Methodenartikel

Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln

DOI:

10.3791/51305

⸱

16. April 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterans Affairs, Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 4Department of Medicine, University of Minnesota Medical School, University of Minnesota

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplex-Assays können nützliche Informationen für grundlegende zelluläre Mechanismen und beseitigen Abfälle von Reagenzien und unnötig wiederholende Experimenten. Wir beschreiben hier ein Multiplex-Caspase-3/7 Aktivitätstest unter Verwendung von fluoreszierenden und lumineszier-basierte Verfahren, um die Lebensfähigkeit der Zellen in einem in vitro Modell Hypothalamus folgenden oxidativen Herausforderung mit Palmitinsäure bestimmen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fähigkeit, Tests in Studien von komplexen zellulären Mechanismen Multiplexen beseitigt die Notwendigkeit für wiederholte Versuche, stellt die internen Kontrollen und verringert Abfall Kosten und Reagenzien. Hier beschreiben wir die Optimierung eines Multiplex-Assays, um die Apoptose zu beurteilen Ein Palmitinsäure (PA) Herausforderung in einem in vitro-Modell des Hypothalamus, unter Verwendung von sowohl Fluoreszenz-und Lumineszenz-basierten Assays, um lebensfähige Zellzahlen und Caspase-3/7-Aktivität in einer 96-Well-Messung Mikrotiterplatten-Format. Nach PA Challenge wurden lebensfähigen Zellen durch eine Resazurin-basierte Fluoreszenztest bestimmt. Caspase-3/7 Aktivität wurde dann unter Verwendung eines luminogenen Substrat, DEVD und normalisiert auf die Zellzahl. Dieses Multiplexing Assay ist eine nützliche Technik zum Bestimmen Änderung Caspase-Aktivität nach einer apoptotischen Stimulus, wie z. B. gesättigte Fettsäure Herausforderung. Die gesättigten Fettsäuren PA Hypothalamus oxidativen Stress und Apoptose zu erhöhen, was die potenziellen Einfuhrnz der Assays wie hier beschrieben in die Untersuchung der Beziehung zwischen gesättigten Fettsäuren und neuronalen Funktion.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ernährung reich an gesättigten Fettsäuren, wie Palmitinsäure (PA) haben, Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes 1, 2 verbunden worden. Hohe Fett-Diäten haben auch gezeigt, dass oxidativer Stress, Apoptose und neuronale Degeneration im Hypothalamus, einem wichtigen Regulator der Appetit und Energieaufwand 3-7 erhöhen. Das Verständnis der Mechanismus, durch den hohen Fett-Diät-Exposition induziert Hypothalamus Dysregulation ist somit wichtig für die Entwicklung von pharmakologischen Behandlungen für Übergewicht. , Die zellulären Mechanismen, durch die Nahrungsfett beeinflusst die neuronale Funktion bleibt jedoch unklar. Ein besseres Verständnis, wie Fette, wie PA könnte Einsetzen der Hypothalamus-apoptotische Signalwege auslösen, ist ein notwendiger erster Schritt hin zu diesem Ziel. Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Multiplex-Assays für in-vitro-Tests der neuronalen Antwort auf PA Exposition, für den Einsatz in Studien von h entwickelt beschreibenypothalamic Neurodegeneration. Wir liefern eine detaillierte Beschreibung eines in vitro 96-well Format Multiplex-Assay zur Messung der Caspase 3/7 Aktivität pro Gesamtzahl der Zellen in einem differenzierten verewigt erwachsenen Maus Hypothalamus-Zelllinie (A12 bezeichnet) nach oxidativer Herausforderung mit PA-8.

Kurz gesagt, wird die Lebensfähigkeit der Zellen nach PA Herausforderung über ein Resazurin basierte Assays bestimmt. Resazurin ist eine Zelle durchlässige Verbindung, die enzymatische Reduktion in metabolisch aktiven Zellen unterzogen, um ein Verfahren, dachte über die Mitochondrien 9 auftreten. Lebensfähige Zellen kontinuierlich Resazurin zu Resorufin zu konvertieren, wodurch ein Fluoreszenzsignal proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen. Caspase-3/7 Aktivität wird dann unter Verwendung eines DEVD-basierten Assay lumogenic. DEVD eine Aminosäure-Sequenz (Asp-Glu-Val-Asp) von Caspase-3 gespalten wird. Wenn diese Sequenz mit einer lumogenic Substanz bei Aktivierung des intrazellulären Caspase-3/7 und anschließende Spaltung gekoppelt ist,DEVD von Substrat wird die lumineszierende Produkt freigesetzt. Diese Reaktion ist proportional zu Caspase-Aktivität und damit zur Induktion von Apoptose. Da tote Zellen nicht Caspase zu erzeugen, ist Caspase-3/7 Aktivität von Natur aus vergänglich; Analyse daher sollte zwischen 30 min bis 4 Stunden nach der Herausforderung, je nach Wirksamkeit der Zell Stressor abgeschlossen werden. Zelllebensfähigkeit ist umgekehrt proportional zu der Caspase-3/7 Aktivität und kann verwendet werden, um zu bestimmen Mechanismen des Zelltods. Beispielsweise wurde dieses Verfahren bisher verwendet worden, um diese Vorbehandlung mit dem Peptidhormon Orexin verringert die Apoptose in Zellen des Hypothalamus mit Wasserstoffperoxid in Frage, was darauf hindeutet, dass die Mechanismen durch diese Behandlung nicht betroffen sind beim Schutz gegen oxidative Schädigung 10 wichtig zu zeigen. Es ist wichtig zu beachten, diese Tests sind Zelllinie-und gewebeabhängig, wie sie verlassen sich auf die mitochondriale Aktivität Assay-Reagenzien zu reduzieren. Dieses Protokoll wurde für erwachsene Maus Hypothalamus (A12) Zellen optimiert; jedochbeschriebenen Verfahren geändert werden, um im Rahmen der Forschung ähnlich zu passen.

Multiplexing-Tests aus einer einzigen Kultur und bietet einen Vorteil gegenüber der traditionellen Methode der Durchführung einzelner Tests aus mehreren Gründen. Neben der Zeitersparnis, Zellproben, Reagenzien und Kultur kann auch Multiplex-Assays Wissen des Zellüberlebens und Tod, stellen interne Kontrollen, und die Notwendigkeit für Wiederholungsversuche 11, 12.

Alternative Methoden haben sich auf Western-Blots oder ELISAs, die zuverlässig sind Tests verlassen, sind aber teuer und zeitaufwändig (1-2 Tage), insbesondere bei der Verwendung eines 96-Well-Format. Außer der Zeit, die zur Kultivierung von Zellen für die Multiplexassay, ist die Gesamtzeit von weniger als 3 Stunden. Während dieses Protokoll wurde für die Verwendung mit A12-Zellen optimiert wurde, kann es für den Einsatz in anderen Modellen verändert werden, ohne dass dabei Faktoren, die die Integrität der Zelle beeinflussen können. AbschreckenBergbau, wenn dieses Protokoll für eine Reihe von Experimenten funktionieren würde, hängt von der Anzahl der Proben oder experimentellen Bedingungen und über geplante nachgeschalteten Experimenten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Überzug und Pflege von Zellkultur

  1. Warme Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM), Kulturmedien (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin / Neomycin) bis 37 ° C
  2. Erhalten Lager von gefrorenen Zellen A12 von -80 ° C
  3. Schnell auftauen Zellen in 37 ° C Wasserbad; einmal aufgetaut, sanft Pipette Zellen auf eine 75 cm 2 entlüftet Kulturflasche übertragen und 10 ml der Kulturmedien.
  4. Inkubieren Kolben über Nacht in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Saugen Medien nach 24 Stunden und ersetzen mit frischen Medien. Weiterhin wachsende Zellen, bis 70-80% Konfluenz erreicht ist (2-3 Tagen Wachstum).

2. Zählen und Überzug Cells

  1. Warmen DMEM und 1x-Trypsin-EDTA-Lösung auf 37 ° C
  2. Aspirat Medien von Zellen und Waschen zweimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
  3. Gib 500 ul Trypsin-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 2-5 min.
  4. TrennenZellen von der Flasche mit einem Schaber und Zellen zu suspendieren in 5 ml Medium. Pass-Zellen durch Sieb und durch Zell Sieb in einen sauberen 50-ml-Tube. Möglicherweise müssen Sie Zellen durch Sieb mehr als einmal passieren, aber nicht mehr als drei Mal zu wiederholen.
  5. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer nach Menge der Zellen zu bestimmen, die Kultur in einer 96-well klar unten schwarz oder weiß ummauerten Platte in einem Gesamtvolumen von 100 ul Medium Saatgut 6.000 Zellen / gut. Inkubieren Platte in 5% CO 2 bei 37 ° C für 24 Stunden.

3. Bestimmung Zelllebensfähigkeit und Caspase-3/7 Aktivität

  1. PA übertragen, um eine sterile 5 ml Glasfläschchen und löslich in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO). Verdünnen Lager PA-Lösung 1:10 in DMSO und fügen Sie es DMEM vorgewärmt, um eine endgültige Arbeitskonzentration von 0,1 mM PA erhalten. Für Kontrollmedien, fügen die gleiche Konzentration an DMSO, die Medien, die PA hinzugefügt.
  2. Entfernen Sie die Medien in jede Vertiefung und ersetzen mit 50 ul Medien + / -PA. Inkubiere die Platte für 2 Stunden in 5% CO 2 bei 37 ° C. Daraufhin 5 ul Resazurin Reagenz und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
  3. Mit einem Multimode-Mikroplatten-Reader, Platten Fluoreszenz (560 EX / 590 EM) auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen. Die Ergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) dargestellt.
  4. Auf die gleiche Platte, fügen Sie 55 ul von Caspase-Reagenz und bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
  5. Auch mit Hilfe der Mikroplatten-Reader, Platten Lumineszenz Caspase-3/7 Aktivität zu messen. Die Ergebnisse sind als relative Lumineszenz-Einheiten (RLU) dargestellt, mit Lumineszenz direkt proportional zur Caspase-3/7 Aktivität.
  6. Um normalisieren Caspase-3/7 Aktivität Zellzahl, teilen die Lebensfähigkeit der Zellen (RFU) durch Caspase-3/7 Aktivität (RLU).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Protokoll oben beschrieben, führt Multiplexen zwei Assays zur Bestimmung Mechanismen des Zelltods. Fig. 1 zeigt eine Übersicht über das Protokoll zur Zelllebensfähigkeit und Caspase-3/7-Aktivität zu bestimmen. Caspase-Aktivität wurde in Zellen, die mit PA nach 2 h Inkubation (Fig. 2A und Tabelle 1) in Frage deutlich erhöht. Verlust der Zellmembranintegrität ist eine morphologische Veränderung mit der Induktion von Apoptose, die nach 2 Stunden Einwirkung PA (...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Multiplex-Assay ist ein gut anerkanntes Verfahren, die von Wissenschaftlern in zahlreichen Anwendungen wie PCR-Mikroarrays, Immun und andere Protein-basierten Nachweismethoden 13, 14 verwendet wurde. Kürzlich, Multiplexing-Tests haben sich in den in-vitro-Platte-basierte Experimente zunehmend genutzt und haben als eine genaue Methode zur Bewertung der Zytotoxizität validiert und Lebensfähigkeit 12. In dem obigen Protokoll zeigen wir die Wirksamkeit der Multiplex-Fluoreszenz-und Lumines...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Konflikte offen zu legen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier beschriebene Arbeit wurde durch das US Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory Forschung und Entwicklung BX001686-1A1 und VA Rehabilitation Forschung und Entwicklung finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Adulte Maus-Hypothalamus-Zelllinie mHypoA-1/2 Cellutions Biosystems Inc.CLU172
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s MediumInvitrogen10313-039
Fötales Rinderserum PAA LabsA15-751
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15070-063
PalmitinsäureSigma-AldrichP0500
DimethysulfoxidSigma-AldrichD2650<
br/> PrestoBlue Reagenz für die ZellviabilitätInvitrogenA13262
Caspase-Glo 3/7 Assay SystemsPromegaG8091
96 W Optische Bodenplatte, schwarzes Polystyrol, in Zellkulturen behandelt, mit Deckel, sterilThermo Fisher Scientific165305
SpectraMax M5 Multi-Mode Mikrotiterplatten-MolekulareBauelemente

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
  2. Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
  3. Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
  4. Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
  5. Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
  6. Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
  7. Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
  8. Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
  9. Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
  10. Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
  11. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  12. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
  13. Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
  14. Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
  15. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  16. Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
  17. Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Apoptose Nachweishypothalamische NeuronenPalmitins ure ChallengeZellviabilit tsassayCaspase 3 7 Aktivit tfluoreszierende Lumineszenz AssaysMikroplattenreader AnalyseResazurin basierter AssayDEVD Substrat

Verwandte Artikel