Masern verantwortlich. Sie stellen auch eine neue Bedrohung wegen der erhöhten weltweiten Austausch und die menschlichen Populationen durchdringen mehr und mehr natürliche Ökosysteme. Ein gutes Beispiel für eine solche Situation ist Schwellen Chikungunya-Virus-Epidemien von 2005-2006 in den Indischen Ozean. Jüngsten Fortschritte im Verständnis der zellulären Wege Steuern virale Replikation zeigen, dass Verbindungen, die auf Wirtszellfunktionen anstatt das Virus selbst, könnte eine große Gruppe von RNA-Viren hemmen. Einige antiviralen Breitband-Verbindungen mit Host-zielorientierte Tests identifiziert worden. Aber die Hemmung der Virusreplikation in Zellkulturen unter Verwendung von Reduktion der cytopathischen Effekte als Auslese immer noch eine überragende Screening-Strategie. Solche funktionellen Bildschirme wurden durch die Entwicklung von rekombinanten Viren Reporter exprimieren verbesserter Enzyme ca.Pable der Biolumineszenz wie Luciferase. In dem vorliegenden Bericht haben wir detailliert eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die rekombinanten Masern-und Chikungunya-Viren mit zellulären Lebensfähigkeitstests kombiniert, um Verbindungen mit einem antiviralen Breitband-Profil zu identifizieren.

Einleitung

RNA-Viren sind für eine Vielzahl von Infektionen beim Menschen verantwortlich und haben einen großen Einfluss auf die Bevölkerung weltweit, sowohl in Bezug auf die öffentliche Gesundheit und wirtschaftliche Kosten. Effizienten Impfstoffen gegen verschiedene menschliche RNA-Viren entwickelt worden und werden weithin als prophylaktische Behandlungen. Es besteht jedoch immer noch ein Mangel an kritischen therapeutische Arzneimittel gegen RNA-Virus-Infektionen. Tatsächlich sind effiziente Impfstoffe nicht verfügbar gegen wichtige menschliche Krankheitserreger wie Dengue-Virus, Hepatitis-C-Virus oder humanen Respiratory-Syncytial-Virus (HRSV). Außerdem sind RNA-Viren, die....

Protokoll

1. Herstellung von 96-Well-Platten mit Tochter Verbindungen

1. Bewegen Mutter 96 Vertiefungen-Platten, die 10 mM Stammlösungen von chemischen Verbindungen in DMSO von -20 ° C bis Raumtemperatur. 5x verdünnen Verbindungen in DMSO Zwischen 96-Well-Platten bei Verdünnung 2 mM zu erhalten. Verdünnung wird durch Pipettieren von 5 &mgr; l in 20 &mgr; l DMSO und Mischen gelöst.
2. Je 1 ul von Verdünnungsplatten in trockene Brunnen aus weißem, Barcode-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen. Diese erste Reihe von Tochterplatten (D1) wird verwendet, um die Toxizität der Verbindungen bei einer Endkonzentration von 20 uM zu bewerten. Speicher Tochterplatten bei -....

Ergebnisse

Dieses Screening-Pipeline setzt zunächst auf die Auswahl von Verbindungen, die MV-Replikation hemmen und keine signifikante zelluläre Toxizität (Abbildung 1, primären Bildschirm) nicht zeigen. Es nutzt Luciferase-basierte Assays zur Zelltoxizität und die Hemmung der viralen Replikation zu bestimmen. Alle Pipettierschritte und Datenerfassung in einem Hochdurchsatzeinstellung mit einer Roboter-Plattform ausgeführt werden.

Zytotoxizität von Verbindungen unter Verwendung eines L.......

Diskussion

Die hier beschriebene Screening-Pipeline zielt auf die Auswahl-Verbindungen mit einem geeigneten Profil als Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren. Wenn eine Bibliothek von 10.000 Verbindungen wurde mit diesem Protokoll und oben erwähnten Filterkriterien angewendet wurden untersucht, dh die Hemmung der MV-Replikation überlegen 75%, 40 Verbindungen (0,4%) als positiv. Dabei etwa die Hälfte von ihnen zeigten eine Toxizität in der Luciferase-Basis-Lebensfähigkeitstest, und wurden deshalb nicht berücksichtigt. Sch.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Freedom EVO-Plattform	TECAN		Roboterplattform
96-Well-Mikrotiterplatten aus Polystyrol-Zellkulturen, weiß	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Lumineszierender Zellviabilitätsassay	Promega	G7570	Luciferase-basierter Viabilitätsassay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagenz mit Glühwürmchen-Luziferase Substrat
Renilla-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagenz mit Renilla Luciferase Substrat
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagenz mit Glühwürmchen-Luziferase Substrat. Kann als Alternative zum Brigh-Glo-Reagenz verwendet werden, um die Luziferase-Aktivität zu bestimmen.