Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

15.2K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/51248

⸱

28. Februar 2014

 ,  ,  , 
1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine and Dentistry, Western University, 3Special Hematology/Flow Cytometry, London Health Sciences Centre, 4Lawson Health Research Institute, 5Department of Oncology, Western University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in mehreren metastatischen Krebsprognos. Dieses Manuskript beschreibt den Goldstandard Cellsearch System (CSS) CTC Aufzählung Plattform und Highlights gemeinsame Fehlklassifikation Fehler. Darüber hinaus werden zwei angepasste Protokolle für benutzerdefinierte Marker Charakterisierung von CTC und CTC Aufzählung in präklinischen Mausmodellen der Metastasierung mit dieser Technologie beschrieben.

Zusammenfassung

Die Mehrheit der durch Krebs verursachten Todesfälle treten im Anschluss an die Entwicklung von Metastasen. Diese hoch tödliche Krankheit Stufe mit dem Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) zugeordnet ist. Diese seltenen Zellen wurde gezeigt, dass der klinische Bedeutung bei metastasierendem Brust-, Prostata-, und Darmkrebs sein. Der aktuelle Gold-Standard in der klinischen CTC Nachweis und die Zählung ist die FDA-Zulassung Cellsearch System (CSS). Dieses Manuskript beschreibt die Standard-Protokoll, das von dieser Plattform genutzt sowie zwei zusätzliche angepasste Protokolle, die den detaillierten Prozess von benutzerdefinierten Marker-Optimierung für die Protein-Charakterisierung von Patienten CTC und einem vergleichbaren Protokoll für CTC Erfassung in sehr geringen Mengen an Blut zu beschreiben, mit Standard- CSS Reagenzien zur Untersuchung von in vivo präklinischen Mausmodellen der Metastasierung. Darüber hinaus Unterschiede in der Qualität zwischen CTC gesunden Spenderblut, versetzt mit Zellen aus Gewebekultur gegenüber Patienten Blut samples werden hervorgehoben. Schließlich werden mehrere häufig abweichende Positionen, die CTC Fehlklassifikation Fehlern führen kann skizziert. Zusammengenommen werden diese Protokolle eine nützliche Ressource für die Nutzer dieser Plattform interessiert in der präklinischen und klinischen Forschung im Zusammenhang mit der Metastasierung und CTC werden.

Einleitung

Im Jahr 2013 wird geschätzt, dass 580.350 Menschen an Krebs sterben und dass 1.660.290 neue Fälle dieser Krankheit wird allein in den USA 1 diagnostiziert werden. Die meisten dieser Todesfälle treten im Anschluß an die Entwicklung von Metastasen 2. Der derzeitige Mangel an wirksamen Therapien in der Behandlung von Metastasen und eine begrenzte Verständnis der metastatischen Kaskade macht dieses Stadium der Erkrankung sehr tödlich. Das Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in die Blutbahn wurde gezeigt, dass mit Metastasen 3 korrelieren. Diese Zellen sind extrem selten und ihr Nachweis bei metastasierendem Brust 4, 5 Prostata bezeichnend für das Gesamtüberleben und kolorektalem Krebs 6. Bei diesen Patienten ≥ 5 (Brust-und Prostatakrebs) oder ≥ 3 (kolorektalen) CTC in 7,5 ml Blut ist das Vorhandensein von bezeichnend für schlechtere Prognose im Vergleich zu den Patienten mit weniger oder ohne nachweisbare CTC in der same Blutvolumen. Außerdem wurde die Änderung der Anzahl CTC während oder nach der therapeutischen Intervention nachgewiesen, die als Prädiktor für die Behandlung angesprochen, oft früher als gegenwärtig verwendeten Techniken 7-10 sein.

Es wurde geschätzt, dass in metastatischen Krebspatienten, CTC treten mit einer Häufigkeit von etwa 1 pro CTC 10 5 -10 7 mononukleären Blutzellen und bei Patienten mit lokalisierter Erkrankung kann diese Frequenz auch niedriger sein (1 ~ 10 in 8). Die seltene Art dieser Zellen kann es schwierig machen, genau und zuverlässig zu erfassen und zu analysieren, CTC 11. Mehrere Verfahren (vorher 12-14 prüft) verwendet worden, um durch Ausnutzung Eigenschaften, die sie von den umgebenden Blutkomponenten unterscheiden bereichern und erkennen diese Zellen. Im allgemeinen ist CTC Aufzählung ein zweiteiliges Verfahren, das sowohl eine Anreicherungsschritt und einen Erfassungsschritt erfordert. Traditionell verlassen Anreicherungsschritte auf Unterschiede in phys.schen Eigenschaften von CTC (Zellgröße, Dichte, Verformbarkeit) oder Protein-Marker-Expression (dh Epithelial Cell Adhesion Molecule [EpCAM], Cytokeratin [CK]). Nach Anreicherung kann CTC Detektion in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, von denen die häufigsten sind Nukleinsäure-basierte Assays und / oder durchflusszytometrische Ansätze durchgeführt werden. Jede dieser Strategien sind einzigartig, mit unterschiedlichen Vor-und Nachteile, aber sie alle nicht standardisiert, eine Notwendigkeit für den Eintritt in die klinische Einstellung. Das Cellsearch System (CSS) wurde daher entwickelt, um eine standardisierte Methode zum Nachweis und zur Zählung von seltenen CTC in menschlichem Blut unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und Antikörper-basierte Techniken 4-6 bereitzustellen. Diese Plattform wird derzeit als der Goldstandard in der CTC-Enumeration und ist der einzige von der US Food and Drug Administration (FDA) für den Einsatz in der Klinik 15 bewährte Technik.

Die CSS ist ein Zwei-Komponenten-Plattform consisting, (1) die CellTracks AutoPrep System (nachstehend als Präparationsinstrument bezeichnet), welche die Herstellung von menschlichen Blutproben, und (2) die CellTracks Analyzer II (nachstehend als Analyseinstrument bezeichnet), die diese Scans automatisiert Proben nach der Vorbereitung. Um CTC verunreinigen Leukozyten die Vorbereitung Instrument unterscheiden beschäftigt ein Antikörper vermittelt wird, Ferrofluid-basierten Ansatz, magnetische Trennung und Differenzfluoreszenzfärbung. Zunächst markiert der CTC-System mit Anti-EpCAM-Antikörper gegen Eisen-Nanopartikel konjugiert. Die Probe wird dann in einem Magnetfeld inkubiert und alle unmarkierten Zellen abgesaugt. Ausgewählte Tumorzellen resuspendiert und inkubiert in einem Differenz Fluoreszenz-Färbung, bestehend aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern und eine Kernfärbung Reagenz. Schließlich wird die Probe einem magnetischen Kassette übertragen, genannt magnest (nachfolgend als Magneteinrichtung bezeichnet) und scanned mit dem Analyseinstrument.

Das Analysegerät wird verwendet, um mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Filter, die jeweils mit der geeigneten Fluoreszenzpartikel optimiert, mit einem 10x-Objektiv vorbereiteten Proben scannen. CTCs als Zellen, die durch Anti-EpCAM-, Anti-Pan-CK-Phycoerythrin (PE) gebunden sind (CK8, 18 und 19) und die Kernfärbung 4 ',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) identifiziert. Umgekehrt werden die kontaminierenden Leukozyten Zellen, die durch Anti-CD45-Allophycocyanin (APC) und DAPI gebunden werden identifiziert. Nach dem Abtasten werden Computer-definierten potentiellen Tumorzellen, die dem Benutzer präsentiert. Aus diesen Bildern, muss der Benutzer die qualitative Analyse zu verwenden mit den definierten Parametern und Differenzialfärbungs oben erörtert, um zu bestimmen, welche Ereignisse CTC.

Zusätzlich zur Bereitstellung einer standardisierten Methode zur CTC Aufzählung ermöglicht molekulare Charakterisierung von CTCs bezogen auf Protein-Marker von Interesse der CSS. Diese Abfrage cauf Einzelzellebene eine durchgeführt werden, wobei ein Fluorescein (FITC) Fluoreszenzkanal nicht für CTC Identifikations 16 erforderlich. Obwohl diese Plattform bietet die Fähigkeit zur molekularen Charakterisierung, der detaillierte Prozess der Entwicklung von Protokollen und Optimierung nicht gut definiert. Drei kommerziell erhältlichen Markern wurden vom Hersteller zur Verwendung mit der CSS, einschließlich epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-1 Rezeptor (IGF-1R) entwickelt. HER2-Analyse, in Kombination mit der CSS, wurde von mehreren Gruppen genutzt werden, um das Potenzial für CTC Charakterisierung veranschaulichen, um die klinische Entscheidungsfindung zu informieren und eventuell vorhandenen Behandlungsrichtlinien zu ändern. Zum Beispiel Fehm et al. Zeigten, dass 17 etwa ein Drittel der Brustkrebs-Patientinnen mit HER2-Primärtumoren hatten HER2 + CTC. Zusätzlich Liu et al.18 vor kurzem berichtet, dass bis zu 50% der Patienten mit HER + metastasierendem Brustkrebs nicht haben HER2 + CTC. Herceptin, ein HER2-Rezeptor stören monoklonalen Antikörper nachgewiesen, dass Patienten, deren Tumore HER2 ausreichend, ist ein häufig genutzt Behandlung für Patienten mit HER2 + Primärtumoren 19-21 stark profitieren. Allerdings deuten diese Studien, dass Herceptin kann als Sub-optimal genutzt und das CTC Charakterisierung kann bei der Vorhersage Ansprechen auf die Behandlung zu unterstützen. Letztlich kann CTC Charakterisierung haben das Potenzial, individuelle Betreuung zu verbessern.

CTC Forschung ist einzigartig, es ist weitgehend eine Nacht-zu-Tisch-Ansatz verwendet. Diese Methode, die im Gegensatz zu Tisch-zu-Bett Forschung, die oft Jahre kann die Patientenversorgung auswirken, hat CTC schnellen Einstieg in die klinischen Einstellung erlaubt. Allerdings sind Ärzte zögern, die Ergebnisse von CTC-Analyse in der Patientenbehandlung Entscheidungs ​​mak verwendenten durch einen Mangel an Verständnis der zugrunde liegenden Biologie. Daher geeigneten präklinischen Mausmodellen der Metastasierung und komplementäre Analysetechniken CTC müssen, um diese offenen Fragen untersuchen genutzt werden. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Tiermodellen verwendet werden, um die metastatischen Kaskade untersuchen: (1) spontane Metastasierung Modelle, die für die Untersuchung aller Schritte in der metastatischen Kaskade zu ermöglichen, und (2) experimentelle Metastasierung Modellen, die nur ermöglichen, das Studium der späteren Schritte in der metastatischen Prozess wie Extravasation und sekundären Tumorbildung 22. Spontane Metastasierung Modelle beinhalten Tumorzellinjektionen in geeignete orthotopen Stellen (zB Injektion von Prostata-Krebszellen in der Prostata für die Untersuchung von Prostatakrebs). Die Zellen werden dann Zeit, um Primärtumoren bilden und spontan auf sekundären Standorten wie der Knochen, Lunge und Lymphknoten metastasieren gegeben. InDagegen experimentellen Metastasierung Modelle direkte Injektion von Tumorzellen in die Blutbahn (z. B. über Schwanzvene oder intrakardiale Injektion, um Zellen gezielt an bestimmte Stellen) und damit die ersten Schritte Intravasation und Verbreitung zum sekundären Organe 22. So weit die Mehrheit der CTC-Analyse in in vivo Modellsystemen durchgeführt wurde entweder mit Durchflusszytometrie-basierte 23 oder angepasst menschlichen CTC-basierte Techniken (zB AdnaTest) 24. Obwohl nützlich, keine dieser Techniken angemessen widerspiegeln CTC Aufzählung mit dem Gold-Standard CSS. Bezogen auf die klinische Zulassung standardisierte Art und weit verbreiteten Nutzung des CSS wäre die Entwicklung eines CTC Fänger-und Nachweisverfahren für die in vivo-Modellierung, die äquivalent der Probenvorbereitung, die Verarbeitung verwendet, und Identifizierungskriterien vorteilhaft als Ergebnis wäre vergleichbar mit denen aus Patientenproben erhalten. Jedoch aufgrund der Volumen requirements des Präparationsinstruments ist es nicht möglich, kleine Mengen an Blut mit diesen automatisierten Plattform verarbeitet. . Außerdem früheren Arbeit von Eliane et al 25 hat gezeigt, dass eine Kontamination der Proben mit der Maus Epithelzellen (die auch die Standard-CTC Definition [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -] erfüllen) kann zu Fehlklassifikation von Maus Plattenepithel Epithelzellen führen CTC. Um diese Probleme anzugehen eine angepasste Technik, die die Nutzung der CSS-CTC-Kit-Reagenzien in Kombination mit einem manuellen Isolationsverfahren wurde entwickelt, ermöglicht. Die Zugabe eines FITC-markierten humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Antikörpers zu dem Assay ermöglicht menschlichen Tumorzellen aus Maus Plattenepithelzellen unterscheiden.

Dieses Manuskript beschreibt die Standard-, kommerziell entwickelte und optimierte CSS-Protokoll für die Verarbeitung von Patientenblutproben und Fallstricke, die auftreten können, einschließlich Abweit Elemente, die CTC Fehlklassifikation Fehlern führen kann. Zusätzlich Anpassung der CSS-Test, benutzerdefinierte Proteineigenschaften von CTC erfasst und vergleichbarer angepasst CSS-Technik, die für die Anreicherung und den Nachweis von CTC von kleinen Blutvolumina in präklinischen Mausmodellen von Metastasen ermöglicht untersuchen beschrieben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle in diesem Manuskript beschrieben Humanstudien wurden unter Protokolle durch Western University Human Research Ethics Board genehmigt durchgeführt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care unter Protokolle, die von der Western University Einsatz von Tieren Unterausschuss genehmigt, durchgeführt.

1. Standard-CTC Enumeration von Patientenblutproben Mit der CSS

1. Menschliches Blut Probenahme und Probenvorbereitung für die Verarbeitung auf der Vorbereitung Instrument

  1. Mit Standard-aseptischen Aderlass Techniken zeichnen ein Minimum von 8,0 ml von menschlichem Blut in ein 10 ml Cellsave Röhre, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und eine proprietäre Zellkonservierungsmittel enthält (im Folgenden als die CTC Konservierungsrohr bezeichnet). Das Röhrchen 5x bis Blutgerinnung verhindern. Proben können sofort weiterverarbeitet oder bei Raumtemperatur für bis zu 96 Stunden gelagert werden.
  2. RemovE CSS Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen, bevor Sie.
  3. Mit einer Pipette 10 ml Einweg-und automatisierte Pipette, sammeln 7,5 ml Blut aus der CTC Konservierungsrohr und langsam verzichten Blut in einem entsprechend gekennzeichneten Vorbereitung Instrumentenaufbereitung Röhre.
  4. Hinzufügen von 6,5 ml Verdünnungspuffer zu jeder Probe. Mischen durch Umdrehen Probe 5x. Centrifuge Probe bei 800 g für 10 min mit der Bremse in der "Aus"-Position. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm auf die Vorbereitung Instrument, um alle Patientenproben auf das System für die Verarbeitung zu laden. Die Proben müssen innerhalb 1 Stunde der Vorbereitung verarbeitet werden.

2. Kontrolle Vorbereitung für die Verarbeitung auf der Vorbereitung Instrument

  1. Vortexen Sie vorsichtig die Kontrollfläschchen und invertieren 5x zu mischen.
  2. Den Deckel vorsichtig aus dem Kontrollfläschchen und legen eine umgekehrte Zubereitung Instrumentenaufbereitung Rohr auf der Oberseite des nicht verschlossenen Röhrchen. In einer schnellen Bewegung, kehren dieKontrolle Fläschchen, und gießen Sie den Inhalt in die Verarbeitung Röhre. Während umgekehrt ist, vorsichtig blättern Sie die Seiten der Kontrollfläschchen, um alle verbleibenden Inhalt freigeben.
  3. Entfernen Sie vorsichtig das invertierte Steuer Fläschchen aus der Verarbeitung Röhre, so dass keine Flüssigkeit verloren geht und legen sie beiseite. Mit einer 1000 ul Pipette, sammeln alle restlichen Inhalt aus der Flasche und Deckel und sanft in die Verarbeitung Röhrchen zu pipettieren.
  4. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, auf dem Instrument, um die Vorbereitung auf das Steuersystem für die Verarbeitung zu laden.

3. Beispiel Scannen über die Analyse-Instrument

  1. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm auf die Vorbereitung Instrument, um alle Proben aus dem System zu entladen. Lose Kappe jedes magnetische Vorrichtung Patrone und tippen Sie auf die Magnetvorrichtung mit Händen oder Labortisch, alle Blasen, die an den Kanten der Patrone stecken freizugeben. Nachdem alle Blasen entfernt worden sind, fest verschließen die Patrone, lag die magnetische Vorrichtung flach, und ichncubate im Dunkeln für mindestens 20 min bei Raumtemperatur. Die Proben müssen innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung gescannt werden.
  2. Schalten Sie das Analyseinstrument und initialisieren Sie die Lampe. Sobald erwärmt (~ 15 min), laden Sie die System-Verifikation Patrone auf die Analyseinstrument und wählen Sie die Registerkarte Test QC. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die notwendigen Maßnahmen zur Qualitätskontrolle durchzuführen.
  3. Legen Sie eine Probe auf die Analyseinstrument und wählen Sie die Registerkarte Test Patient. Alle gespeicherten Informationen von der Präparationsinstrument angezeigt. Klicken Sie auf Start, um Abtastung zu initialisieren. Das System wird eine Groborientierung und Kantenerkennung auf der Magnetvorrichtung Patrone durchzuführen.
  4. Stellen Sie alle Kanten, wie erforderlich, mit den Richtungstasten. Wählen Sie OK. Das System wird eine Feinfokus durchführen und beginnen Abtastung.
  5. Nach dem Scannen der Kontrollergebnisse sollten anhand der festgelegten Kriterien für die Zellen bei hohen (CK + DA versetzt validiert werdenPI + CD45 - APC +) und niedriger (CK + DAPI + CD45 - FITC +)-Konzentrationen. Nach dem Scannen der Patientenprobe Ergebnisse sollten für aufgenommene CTC CTC über die definierten Kriterien (CK + DAPI + CD45 -) überprüft werden.

2. CTC Charakterisierung für benutzerdefinierte Markierungen mit der CSS-

1. Vorbereitung der benutzerdefinierten Marker und Instrument Initialisierung

  1. Verdünnte den Antikörper von Interesse unter Verwendung Bond Primärantikörperverdünnung auf die gewünschte Konzentration in einem Marker Reagenzienbecher unter Verwendung der folgenden Formel, wobei die Arbeitskonzentration ist die Konzentration des Antikörpers nach der Zugabe zu der Probe und der Stoffkonzentration ist die Konzentration des Antikörpers in der Reagenz Tasse. Für mehrere Proben, stellen die Antikörper-Mengen wie in Tabelle 1 beschrieben. Setzen Sie die Markierung Reagenzienbecher in Position 1 in der Reagenzienkartusche und load die Patrone auf CSS.
    Auf Konzentration = (Arbeits Konzentration x 850 ul) / 150 ul
  2. Blutentnahme, bereiten Proben, und laden Sie die Vorbereitung Instrument wie in der obigen Aufzählung von Standard-CTC Patient Blutproben mit der CSS-Protokoll beschrieben. Um benutzerdefinierte Marker zusätzlich zu aktivieren, wählen Sie Benutzerdefiniert Assay, wenn sie von der Vorbereitung Instrument aufgefordert werden. Geben Sie die Markierungsnamen und wählen Sie Speichern. Als Proben werden auf das Gerät geladen, wird der Bediener aufgefordert, anzugeben, welche kundenspezifische Marker mit Ja oder Nein wie nötig erhalten sollten.

2. Beispiel Scannen von benutzerdefinierten Markierungen auf der Analyse-Instrument

  1. Schalten Sie das Analyseinstrument, initialisieren Sie die Lampe, und führen Sie die Qualitätskontrolle und Systemverifikation, wie in Abschnitt 3.2 der Standard-CTC Enumeration von Patient Blutproben mit Hilfe der CSS beschrieben Protokoll.
  2. Legen Sie eine Probe auf die Analyseinstrument, und wählen Sie die Registerkarte Setup. Um die FITC Kanal initialisieren, wählen Cellsearch CTC als Kit-ID, unter der Rubrik Testprotokolle. Von diesem Menü CTC Forschung, klicken Sie auf die Schaltfläche Bearbeiten, und stellen Sie die Belichtungszeit nach Wunsch. Es wird empfohlen, eine Belichtungszeit von 1,0 Sekunden bei Verwendung der CSS-CTC-Kit, da dies zu Durchbluten in andere Kanäle für die Fluoreszenz CTC Identifizierung genutzt erhöhen nicht überschritten werden.

3. Anpassung der Standard-CSSProtocol für den Einsatz in präklinischen Mausmodellen

** Aus Veridex Maus / Ratte CellCapture Kit angepasst (nicht mehr im Handel erhältlich)

1. Maus Blutentnahme und Lagerung

  1. Vor der Blutentnahme, führen ~ 30 ul 0,5 M EDTA durch eine 22 G-Nadel hin und her, so dass eine kleine Menge von EDTA in der Nabe.
  2. Sammeln ein Minimum von 50 ul Blut von Mäusen, Maus über orthotopen, Schwanzvene oder intra Routen zuvor mit menschlichen Tumorzellen injiziert. Blutentnahme aus der Vena saphena magna (für serielle CTC-Analyse) oder durch Herzpunktion (für Terminal-CTC-Analyse). Entfernen Sie die Nadel und verzichten Blut in eine 1 ml EDTA Microtainer Blutentnahmeröhrchen. Mischen durch Umdrehen oder sanft Röhrchen klopfen, um Blutgerinnung verhindern. Blut kann sofort für bis zu 48 h nach der Zugabe von einem gleichen Volumen CytoChex Zellkonservierungsverarbeitet oder bei Raumtemperatur gelagert werden.

2. CTC-Anreicherung

  1. Entfernen CSS Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen, bevor Sie.
  2. Übertragen das Äquivalent von 50 &mgr; l Vollblut auf eine 12 mm x 75 mm Durchflusszytometrie Rohr. Gib 500 ul Verdünnungspuffer, zu jeder Probe, Abwaschen kein Blut, die auf den Seiten der Röhre verbleibt. Wenn nötig, eine kurze Zentrifugenspinnkann verwendet werden, um alle verbleibenden Blut zu sammeln.
  3. Vortexen Sie vorsichtig die anti-EpCAM Ferrofluid und fügen Sie 25 ul zu jeder Probe, indem Sie die Spitze der Pipette direkt in die Probe. In 25 ul Capture-Enhancement-Reagenz und Wirbel sanft zu mischen. Proben Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min.
  4. Zeigen Probenröhrchen in den Magneten und Inkubation für 10 min. Während die Probenröhrchen befinden sich noch in dem Magneten, mit einem Glaspipette sorgfältig absaugen Restflüssigkeit ohne Berührung der Wand der Röhre neben dem Magneten und entsorgen.

3. CTC-Färbung

  1. Die Probenröhrchen aus dem Magneten und Resuspension in 50 ul Nucleic Acid Dye 50 ul Färbereagenz, 1,5 ul Anti-Maus-CD45-APC, 5,0 ul Anti-Human-HLA-Alexa Fluor 488, und 100 ul Permeabilisierung entfernen Reagenz. Für mehrere Proben können diese Reagenzien vorgemischt werden und 206,5 ul der Mischung kann zu jedem Röhrchen hinzugefügt. Vortex vorsichtig mischenund Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  2. In 500 ul Verdünnungspuffer, Wirbel sanft, Platz Probenröhrchen in den Magneten, und Inkubation für 10 min. Während die Probenröhrchen befinden sich noch in dem Magneten, mit einem Glaspipette sorgfältig absaugen Restflüssigkeit ohne Berührung der Wand der Röhre neben dem Magneten und entsorgen. Die Probenröhrchen entfernen aus dem Magneten und resuspendieren in 350 ul Verdünnungspuffer. Vortex vorsichtig mischen.

4. Magnetische Geräte Loading

  1. Verwendung eines Gel-Ladespitze sorgfältig das gesamte Volumen aus dem Probenröhrchen übertragen in eine Patrone in der magnetischen Vorrichtung. Beginnen an der Unterseite der Patrone und langsam zurückzuziehen der Spitze, während die Probe abgegeben wird.
  2. Sobald die gesamte Probe übertragen worden ist, lose Kappe der Magnetvorrichtung Patrone und tippen Sie auf die Magnetvorrichtung mit Händen oder Labortisch, alle Blasen, die an den Kanten der Patrone stecken wie in Sectio beschrieben frein 3.1 der Standard-CTC Enumeration von Patient Blutproben mit Hilfe der CSS.
  3. Pop alle Blasen mit einer sterilen 22 G Nadel, indem er sie zwischen der Abschrägung und dem Rand der Patrone. Nachdem alle Blasen entfernt worden sind, fest verschließen die Patrone, lag die magnetische Vorrichtung flach, und Inkubation im Dunkeln für mindestens 10 min. Die Proben müssen innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung gescannt werden.

5. Scannen manuell getrennter Proben auf der Analyse-Instrument

  1. Schalten Sie das Analyseinstrument, initialisieren Sie die Lampe, und führen Sie die Qualitätskontrolle und Systemverifikation, wie in Abschnitt 3.2 der Standard-CTC Enumeration von Patientenblutproben mit der CSS-Protokoll beschrieben.
  2. Legen Sie die Probe auf die Analyseinstrument, und wählen Sie die Registerkarte Setup. Löschen Sie alle vorhandenen Daten auf dem Magnetgerätedaten durch Klicken auf die Schaltfläche Format Probe-Taste. Aktivieren Sie die FITC-Kanal einnd stellen Sie die Belichtungszeit auf 1,0 Sekunden, wie in Abschnitt 2.2 der CTC Charakterisierung für benutzerdefinierte Markierungen mit Hilfe der CSS beschrieben.
  3. Klicken Sie auf die Registerkarte Test Patient und wählen Sie Bearbeiten zur Eingabe der Probeninformationen. Wählen Cellsearch CTC als Kit-ID und CTC Forschung als Testprotokoll. Geben Sie die restlichen notwendigen Informationen, wie angegeben, wie der Stern. Speichern Sie die Probe Informationen und klicken Sie auf Start.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Standard-CTC Enumeration Assay

Die Empfindlichkeit und Spezifität des CSS wurde in der Literatur gut dokumentiert. Allerdings gleichwertige CTC Erholung bestätigen, Stachel (1.000 LNCaP menschlichen Prostata-Krebszellen) und undotierten menschlichen Blutproben von gesunden freiwilligen Spendern wurden auf der CSS mit dem Standard-Protokoll CSSCTC verarbeitet. Wie erwartet, waren undotierten Proben frei von CTC, 0,00 ± 0,00% und CTC Erholung wurde gezeigt, dass 86,9 ± 4,71% für die dotierten Pro...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Trotz der Entwicklung vieler neuer Technologien CTC seit der Einführung der CSS im Jahr 2004, ist diese Technik immer noch die einzige klinisch bewährte Technologie auf dem Markt, und deshalb wird es als der aktuelle Goldstandard für die CTC-Nachweis und die Zählung. Diese Handschrift hat gezeigt, dass, obwohl die CSS hat strenge Qualitätskontrollen kann es für die Auslegung Bias sein und das CTC-Identifikation in Patientenproben ist in dotierten Proben viel anders als Identifikation. Sechs Kategorien von häufig abweich...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Der Autor (ALA) erhielt Mittel, die von Janssen Onkologie, dessen Mutterunternehmen Johnson & Johnson besitzt auch Janssen Diagnostics LLC, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert wurde bereitgestellt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ontario Institute of Cancer Research (# 08NOV230), der Canada Foundation for Innovation (# 13199), Prostatakrebs Kanada, Janssen Onkologie, dem London Regional Cancer Program, und die Unterstützung der Geber von John und Donna Bristol unterstützt durch die London Health Sciences Foundation (ALA). UEG wird von einem Frederick Banting und Charles Best Canada Graduate Scholarship-Doktorandenpreis unterstützt. ALA wird von einem CIHR New Investigator Award und einer früh Researcher Award von der Ontario Ministerium für Forschung und Innovation unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M EDTA
Anti-humanes CD44-FITCBD Pharmigen555478
Anti-humanes CD44-PEBD Pharmigen555479
Anti-humanes HLA-Alexa Fluor 488BioLegend311415
Anti-Maus-CD45-APCeBioscience17-0451-82
Bond Primäres Antikörper-VerdünnungsmittelLeicaAR9352
CellSave KonservierungsröhrchenVeridex952820 (20er Pack) 79100005 (100er Pack)
CellSearch CTC Control KitVeridex7900003
CellSearch CTC KitVeridex7900001
CellSearch CXC Control KitVeridex7900018RUO
CellSearch CXC KitVeridex7900017RUO
Instrument BufferVeridex7901003
Streck Cell Preservant (aka CytoChex)Streck213350
1 ml Spritze
10 ml Serologische Pipette
1.000 µ l Pipette
1.000 &Mikro; l Pipettenspitzen
12 mm x 75 mm Durchflussschläuche
200 & micro; l Gel-Ladespitzen
200 & Mikro; l Pipette
22 G Nadel
5 3/4 Zoll Einweg-PasteurpipetteVWR14672-200
5 ml Serologische Pipette
Automatisierter Pipettierer
Kapillarblutentnahmeröhrchen (EDTA)BD Microtainer365974
CellSearch Analyzer IIVeridex9555Enthält Magnete und Verifizierungskarten
CellSearch AutoPrep SystemVeridex9541
Zentrifuge
MagCellect Magnet Forschung & Forschung D SystemsMAG997
Kleine LatexlampeVWR82024-550
Vortex

Referenzen

  1. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. 63 (1), 11-30 (2013).
  2. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  3. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  4. Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
  5. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  6. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
  7. Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
  8. Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
  9. Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
  10. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  11. Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
  12. Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
  13. Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
  14. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
  15. Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
  16. Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
  17. Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
  18. Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
  19. Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
  20. Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
  21. Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
  22. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
  23. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
  24. Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
  25. Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
  26. White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
  27. Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
  28. Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
  29. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
  30. Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
  31. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
  32. Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
  33. Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
  34. Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
  35. Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
  36. Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
  37. Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
  38. Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Zirkulierende TumorzellenCell Search SystemCTC AnreicherungCTC Charakterisierungbenutzerdefinierte MarkerMaus Xenograft ModelleEpCAM PositivselektionDifferenzialf rbungDurchflusszytometrie R hrchenMagnetger te Kartusche
Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.