Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Proteine ​​sind die am schnellsten wachsende Klasse von Therapeutika ⁶ und die rasche Expansion der Biotherapeutika-Pipelines hat immer mehr Aufmerksamkeit auf die Herausforderungen, die mit der Entwicklung und Verwendung von Protein Drogen konzentriert. Eine einzigartige Betrachtung ergibt sich aus der Tatsache, daß in einem gesunden und funktionierenden Immunsystems, alle extrazellulären Proteine ​​werden durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) abgetastet. Einmal durch APCs internalisiert wird ein Protein in kleine Peptidfragmente gespalten, und putativen immunogenen Segmente werden in die Nut des Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplex-Proteine ​​(MHC II) geladen. Die Peptid-MHC-II-Komplexe werden dann auf der Oberfläche von APC angezeigt und wahre immunogene Peptide, genannt T-Zell-Epitope bilden ternären II-MHC-Peptid-T-Zell-Rezeptor-Komplexe mit verwandten CD4 T-Zell-Oberflächenrezeptoren ^7. Diese kritische Ereignis molekularen Erkennung löst eine komplexe Signalkaskade, die in T-Zell-Aktivierung führt, die Freisetzung von Zytokins, CD4-T-Zell-vermittelten B-Zell-Reifung und letztlich die Produktion von zirkulierenden IgG-Antikörper, die zu binden und deaktivieren Sie das säumige exogene Protein. So könnte immunogene Proteine ​​durch die Identifizierung Bestand T-Zell-Epitopen und mutiert Schlüsselreste für MHC-II-Komplexbildung verantwortlich deimmunized werden. Es trägt jedoch in Kenntnis, dass T-Zell-Epitope können zahlreiche und breit während immunogene Proteine ​​verteilt sein, und die Mehrheit der Epitop-Löschen Mutationen wahrscheinlich ein unbeabsichtigter Verlust der Proteinfunktion oder Stabilität verursachen. Daher deimmunized Engineering Biotherapien kann eine komplexe und technisch anspruchsvolle Ziel sein, aber es gibt mehrere Beispiele von erfolgreichen T-Zell-Epitop-Deletion Projekte ^3,5,8-12. Anders als Pfropfen-basierten "Humanisierung", die weitgehend auf Antikörper-Therapeutika eingeschränkt ist, kann Epitop Löschung im Wesentlichen jedes Zielprotein unabhängig von der Sequenz, Struktur, Funktion angewendet werden, oder die Verfügbarkeit von homologouns Menschen Gerüste. Der erste Schritt zur Umsetzung eines solchen Ansatzes ist die Identifizierung von Schlüssel Peptid-Epitope innerhalb der Zielproteinsequenz eingebettet.

Hoher Durchsatz biochemischen Assays unter Verwendung von synthetischen Peptiden und rekombinanten humanen MHC-II-Moleküle kann eine schnelle vorläufige Einblicke in Epitop-Erkennung und Eingrenzung ^1,3-5 bieten. Diese ELISA-Assays kann eine starke Ergänzung zu anderen Protein / Impfstoff-Design-und Entwicklungstools können. Zum Beispiel, eine gut etablierte experimentelle Ansatz zur Epitop-Mapping setzt auf Zeit, Arbeit, ressourcenintensiv und Ex-vivo-Zellproliferationsassays ^15. Kurz gesagt, wird die Primärsequenz eines Zielproteins zunächst in einer Gruppe von überlappenden Peptiden unterteilt häufig überlappen 15-mere mit 12 Resten zwischen benachbarten Peptiden. Das Peptid chemisch synthetisiert wird Platte und der Immunogenität jedes Peptid in einer von mehreren verschiedenen Immunoassays, die Umfangs bloo beschäftigen getestetd mononuklearen Zellen (PBMC) aus menschlichen Spendern isoliert ^13,14. Um mehr Vertrauen in die Ergebnisse liefern, Peptide werden typischerweise in Replikat mit PBMC von 50 oder mehr verschiedenen Spendern getestet. In Fällen, in denen Deimmunisierung ist das ultimative Ziel ist die Arbeit noch durch die Notwendigkeit, zusätzliche Platten von mutierten Peptide produzieren und testen Sie die neuen Peptid-Panels in PBMC-Tests vor der Einführung deimmunizing keine Mutationen in das Protein voller Länge für spätere Funktionsanalyse ¹⁰ verstärkt. Während diese zellulären Assays bleibt der Goldstandard für die Bewertung der immunogenen Potential in menschlichen Patienten, kann die Effizienz eines solchen erschöpfend Ansatz Vorfilterung putativen immunogenen Epitopen unter Verwendung eines schnellen und hohen Durchsatz MHC-II-Peptid-Bindungstest verbessert werden.

Ebenso können biochemische Peptid-MHC-II-Bindungsassays mit prädiktiven in silico-Methoden kombiniert werden, um radikal zu beschleunigen, die das Epitop Identifikationsprozess.Es gibt eine Vielzahl von Computerwerkzeuge für die T-Zell-Epitop-Vorhersage Beispiele schließen ProPred ^16, MHCPred ^17, SVRMHC ^18, ARB ^19, SMM ausrichten ^{20, 21} NetMHCIIpan sowie proprietäre Tools wie EpiMatrix von EpiVax ^22. Ebenso haben Epitop Prädiktoren vor kurzem mit anderen Bioinformatik und Molekularmodellierungswerkzeuge, integrierte Protein Deimmunisierung Algorithmen entwickelt, um das Risiko, dass deimmunizing Mutationen könnten Protein-Struktur und Funktion stören ^23-26 mildern ergeben kombiniert. Während mehrere Epitop Prädiktoren haben sich einigermaßen genau zu sein ^27,28, Rechenergebnisse immer erfordern experimentelle Validierung. Schnelle, hohen Durchsatz und kosteneffektive experimentellen Methoden am besten geeignet sind als Vorfilter für die in silico-Epitop-Vorhersagen.

In ähnlicher Weise kann Epitop Prädiktoren Antigen-Auswahl für Rückwärts vaccinolo fahrengy ^29,30. Beispielsweise haben Fortschritte in der Bioinformatik gesamte Genom Bildschirme schnell in Form von ganzen Proteinen oder Peptid-Epitope aus Pathogen Proteome extrahiert identifizieren Impfstoffkandidaten ergab. Während diese grundlegende Technologie ist Neugestaltung der Entdeckung und Entwicklung von Schutz Impfstoffe, stellt es eine neue Herausforderung in Form von widerspenstig große Listen von immunogenen Impfstoff-Kandidaten. Hochdurchsatz-Peptid-MHC-II-Bindungsassays können Epitop-Auswahl führen durch die Quantifizierung Peptid-Bindungsaffinität und Bindungs ​​Promiskuität unter mehreren MHC-II-Allele. Wie bei Protein Deimmunisierung werden solche experimentellen Methoden erforderlich, um letztlich computergestützten Vorhersage von vielversprechenden Impfstoff führt zu validieren.

Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Format skaliert wird beschrieben. Das Protokoll ist sehr parallelisierten und reduziert Reagenzienkosten um 75% im Vergleich zum zuvor beschriebenen 96-Well-Plattenformate ^1,3-5. Mit einem einzigen Liquidationd Handling-Roboter ermöglicht diese Methode ein Forscher leicht über einen Bereich von acht und vier Konzentrationen von MHC-II-Allel Arten in weniger als 48 Stunden zu analysieren etwa neunzig Testpeptide in dreifacher Ausfertigung. Dieser Artikel beschreibt die Einrichtung eines 384-Well-ELISA-Platte für die Analyse von sieben experimentellen Peptide gegen einen MHC-II-Allel, aber Tabellenkalkulation Taschenrechner werden als ergänzendes Material zur Verfügung gestellt, um so leicht zu skalieren das Experiment auf eine beliebige Anzahl von gewünschten Peptide und / oder MHC II-Molekülen.

Vier Hauptaktivitäten umfassen die Peptid-MHC-II-Bindungsassay: 1-Bindung: Test-Peptide konkurrieren mit markierten Kontrollpeptide für Lösungsphase Bindung von löslichen MHC-II-Proteine. Die Bindung ist über einen weiten Bereich von Test-Peptid-Konzentrationen gemessen. 2-Aufnahme: Nach der Bindungsreaktion nähert Gleichgewicht befindet, Peptid-MHC-II-Komplexe erfasst und von ungebundenem Peptid-und Protein durch konformationsabhängiger Anerkennung mit einem immobilisierten Antikörper getrennt. 3-Detektion: Eingefangen Kontrollpeptid wird quantitativ unter Verwendung der zeitaufgelösten Fluoreszenz detektiert. 4-Analyse: Spektroskopische Daten verarbeitet, aufgezeichnet und analysiert, um eine dosisabhängige Bindungseigenschaften von Testpeptid und MHC-II-Proteine ​​zu bestimmen.

Bei verschiedenen Schritten in dem nachstehend beschriebenen Verfahren ist die Verwendung eines Flüssigkeitshandhabungsroboter zu empfehlen, wenn eine verfügbar ist. Gerade in einer 384-Well-Format, automatische Dosierung und Verdünnung von Flüssigkeiten minimiert Benutzerfehler, führt zu mehrkonsistente wohl gut Volumen und liefert schmaler 95%-Konfidenzintervalle für die IC _50-Werte im Vergleich zur manuellen 96-Well-Assays (Daten nicht gezeigt). Wenn ein flüssiges Handhabungsroboters nicht verfügbar ist, die Schritte mit "(Flüssigkeitshandhabungsroboter)" anno kann von Hand erfolgen. Ebenso, wenn möglich, eine automatisierte Plattenwäscher, die mit der 384-Well-Format kompatibel ist, wird empfohlen. Diese standardisiert effektiv die Platte Waschprozess. Wenn eine Plattenwasch nicht verfügbar ist, die Schritte mit "(Plattenwasch)" kommentierte kann von Hand gemacht werden.

1. Bestreichen Sie die ELISA-Platte (Tag 1)

1. Verdünnen L243 Antikörper Lager (0,5 mg / ml) in Boratpuffer auf eine Arbeitskonzentration von 10 ug / ml.
   1. Zur Beschichtung eines einzigen 384-Well-Platte, 200 ul Lager Antikörper auf 9,8 ml Boratpuffer. (Siehe ergänzende Tabellenkalkulationsrechner für alternative Skalierung).
2. Werden 25 ul der L243-Antikörper-Lösung in jede Vertiefung einer 384-Well hohe Bindungs ​​weiß ELISA-Platte. (Liquid-Handling-Roboter)
3. Verschließen Sie die Platte mit einer Polyesterfolie und Inkubation über Nacht bei 4 ° C
   Hinweis: Jeder 384-Well-ELISA-Platte können bis zu 15 Testpeptide an acht Verdünnungen für ein MHC-II-Allele sowie die positive und negative Kontrollen unterzubringen. Dies wird letztlich ergeben Dreifachmessungen.

2. Machen Sie den Test-Peptid-Verdünnungen (Tag 1)

1. Ausgehend von einer 10 mM Stamm jeder Test Peptid in DMSO, machen den folgenden Verdünnungsreihe in Citrat-Phosphat-Puffer mit 384-Well-Polypropylenplatten (Tabelle 1). (Liquid-Handling-Roboter)
   Hinweis: Eine vollständige 384-Well-Polypropylenplatte erfordert drei separate ELISA-Platten. Ein Drittel einer Polypropylenplatte wird nur eine ELISA-Platte (Abb. 1) setzen.

Tabelle 1. Herstellung der Testpeptidverdünnungsreihe.

Abbildung 1. Platte Karte von Peptid-Bindungsassay. (A) Karte der Peptidverdünnungen in Polypropylen-384-Well-Platten. Jeder Polypropylenplatte können drei Gruppen von 15 Peptiden in Wettbewerb Bindungsreaktionen gegen einen singen aufnehmen le MHC-II-Allel. (B) Nach der Bindungsreaktion Gleichgewicht nähert, ist jede Peptidgruppe übertragen werden, in dreifacher Ausfertigung an einen separaten 384-Well-ELISA-Platte, die mit anti-MHC-II-Antikörper schwemmt wurde.

3. Bereiten Sie die MHC-II-Master-Mix (Tag 1)

1. Machen Sie das Reaktionspuffer
   1. Hinzufügen von 80 &mgr; l 1 mM Pefa Block und 60 mg Octyl-β-D-glucopyranaside zu 3.920 ul Citratpuffer. (Siehe ergänzende Tabellenkalkulationsrechner für alternative Skalierung).
2. Verdünnen Sie ausgewählt MHC-II-Stammlösungen bis 101 nM in Reaktionspuffer mit einem 15 ml konischen Röhrchen (Tabelle 2).
   Hinweis: MHC-II-Konzentration wird letztlich 50 nM in der Bindungsreaktion und 25 nM in der neutralisierten ELISA-Test. Die MHC-II-Lager Konzentrationen je nach Hersteller variieren Losnummer. (Siehe ergänzende Tabellenkalkulationsrechner).

Tabelle 2. Herstellung von MHC-II-Master-Mix.

4. Bereiten Sie die Negativ-und Positivkontrollen (Tag 1)

1. In 21,5 ul Citratphosphatpuffer auf die "Negativkontrolle" sowie des 384-Well-Polypropylenplatte aus Schritt 2.1 (Abbildung 1A).
2. In 21,5 ul Citratphosphatpuffer auf die "Positivkontrolle" sowie des 384-Well-Polypropylenplatte.
   Hinweis: Die "Positiontive Kontrolle "wird in Abschnitt 5 abgeschlossen sein.
3. Entfernen 49,5 ul des MHC II-Master-Mix aus Schritt 3.2 und einer Pipette in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
4. In 0,5 ul Citratpuffer zu den 49,5 ul der MHC-II-Master-Mix aus Schritt 4.3.
5. In 21,5 ul der Konzentration eingestellt MHC-II-Master-Mix aus Schritt 4.4 in die "Negativkontrolle" sowie des 384-Well-Polypropylenplatte (Abbildung 1A).
   Hinweis: Dieses Beispiel steht für die Null-Signal negativ Kontrolle, die MHC-II-Protein, keine Kontrolle Peptid und kein Test-Peptid.

5. Fügen Sie die entsprechenden Control Peptide an das MHC-II-Master-Mix (Tag 1)

* Wir empfehlen die 10-mg-Maßstab für die Wirtschaft.
Tabelle 3. Steuer Peptide für verschiedene MHC-II-Allele. *

1. Verdünnen Sie die Kontrollpeptid (bei 400 uM in DMSO gespeichert) 1:20 frischen DMSO, um eine verdünnte Lager bei 20 uM ergeben.
   1. In 25 ul 400 uM Kontrollpeptid zu475 ul DMSO. Hinweis: Dies ist ein großer Überschuß, sondern ermöglicht präzises Handling von viskosen DMSO-Lösungen.
2. Weiter verdünnt das Control Peptide aus Schritt 5.1 (20 mM), 1:100 in den MHC II-Master-Mix aus Schritt 3.2.
   1. In 28,8 ul Control Peptide in Schritt 5.2 auf die verbleibenden 2,850.5 ul der MHC-II-Master Mix verdünnt.
3. In 21,5 ul der MHC-II-Master-Mix mit Kontrollpeptid (Schritt 5.2) mit der positiven Kontrolle sowie der 384-Well-Polypropylenplatte (Schritt 4.2) (Abbildung 1A). Hinweis: Dieses Beispiel stellt die High-Signal positive Kontrolle mit MHC-II-Protein-, Steuer-Peptid und kein Test-Peptid.

6. Stellen Sie die Bindungsreaktion (Tag 1)

1. Hinzufügen des MHC II-Master-Mix, enthaltend Control Peptide (Schritt 5.2), um jede der Testpeptidverdünnungen (Schritt 2.1) im Verhältnis 1:1, um die Bindungsreaktion zu erzeugen.
   1. In 21,5 ul von MHC-II-Master-Mix enthält Control Peptid aus Schritt 5,2-21,5 ul jeder Testpeptid Verdünnung von Schritt 2.1. (Liquid-Handling-Roboter)
2. Siegel der Bindungsreaktion mit einer Polyesterfolie und inkubieren 24.12 h in einem Nicht-CO _2-gesteuerte Brutschrank bei 37 ° C ohne Schütteln.

7. Neutralisieren und Transfer der Bindungsreaktion (Tag 2)

1. Nehmen Sie die 384-Well-Polypropylenplatte, die die Bindungsreaktion (Schritt 6.2) aus der 37 ° C-Inkubator.
2. Verdünnen Sie die Bindungsreaktion 1:1 mit Neutralisierungspuffer. (Liquid-Handling-Roboter)
   1. In 43 ul der Neutralisationspuffer in jede Bindungsreaktion gut.
3. Entfernen Sie die ELISA-Platte (Schritt 1.3) von 4 ° C zu waschen und 3x mit 60 ml / Vertiefung PBS-Tween 20 0,05%. (Plattenscheibe)
4. Übertragungs 25 ul jeder neutralisiert Bindungsreaktion aus Schritt 7.2 in dreifachen Vertiefungen der Antikörper-beschichteten 384-Well-ELISA-Platte aus Schritt 7.3. (Fig. 1
5. Decken Sie die ELISA-Platte mit einer Polyesterfolie und in einem 37 ° C-Inkubator für 2,5 h oder in einer 4 ° C Kühlschrank über Nacht.

8. ELISA-Entwicklung (Tag 2 und 3)

1. Entfernen Sie die ELISA-Platte aus Schritt 7.5, 3 x waschen mit 60 ul / Vertiefung PBS-Tween 0,05%. (Plattenscheibe)
2. Verdünnen Streptavidin-Europium-Stammlösung (0,1 mg / ml Streptavidin, 7 Eu ^{3 +} / Streptavidin) 1000-fach in der DELFIA Assay Buffer.
   1. Für ein 384-Well-Platte, verdünnte 10 ul Streptavidin-Europium in 10 ml Assay-Puffer.
3. In 25 ul der verdünnten Streptavidin-Europium in jede Vertiefung des 384-Well-ELISA-Platte aus Schritt 8.1. (Liquid-Handling-Roboter)
4. Die Platte mit einer Polyesterfolie und in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Hinweis: Während der 1-stündigen Inkubation, entfernen Sie die Enhancement-Lösung aus dem Kühlschrank und auf ro beiseite 10 ml / Platte in der Dunkelheitom Temperatur.
5. Nach der 1-stündigen Inkubation, waschen Sie die 384-Well-ELISA-Platte aus Schritt 8.3 3x mit 60 ul / Vertiefung PBS-Tween 0,05%. (Plattenscheibe)
6. In 25 ul Enhancement Solution in jedes Well der 384-Well-ELISA-Platte aus Schritt 8.5. (Liquid-Handling-Roboter)
7. Decken Sie die 384-Well-ELISA-Platte mit einer Polyesterfolie und damit die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10-15 min zu sitzen.
8. Nach 10-15 min Inkubation, lesen die Fluoreszenz des 384-Well-ELISA-Platte aus Schritt 8.7 mit einem zeitaufgelöste Fluoreszenz-Plattenlesegerät mit Europium Einstellungen (z. B. Start-Int: 200, Stopp Int. 1.000, Ex 340, Em . 615 Cutoff: Keine, PMT: Auto, Reads / Well: 50).

9. Datenanalyse

1. Eingabe von Daten in XY-Format Graph mit 3 Wiederholungswerten in Seite-an-Seite-Spalten (X = Testpeptidkonzentration, Y = Fluoreszenzmessung).
2. Melden Sie verwandeln die X-Werte für alle Daten: X = log (X)
3. Setzen Sie die Log-transformed Daten mit dem ein-Ort-kompetitiver Bindungsmodell, um die IC _50-Wert zu extrahieren.
4. Beschränken Sie den unteren Wert für den durchschnittlichen negativen Steuerwert.
5. Weltweit passen die Top-Wert und sicherzustellen, dass die globalen Parameter Passform unterhalb oder gleich der positiven Kontrolle.

Die reife Peptidsequenz von Enterobacter cloacae P99 beta-Lactamase (BLA) (Genbank ID # X07274.1) wurde mit ProPred 16 mutmaßliche Peptid Bindemittel MHC II-Allel DRB1 * 1501 (Tabelle 4) analysiert. ProPred identifiziert 117 Nonamer Peptide mit einer obligatorischen P1 Ankerrest (dh ein M, L, I, V, W, Y oder W an Position 1, die für MHC-II erforderlich ist verbindlich 31). Bei einer Schwelle von 5%, Peptide nur mit Werten größer oder gleich 2,6 sind wahrscheinlich Bindemitteln. So, an der 5%-Schwelle, nur die Top-11-Peptide vorhergesagt, MHC-II-DRB1 * 1501 binden.

Tabelle 4. Unschlagbare ProPred Vorhersagen für BLA Peptiden und MHC-II-Allel DRB1 * 1501.

Eine repräsentative Gruppe von vorhergesagten Epitopes wurde für die Analyse in unserem MHC-II-Bindungstest (Tabelle 4, fett Einträge) ausgewählt. BLA Peptidfragmente von fünfzehn Rückstände wurden chemisch synthetisiert, dass Nonamers putative MHC-II-Epitope wurden innerhalb der synthetischen Proteinfragmente eingebettet. Während die MHC-II-Bindungsfurche selbst beherbergt nur neun Aminosäuren, deutet einiges darauf hin, dass flankierende Sequenzen können Peptid-MHC-II-Wechselwirkungen beeinflussen und synthetische Peptide von 15-20 Rückstände sind daher üblicherweise verwendeten 15. Um die Komplexität der überlappende Epitope, die in biologisch verarbeitet Proteinfragmente auftreten könnten, repräsentieren, haben wir getestet, synthetische Sequenzen, die (i) Einzelvorhergesagt Bindemittel, (ii) Einzel nonbinders vorhergesagt, (iii) mehrere vorhergesagt Bindemittel, (iv) mehrere vorhergesagt nonbinders enthalten, oder (v) eine Mischung aus Bindemittel und vorhergesagten nonbinders (Tabellen 4 und 5).

Tabelle 5. Liste der chemisch synthetisierten Peptide.

Die Fähigkeit dieser synthetischen Peptide mit der biotinylierten MBP-B-Kontrollpeptid (Tabelle 3) für die Bindung an MHC-II-DRB1 * 1501 konkurrieren wurde wie in dem oben beschriebenen Protokoll untersucht. Kompetitive Bindungskurven für die synthetischen Peptide sind in Fig. 2 gezeigt. IC 50-Werte wurden durch Anpassen der log-transformierten Daten mit der one-site kompetitiven Bindungs, nichtlinearen Fitfunktion von Prism (Tabelle 6) berechnet. Wie in Fig. 2 zu sehen ist, die Peptide natürlich in drei Gruppen unterteilen: starke Bindemittel mit IC 50 <1 &mgr; M (Peptide 2 und 10), eine moderate Bindemittel mit 1 &mgr; M ≤ IC 50 <100 uM (Peptide 4, 9, 11 und 24 ); schwach Bindemittel mit IC 50 ≥ 100 μ, M (Peptid 31).

Abbildung 2. Wettbewerbsbindungskurve von BLA Peptiden für die MHC-II-Allel DRB1 * 1501. Enge Bindemittel sind fit mit orangefarbenen Linien, moderate Bindemittel grünen Linien, und dem schwachen Bindemittel ein kastanienbraune Linie.

Tabelle 6. Berechnete IC 50-Werte von BLA Peptidfragmente für DRB1 * 1501.

Leonard ist von Moise beschäftigt und hält Aktienoptionen in EpiVax, Inc., ein privat geführtes Biotechnologie-Unternehmen in Providence, RI entfernt. Die Arbeit in diesem Forschungsbericht enthalten ist, ist frei von jeglicher Voreingenommenheit, die mit der kommerziellen Ziele des Unternehmens in Verbindung gebracht werden könnten.