Methodenartikel

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

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DOI:

10.3791/51302

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10. Juni 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Partikel-Tracking Mikrorheologie können zerstörungs quantifizieren und räumlich zuordnen Veränderungen in der extrazellulären Matrix mechanische Eigenschaften im 3D-Tumormodelle verwendet werden.

Zusammenfassung

Die mechanische Mikro wurde gezeigt, als entscheidender Regulator der Tumorwachstumsverhalten und die Signalisierung, die selbst umgebaut wird und als Teil eines Satzes von komplexen, zwei-Wege mechanosensitive Wechselwirkungen modifiziert handeln. Während die Entwicklung von biologisch relevanten 3D-Tumormodellen haben mechanistische Studien über die Auswirkungen der Matrix Rheologie auf das Tumorwachstum erleichtert die inverse Problem der Zuordnung Veränderungen in der mechanischen Umgebung von Tumoren induziert bleibt eine Herausforderung. Hier beschreiben wir die Umsetzung der Partikel-Tracking Mikrorheologie (PTM) in Verbindung mit 3D-Modellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs als Teil eines robusten und brauchbarer Ansatz zur Längs Überwachung physikalischer Veränderungen in der Tumor-Mikroumgebung, in situ. Die hier beschriebene Methodik integriert ein System zur Herstellung von 3D-Modellen in vitro in einem Modell der extrazellulären Matrix (ECM) Gerüst aus Typ I-Kollagen eingebettet mit fluoreszenzmarkierten Sonden für gleichmäßig verteilte position-und zeitabhängigen Messungen Mikrorheologie gesamten Probe. In vitro Tumoren werden plattiert und parallel Bedingungen mit Multiwellfolien untersucht. Gestützt auf etablierte Verfahren, sind Videos von Tracer-Sonde Bewegungen über das Generalized Stokes Einstein Beziehung (GSER), um die komplexen frequenzabhängigen viskoelastischen Schermodul G * (ω) berichten umgewandelt. Da dieser Ansatz Imaging-basierte, wird die mechanische Charakterisierung auch auf große Durchlichtraum Feldern zugeordnet, gleichzeitig berichten qualitative Veränderungen in 3D Tumorgröße und Phänotyp. Repräsentative Ergebnisse zeigen, kontras mechanische Reaktion in Teilbereichen mit lokalisierten Invasion-induzierte Matrixabbau sowie System-Kalibrierung, Validierung werden Daten vorgestellt. Unerwünschte Ergebnisse aus gemeinsamen experimentelle Fehler und Problemlösungen dieser Fragen werden ebenfalls vorgestellt. Die 96-Well-Format 3D-Beschichtung Kultur in diesem Protokoll implementiert ist, ist conducive zu Korrelation von Mikrorheologie Messungen mit therapeutischen Screening-Tests oder der molekularen Bildgebung, neue Einblicke in die Auswirkungen der Behandlungen oder biochemische Reize auf die mechanische Mikroumgebung zu gewinnen.

Einleitung

Es ist klar, von einer wachsenden Zahl von Hinweisen in der Literatur, dass Krebszellen, wie bei nicht-malignen Säuger Epithelzellen, reagieren sehr sensibel auf die mechanischen und biophysikalischen Eigenschaften der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) und andere Mikrokomponenten 9.1. Elegante mechanistische Studien Einblicke in die Rolle der extrazellulären Steifigkeit als eine komplexe Signal mechanosensitive Partner, der malignen Wachstumsverhalten und Morphogenese 2,3,10,11 reguliert ist. Diese Arbeit wurde insbesondere durch die Entwicklung von 3D in vitro-Tumormodellen, die biologisch relevante wiederherzustellen Gewebearchitektur und können in Trägermaterialien mit maßgeschneiderten Mechanik angebaut und durch optische Mikroskopie 12-19 abgebildet werden erleichtert. Jedoch ist die andere Seite dieser mechanoregulatory Dialog zwischen Tumor und Mikroumgebung, durch die Krebszellen wiederum Veränderung der Fließeigenschaften ihrer Umgebung bleibt etwasschwieriger zu studieren. Zum Beispiel während der Invasion Prozesse, die Zellen am Rande eines Tumors kann epitheliale mesenchymale Transition (EMT) zu unterziehen und erhöhen die Expression von Matrix-Metalloproteasen (MMPs), die lokalen Abbau von ECM 20-22, die wiederum Einfluss auf mechanosensitive Wachstumsverhalten führen andere proximalen Tumorzellen. Durch eine Vielzahl von biochemischen Prozessen, die Krebszellen die lokale Steifigkeit ihrer Umgebung wählen ständig auf und ab, um verschiedene Prozesse zu unterschiedlichen Zeiten anpassen. Die hier beschriebene Methode ist durch die Notwendigkeit für analytische Werkzeuge, die lokale Veränderungen in der Steifigkeit und Nachgiebigkeit der ECM während des Wachstums, die mit 3D-Tumormodellen integriert ist und in Längsrichtung mit biochemischen und phänotypische Veränderungen korreliert ohne Beendigung der Kultur werden kann berichten motiviert.

Auf der Suche nach einem geeigneten Verfahren in diesem Kontext zu implementieren, tritt Partikelverfolgungs Mikrorheologie (PTM) als starke Kandidaten.Diese Methode, die ursprünglich von Pionier Mason und Weitz 23,24 nutzt die Bewegung der Tracer-Sonden in einem komplexen Fluid eingebettet sind, um die frequenzabhängige komplexe viskoelastische Schermodul G * (ω) in Mikron Längenskalen zu melden. Dieser allgemeine Ansatz wurde mit mehreren Varianten für unterschiedliche Anwendungen in weichen kondensierten Materie, Kolloide, Biophysik und Polymerphysik 25-31 geeignet entwickelt. PTM hat gewisse Vorteile gegenüber anderen Methoden, da die Messwerte von lokalen Viskoelastizität durch zerstörungsfreie Videoabbildungs ​​biochemisch inaktive Tracer-Sonden, die zum Zeitpunkt der Kulturansatz aufgenommen werden und bleiben an Ort und Stelle über einen längeren Zeitraum des Wachstums bereitgestellt. Dies steht im Gegensatz zu Gold Standardmessungen mit einer oszillierenden Schergroß Rheometer, was notwendigerweise erfordert Beendigung der Kultur und meldet den Groß makroskopischen Rheologie der Probe statt Punktmessungen innerhalb der komplexen 3D Tumor microenvironment. In der Tat eine Reihe von Studien haben den Nutzen der Interpretation von Messungen der Sonde Tracer Bewegungen in oder rund um Krebs oder Nicht-Krebs-Zellen, um Verformungen der Zellmigration 32, mechanische Beanspruchung von einem expandierenden Sphäroid 33, intrazelluläre Rheologie 34,35 induziert zu bemessen dargestellt und mechanische Spannungen und Dehnungen in Geweben entwickelt 36, und die Beziehung zwischen Porengröße und Invasion Geschwindigkeit 37 zuzuordnen. Andere Techniken für Mikrorheologie wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) implementiert werden kann, sondern in erster Linie zur Untersuchung von Punkten auf der Oberfläche der Probe und kann auch Kultur Sterilität, die Längs Messungen erschweren 38 darstellen.

Hier ein umfassendes Protokoll umfasst Methoden für das Wachstum der 3D Tumorsphäroide geeignet für den Transfer in ECM mit eingebetteten Fluoreszenzsonden für Video-Partikel-Tracking-und Analyse-Methoden für die zuverlässige Abbildung räumlicher beschreiben wirVeränderungen im Laufe der Zeit Mikrorheologie in der Kultur. In der vorliegenden Implementierung werden 3D-Tumormodellen in Multiwell-Format mit Blick auf Einbau von Mikrorheologie Messungen mit anderen traditionellen Tests (zB Zytotoxizität), die dieses Format ist förderlich für gewachsen. In dieser repräsentativen Darstellung dieser Methodik wir Kultur in vitro 3D-Sphäroiden mit PANC-1-Zellen, eine etablierte Pankreaskrebszelllinie bekannt, Sphäroiden 39, sondern alle hier beschriebenen Messungen bilden, sind breit anwendbar zu studieren, von soliden Tumoren mit einer Vielzahl von Zelllinien geeignet für 3D-Kultur. Da diese Methode von Natur-basierte Bildgebung ist es ideal für Co-Registrierung von hochauflösenden Mikrorheologie Daten mit großen Durchlicht-Sichtfelder, die Veränderungen in der Zellwachstum, Migration und Phänotyp berichten geeignet. Die Umsetzung der PTM integrierten Durchlichtmikroskopie auf diese Weise davon ausgegangen, reproduzierbare Positionierung der Mikroskoptisch whICH ist auf motorisierte kommerzielle Weitfeld-Epifluoreszenz biologische Mikroskope der Regel zur Verfügung. Die folgende entwickeltes Protokoll kann mit jedem vernünftig ausgestattet automatisierten Fluoreszenzmikroskop biologischen umgesetzt werden. Dies ist ein von Natur aus datenintensive Methode, die Übernahme von Gigabyte an digitalen Videomikroskopie für die Offline-Verarbeitung erfordert.

In dem folgenden Protokoll, Protokoll 1 bezieht sich auf die anfängliche Herstellung von Tumor-Spheroide, die hier mit Überlagerung auf Agarose beschrieben, konnte aber mit einer Vielzahl von anderen Methoden, wie hängenden Tropfen 40 oder Rotationskultur 41 Techniken ersetzt werden. Protokoll 2 beschreibt den Prozess der Einbettung Sphäroiden in einer Kollagengerüst, obwohl alternativ könnte in vitro 3D Tumoren durch Einkapselung oder Einbettung von resuspendierten Zellen in ECM 12,15, anstatt einzelne vorgeformte nichthaft Sphäroide gezüchtet werden. Nachfolgende Protokolle beschreiben Verfahren zur obtaining zeitaufgelöste Messungen Mikrorheologie durch Erfassen und Verarbeiten von Videomikroskopiedaten. Die Datenverarbeitung wird mit MATLAB, die Nutzung von Open-Source-Routinen für PTM auf Algorithmen ursprünglich von Crocker und Grier 42, die auch ausgiebig für verschiedene Software-Plattformen entwickelt, gebaut beschrieben (siehe http://www.physics.emory.edu/ beschrieben ~ Wochen / IDL /).

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Protokoll

1. Kultivierung Tumorsphäroide

  1. Mischungs 10 ml Zellkultur-Wasser mit 0,1 g Agarose, um ein 1% Agarose-Lösung erhalten.
  2. Wärme Agarose-Lösung auf über 70 ° C (etwa 14 sec in einer Standard Mikrowelle oder durch Verwendung einer Heizplatte) vor dem Aliquotieren von 40 &mgr; l Agarose-Lösung in eine Vertiefung auf einer Platte mit 96 Vertiefungen.
  3. Inkubieren Platte bei 37 ° C für mindestens 1 Stunde bei der Ernte-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken.
  4. Verwenden eines Hämazytometers, um die Konzentration der Zellen in der Suspension zu bestimmen.
  5. Verdünnen Zellsuspension auf 1.000 Zellen / ml und 100 ul dieser Verdünnung auf die Vertiefung, die die ausgehärtete Agarose Bett.
  6. Legen Sie die Probe auf einem Schüttler über Nacht in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt.
  7. Entfernen Probe von Shaker geben und 100 ul Zellkulturmedien.
  8. Sphäroiden inkubieren, bis der gewünschte Durchmesser erreicht ist. Zum Beispiel nach 9 Tagen eine spHeroid ungefähr 450 um im Durchmesser sein. Während dieser Zeit kann frisches Wachstumsmedium zu den Vertiefungen gegeben werden, aber Aspiration zu vermeiden, da dies bei der Entfernung des Sphäroids führt.

2. Vorbereitung 3D Tumorsphäroide Eingebettet in ECM

  1. Bereiten Sie einen Arbeitsplatz mit benötigten Materialien innerhalb einer Steril.
  2. Bereiten Sie eine verdünnte Mischung aus Carboxylat-modifizierte 1 um Durchmesser fluoreszierender Tracer-Sonden durch Zugabe von 2 Teillager Sonden (2% Feststoffe) bis 25 Teile sterilem Wasser.
  3. Entfernen Sie eine Flasche von 3,1 mg / ml Rinderkollagen aus dem Kühlschrank und legen Sie es auf Eis.
  4. 125 ul Aliquot von Kollagen in ein leeres 2-ml-Ampulle.
  5. In 50 ul verdünnte Tracer Sonde Lösung für das Fläschchen mit dem Kollagen und kurz vortexen, um Sonden zu verteilen.
  6. In 235 ul der entsprechenden Zellkulturmedien, die Phenol-Rot (die gelb wird) mit einem Gesamtvolumen von 410 ml und Wirbel kurz bevor 205 ml (die Hälfte des Gesamtvolumens) und es in ein neues 2-ml-Ampulle. Vial 1 die Tumor Sphäroid enthalten und Fläschchen 2 wird eine Steuer Gemisch sein.
  7. In ~ 2 ul 1 M NaOH auf Vial 1, um die Lösung wieder auf neutralen pH-Wert (Kulturmedien Phenolrot enthält, sollte auf rot zurück) zu bringen. Beachten Sie, dass dies bewirkt, dass die Mischung der Aushärtung, wenn sie nicht auf Eis gehalten, um zu beginnen. Vortex kurz zu mischen, dann auf Eis Rack sofort zurück.
    HINWEIS: Das Sphäroid ist kaum sichtbar, die mit bloßem Auge nach 9 Tagen der Kultur und ihrer Entfernung aus dem Agarose-Bett ist eine heikle Aufgabe. Verwendung eines Dissektionsmikroskop kann hilfreich für einige Nutzer. Die Aufrechterhaltung der Integrität der Sphäroid während der Übertragung ist von größter Bedeutung.
  8. Mit einem breit-Mund-Pipettenspitze, entfernen 40 ul Medium aus dem Brunnen, die das Tumor Sphäroid. Bewahren Sie diese 40 ul bei der Durchführung der nächste Schritt.
  9. Überprüfen Sie das gut zu sehen, wenn das Sphäroidwurde im vorherigen Schritt entfernt. Wenn ja, fügen Sie die 40 ul, die das Sphäroid zu Vial ein. Falls nicht, legen Sie die 40 ul zurück in den Brunnen, und wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
  10. Rühren Sie leicht Vial 1 (nicht Gefahr, Vortex, kann es die Sphäroid beschädigen) vor der Übertragung der Mischung in 60 ul-Portionen in drei separaten Wells einer 96-Well-Platte. Überprüfen Sie jede Vertiefung mit einem Mikroskop nach Zugabe Mischung zu bestimmen, welche auch enthält das Sphäroid.
  11. In ~ 2 ul 1 M NaOH und 40 ul Zellkulturmedien zu Vial 2 und Wirbel vor Aliquotierung 60 ul dieser Mischung in einen leeren Brunnen in der 96-Well-Platte und Kennzeichnung als Kontrolle.
  12. Die Platte wird in einem 37 ° C-Inkubator für mindestens 1 Stunde aushärten.

3. Construct Grid von Probe-Punkte und Nehmen Sie ein Video an jedem Punkt

  1. Übertragen Sie die Probenplatte aus dem Inkubator auf dem Mikroskoptisch. Erlauben 10 min, bis die Probe Equilibrate mit der Raumtemperatur, wenn ein beheiztes Bühne ist nicht verfügbar.
  2. Beachten Sie die Probe mit schwacher Stromversorgung Objektive um sicherzustellen, dass sie intakt und bereit für die Bildgebung ist. Ermitteln Sie die Position innerhalb der Tumor gut.
  3. Entscheiden Sie, wie viele Punkte, um Probe zu nehmen. Typischerweise werden 20 Proben in jeder Vertiefung, in konzentrischen Ringen um das Sphäroid verteilt ausreichend detaillierte Ergebnisse zu produzieren.
  4. Bewegen Sie die Bühne, um jede gewünschte Position und verwenden Mikroskop Schnittstellen-Software, um die x-und y-Koordinaten (oder Aufnahme-Koordinaten manuell, wenn Schnittstellen-Software nicht erreichbar ist) aufzeichnen.
  5. Schalten Sie das Mikroskop zu einem Hochleistungs-Objektiv (typischerweise 100X), und wählen Sie die entsprechende Filterwürfel für die Anregungswellenlänge der Tracer-Sonden. Verwenden Sie die Liste der Punkte in Schritt 3.4 erstellt, um auf den ersten Punkt im Netz zu bewegen.
  6. Stellen Sie den Fokus auf den Boden des gut finden, dann nach oben, um ein Sichtfeld (FOV) mit mehreren In-Fokus-trac findenäh Sonden.
  7. Beachten Sie die Intensität Histogramm die Belichtung eingestellt und Intensität und Zeit, um den größten Dynamikbereich möglich zu geben, während sichergestellt wird, dass das Bild nicht gesättigt zu werden.
  8. Besorgen Sie sich eine Videosequenz mit einer Bildrate von 20 bis 30 ms pro Bild (ca. 800 Frames oder 16-24 Sekunden lang wird empfohlen, um eine ausreichende Statistik für robuste MSD Berechnung mit der Notwendigkeit zur Minimierung der Messzeit an jedem Raumgitterpunkt ausgeglichen Verfügung stellen) und sparen Sie mit einer entsprechenden Konvention. Während der Aufnahme nicht berühren das Mikroskop oder Tisch.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 3,6-3,9 für jeden Probenpunkt im Netz.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,10 für jeden auch im Experiment.

4. Analysieren Video Data zu rheologischen Eigenschaften bei jedem Abtastpunkt Berechnen

  1. Kopieren aller Videodaten auf einer Analyse Ordner (möglicherweise auf einem anderen Computer).
  2. Import von Bilddaten in MATLAB oder andere Analyse-Software.
    NOTE: Umfangreiche Dokumentation über die Reihe von MATLAB hier angenommen Partikelverfolgung Routinen ist verfügbar http://people.umass.edu/kilfoil . Die Verwendung eines kundenspezifischen aufrufenden Funktion für die Automatisierung Verarbeitung mehrerer Dateien an verschiedenen Positionen empfohlen.
  3. Kalibrieren der Software durch die Analyse mehrere Frames des Videos und Ablehnung Parameter (Größe, Bandpass-, usw.) für das Identifizieren der Sonde Mittelpositionen entsprechend zu bestimmen. Umfangreiche Hintergrund für diese entscheidenden Schritte wird von Crocker und Grier beschrieben.
  4. Verwenden Sie die Software, um jedes Sondenposition für alle Video-Frames automatisch zu ermitteln und verknüpfen diese Positionen in Bahnen.
  5. Verwenden Sie die Bahndaten, die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) als Funktion der Verzögerungszeit zu berechnen, wobei Sie auf die entsprechende Raumkalibrierungsfaktor (um pro Pixel) für die spezifische Objektiv, jeder Pixel-Binning, etc. gelten (in der Regel durchgeführtin Meta-Daten).
  6. Berechnen G * (mit der verallgemeinerten Stokes-Einstein-Beziehung berücksichtigt die Grenzen der Anwendbarkeit von GSER für eine bestimmte Probe 24,28,43. Alternativ können Benutzer möchten ECM Eigenschaften direkt von MSD durch einen einfachen Vergleich Potenzgesetz Skalierung, Hochebene zu interpretieren Werte, Indices Heterogenität oder andere Parameter.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.6 für jede SFZ im Experiment.
  8. Zusammen registrieren Positionsdaten aus Schritt 3.4 mit viskoelastischen Moduli bei einer bestimmten Frequenz von Interesse. Je nach Hersteller des Mikroskops verwendet wird, kann dieser Schritt durch eine benutzerdefinierte Routine, die Mikroskop Metadaten oder Positionsdaten können manuell tabellieren liest erleichtert werden.
  9. Verwenden Sie 3D-Interpolation Funktionen, um eine räumliche Karte Rheologie der ECM zu generieren.

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Ergebnisse

Um die Gültigkeit von G * (ω)-Messungen an lokalisierten Positionen in einem komplexen Modell Tumor-Mikroumgebung zu verifizieren, wurden zwei erste Validierungsexperimente durchgeführt. Zuerst haben wir versucht, unsere Messungen gegen den "Goldstandard" der Groß oszillierende Scher rheometry validieren. Wir stellten identische Proben von Kollagenmatrix (ohne Zellen) in einer Konzentration von 1,0 mg / ml Kollagen. Diese Proben wurden mit einer Schütt Rheometers (TA Instruments AR-G2, unter Verwendun...

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Diskussion

In diesem Protokoll führen wir eine robuste und breit anwendbare Strategie für längs Tracking lokale Änderungen in ECM Steifigkeit in 3D-Tumormodellen. Wir stellen uns vor, dass diese Methodik könnte durch Krebs Biologen und Biophysiker interessiert mechanosensitive Verhalten in Matrixumbau bei Tumorwachstum und Invasion Prozesse verwickelt angenommen werden. Präzise Quantifizierung der Matrix Abbaukinetik kann besonders für diejenigen, die Untersuchung der Aktivität von Matrix-Metalloproteasen, Lysyloxidase oder andere...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken für die Open-Source-Nutzung von MATLAB Partikel-Tracking-Code von Maria Kilfoil vorgesehen ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), zusammen mit dem früheren IDL-Code und eine umfangreiche Dokumentation von John C. Crocker und Eric bereitgestellt R. Weeks. Diese Arbeit durch Mittel aus dem National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 und R00CA155045 (: JPC PI) ermöglicht.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rinder-Typ-1-KollagenBD Biosciences, San Jose, Kalifornien354231
PANC-1American Type Cell Culture, Manassas, VACRL1469oder andere geeignete
Life Technologies, Carlsbad, CA906906
MatrigelBD Biosciences, Bedford, MA354230
AgaroseFisher Bioreagents, Waltham, MAC12H18O9
NaOHFisher Bioreagents, Waltham, MANC0480985
96-Well-SpeicherfolienCorning Inc., Corning, NY3904
DMEMHyclone, Waltham, MASH30243.01oder geeignete Zellkulturmedien
Zeiss AxioObsever MikroskopZeiss, Oberkochen, Deutschlandinklusive Hochgeschwindigkeitskamera und Bildgebungssoftware
MATLAB-SoftwareThe Mathworks, Natick, MA
Zelltyp-Fluoreszenz-Mikrosphären

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