Mit Hilfe eines α-Bungarotoxin Binding Site Tag an GABA A-Rezeptor-Membranlokalisierung und Handel Studieren

Zusammenfassung

Hier zeigen wir die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff Alexa gekoppelt α-Bungarotoxin an GABA A-Rezeptor-Oberflächenlokalisierung und Endozytose in hippocampalen Neuronen zu messen. Durch die Verwendung von Konstrukten, die mit einem kurzen extrazellulären Tag, das α-Bungarotoxin, kann die Analyse der Plasma-Membran-Protein endozytischen Handel erreicht werden, bindet.

Zusammenfassung

Es wird zunehmend deutlich, dass Neurotransmitter-Rezeptoren, einschließlich ionotropen GABA A-Rezeptoren (GABAAR), Ausstellungshochdynamischen Handel und Zelloberfläche Mobilität ^7.1. Rezeptorzelloberflächenlokalisierung und Endozytose zu untersuchen, die hier beschriebenen Verfahren kombiniert die Verwendung von Fluoreszenz-α-Bungarotoxin-Zellen, die mit Konstrukten, die eine α-Bungarotoxin (Bgt) Bindungsstelle (BBS). Die BBS (WRYYESSLEPYPD) an der α-Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors Muskeln, die mit hoher Affinität Bgt ^8,9 bindet. Einbau des BBS-Website ermöglicht Fläche Lokalisierung und Messung von Rezeptor Einsetzen oder Entfernen mit Applikation exogener Fluoreszenz Bgt, wie zuvor in der Verfolgung von GABAA-und GABAB-Rezeptoren ^2,10 metabo beschrieben. Neben der BBS-Website, die zwischen den Aminosäuren 4 und 5 des reifen GABAAR Untereinheit durch Standard m eingesetzt wir eine pH-sensitive GFP (pHGFP ¹¹⁾olecular Biologie und PCR-Klonierung Strategien (siehe Abbildung 1) ^12. Die BBS ist 3 'der pH-sensitive GFP-Reporters durch ein 13-Aminosäure Alanin / Prolin-Linker getrennt ist. Für Handel in dieser Veröffentlichung, die auf festen Proben basieren beschriebenen Studien, die pHGFP dient als ein Reporter der Gesamt getaggt GABAAR Untereinheit Protein-Ebene, so dass eine Normalisierung der Bgt markierten Rezeptor Bevölkerung insgesamt Rezeptor Bevölkerung. Dies minimiert Zelle zu Bgt Färbung Signalvariabilität von höheren oder niedrigeren Ausgangs Ausdruck der markierten Untereinheiten GABAAR resultierende Zell. Außerdem die pHGFP Tag ermöglicht eine einfache Identifizierung der Konstrukt exprimierenden Zellen für Live-oder Fest Imaging Experimenten.

Einleitung

Die Verwendung von fluoreszenz gekoppelt α-Bungarotoxin Rezeptor Lokalisation und Dynamik zu studieren wurde in Studien der Nikotinacetylcholinrezeptor ^13-15, endogenen Ziel des Toxins Pionierarbeit geleistet. Anschließend Einbau des minimalen Bgt bindende Peptid (BBS) wurde genutzt, um Menschenhandel beider erregenden und hemmenden Liganden-gesteuerte Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ^2,10,16-21 studieren. Das BBS-basierte Technik bietet Vorteile gegenüber anderen Ansätzen für den Menschenhandel Studien wie Oberflächen Biotinylierung Methoden, Antikörpermarkierung von lebenden Zellen mit Antikörpern gegen die extrazelluläre Epito....

Protokoll

Alle unten beschriebenen Protokolle sind in Übereinstimmung mit der IACUC und IRB Institutional Review Boards der University of Pittsburgh School of Medicine.

1. Vorbereitung der Hippocampus Neuronale Kulturen in Gewebekultur Hood

Hinweis: Verwenden steriler Technik und Reagenzien während Protokoll 1.

1. Vorbereitung Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml in H ₂ O) beschichteten Deckgläsern als Substrat für die neuronale Kultur.
   1. Zeigen 4-5 runden Glasdeckgläschen in jedem 3,5 cm Gewebekulturschale.
   2. Punkt 70 ul Poly-D-Lysin auf jede 12 mm Deckglas. Hinweis: Für die Live-Aufnahmen, ein Glasboden 3,5-cm-Geweb....

Ergebnisse

Charakterisierung eines BBS tagged Konstrukt wichtigen Elemente wie die Bestimmung, ob das exprimierte Protein korrekt assembliert (insbesondere Rezeptoren von mehreren Untereinheiten zusammengesetzt), Verkehre auf der Zelloberfläche lokalisiert und geeignet. Hemmende Synapsen von GABA A-Rezeptor-Cluster, die Oberfläche mit der inhibitorischen Gerüstprotein Gephyrin colokalisieren und an präsynaptischen inhibitorischen Terminals, durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter, die GABA und Glycin in synapti.......

Diskussion

Die hier beschriebenen BBS Basis fest und Live-Techniken können verwendet werden, um Rezeptor oder anderen Plasmamembranprotein Handel in Zelllinien, Neuronen und anderen primären Zellen zu verfolgen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Membran Einsetzen und Entfernen der Liganden-gesteuerte Ionenkanäle und GPCR untersuchen und Veränderungen in den Handel zu beurteilen aufgrund der Gegenwart der Rezeptor-Agonisten und Modulatoren. Schwerpunkte sind entsprechende Lokalisierung der Tag, um eine extrazelluläre Lage und de.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
P3 Primärzelle 4D-Bausatz	Lonza	V4XP-3024
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 konjugierte	molekulare Sonden	B35450
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 konjugierte	molekulare Sonden	B13422
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 konjugierte	molekulare Sonden	B13423
(+)-Tubocurarinchlorid	Tocris	2820
Einbettmedium	DAKO	cS703
DPBS ohne Calcium, Magnesium	Invitrogen	14190-136
Poly-D-Lysin	Sigma	P6407
Gephyrin Antikörper	Synaptic Systems	147 011	1:300
VIAAT/VGAT Antikörper	Synaptic Systems	131 002	1:1.000
anti GFP	Life Technologies	A6455	1:2.000
Gewebekulturschale mit Glasboden	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes
Deckgläser (rundes Deckglas), #1 Dicke, 12 mm	Warner Instruments	640-0702