Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Summary

Die Befestigung von Virionen an einer Oberfläche ist eine Voraussetzung für eine einzelne Virionen-Bildgebung durch Super-Resolution Fluoreszenz-Bildgebung oder Atomkraftmikroskopie (AFM). Hier zeigen wir ein Probenvorbereitungsverfahren zur kontrollierten Haftung von Virionen auf Glasoberflächen, die für den Einsatz in AFM und Super-Auflösungfluoreszenz-Bildgebung geeignet sind.

Abstract

Die Immobilisierung von Virionen auf Glasoberflächen ist ein entscheidender Schritt in der Einzelvirionen-Bildgebung. Hier stellen wir eine Technik vor, die aus einzelmolekül-Bildgebungs-Assays übernommen wird, die die Haftung einzelner Virionen auf Glasoberflächen mit Spezifität ermöglicht. Diese Zubereitung basiert auf der Veredelung der Glasoberfläche mit einer Mischung aus PLL-g-PEG und PLL-g-PEG-Biotin, der Zugabe einer Avidinschicht und schließlich der Bildung von Virionankern durch Anhaftung biotinylierter virusspezifischer Antikörper. Wir haben diese Technik in einer Reihe von Experimenten angewendet, einschließlich der Atomkraftmikroskopie (AFM) und der superauflösenden Fluoreszenz-Bildgebung. Diese Probenvorbereitungsmethode führt zu einer Kontrollhaftung der Virionen an der Oberfläche.

Introduction

Ladungsbasierte unspezifische Wechselwirkungen werden routinemäßig zur Adhäsion von Virionen in der Atomkraftmikroskopie^1,2verwendet. Diese Techniken funktionieren besonders gut, wenn sie auf nicht umhüllten Virionen mit sehr steifen Kapsids^3-6verwendet werden. Obwohl diese Techniken sehr effektiv bei der Immobilisierung der Probe sind, verhindern sie nicht die unspezifische Bindung von Proteinen an die Oberfläche. Die unspezifische Bindung kann ein Problem verursachen, wenn versucht wird, Virionen mit AFM und super-Resolution-Fluoreszenztechniken abzubilden, die Inkubationen der Probe mit verschiedenen Antikörpern erfordern. Hier skizzieren wir eine Beispielvorbereitungsmethode für die spezifische Immobilisierung von Virions.

Poly(Ethylenglykol) (PEG) mit Poly(L-Lysin) (PLL) veredelt und auf eine Glasoberfläche adsorbiert stellt einen signifikanten Block für die elektrostatischen Wechselwirkungen von Proteinen mit Glas⁷. Einzelmolekül-Assays, die eine Immobilisierung einzelner Moleküle auf Glasoberflächen erfordern, haben diese Eigenschaft genutzt und sie verwendet, um eine spezifische PEG-basierte Einzelmolekül-Immobilisierungstechnik^8-10zu erstellen. Dieses Präparat wurde auch verwendet, um Clathrinkäfige auf die Glasoberfläche¹¹ zu immobilisieren sowie eine homogene Fibronectin-Beschichtung für die Kontrollzellhaftung ¹²zu schaffen.

Wir haben das Probenvorbereitungsverfahren auf DerGrundlage der PLL-g-PEG-Adsorption auf Glasoberflächen aus bildgebenden Methoden für einzelne Moleküle übernommen und auf bildgebende Einzelvirionen des vesikulären Stomatitisvirus (VSV) angewendet. Diese einzelnen Virionen wurden mit Hilfe der Atomkraftmikroskopie (AFM) abgebildet. Ähnliche Experimente wurden auch an funktionalisierten Perlen als Kontrolle durchgeführt. Die Virionen wurden auch durch superhochauflösende Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, wenn ein VSV-G-Antikörper mit Alexa 647 beschriftet wurde, um ein Bild der Umhüllung einzelner Virionen zu erstellen. Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung nutzt die Lokalisierung einzelner Moleküle, um ein Bild^13-15zu erstellen. fPALM bi-planare Bildgebung ermöglicht die Lokalisierung einzelner Moleküle mit 20 nm in der Ebene und 50 nm Auflösung entlang der optischen Achse^15,16. Diese biplanare Technik wurde verwendet, um in dieser Studie enthaltene fluoreszierende Bilder mit superauflösung abzubilden. Eine alternative Technik, die ähnliche Ergebnisse hat, ist STORM^13,17,18.

Sowohl AFM als auch superhochauflösende fluoreszierende Bilder von VSV, die durch die in diesem Papier beschriebenen Verfahren am Glas verankert sind, zeigten eine spezifische Bindung von Virionen an das Glas mit minimalen unspezifischen Wechselwirkungen¹⁹. Hier stellen wir die Probenvorbereitungsprotokolle für die AFM- und super-resolution fluoreszierenden Bildgebungsexperimente vor. Kurz gesagt: Saubere Glasabdeckungen werden funktionalisiert, indem eine Mischung aus PLL-g-PEG und PLL-g-PEG-Biotin adsorbiert wird. Es ist typisch für diesen dünnen Film, der entwickelt werden kann, um zwischen 15-25% funktionalisiertes Biotin auf einer beschichteten Oberfläche zu liefern. Die Coverlips werden weiter mit tetramerischem Avidin inkubiert. Ein biotinylierter viraler Antikörper wird dann verwendet, um eine einzigartige Bindungsstelle für die Virionen zu schaffen. Die Bindung des Antikörpers kann auf zwei Arten erfolgen.

Die erste Methode ist für AFM optimiert, bleibt jedoch für die Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung geeignet. Bei diesem Verfahren wird die avidinbeschichtete Oberfläche vor der viralen Adhäsion mit biotinylierten Antikörpern behandelt. Die immobilisierten Virionen werden mit Alexa 647-beschrifteten Antikörpern behandelt, um die Hülle zu bedecken und eine superhochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung der Virionen zu ermöglichen.

Die zweite Methode besteht darin, das Virus in Lösung mit dem biotinylierten Antikörper und dem von Alexa 647 markierten Antikörper anzugreifen, bevor die Viren an der mit Avidin behandelten Oberfläche haften; Diese Methode ist für superauflösende Fluoreszenz-Bildgebungsexperimente optimiert, bei denen die Wiederherstellung der viralen Hülle wichtig ist. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass eine gleichmäßige Antikörperbeschichtung auf der viralen Oberfläche möglich ist. Der biotinylierte Antikörper kann mit Alexa 647 als virale Antikörper in Verhältnissen vermischt werden, die eine ausreichende Adsorption des Virus auf die mit Avidin behandelte Oberfläche ermöglichen und gleichzeitig eine hohe Konzentration an fluoreszierendem Etikett an der Außenseite der viralen Hülle beibehalten. Diese Alexa 647 markierten viralen Antikörper sind nicht biotinyliert und ihr Überschuss kann wegspült werden, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren.

Protocol

1. Chemievorbereitung

1. Zubereitung und Lagerung von PLL-g-PEG-Biotin und Avidin:
   1. Lösen Sie das Polymer PLL-g-PEG-Biotin im PBS-Puffer gemäß Herstellerangaben in einer Konzentration von 1,0 mg/ml auf.
   2. Aliquot nach Deckblattgröße (siehe Tabelle 1) und bis zu einem Jahr bei -80 °C lagern.
2. Zubereitung und Lagerung von Avidin/NeutrAvidin
   1. Lösen Sie das unbeschriftete Avidin/NeutrAvidin in PBS-Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers in einer Konzentration von 1,0 mg/ml auf.
   2. Aliquot nach Deckblattgröße (siehe Tabelle 1) und bis zu 3 Jahre bei -20 °C lagern.
3. Virusprobenvorbereitung: Bereiten Sie Virusproben nach experimentellem Bedarf und Laborprotokoll vor diesem Test vor. Verwenden Sie Schritt 1.3.1 für Methode 5A oder 1.3.2 für Methode 5B.
   1. Bereiten Sie Virusproben für Methode 5A vor Stufe 2 vor. Verwenden Sie vorbereitete Virusproben innerhalb von 1-2 Tagen nach der Zubereitung oder aliquot nach Deckblattgröße (siehe Tabelle 1), dann blitzen Sie in flüssigem Stickstoff einfrieren und lagern Sie bei -80 °C für bis zu einem Jahr. Wenn aufgetaut, sofort verwenden.
   2. Bereiten Sie Virusproben für Methode 5B ähnlich 1.3.1 vor. Aliquots des Virus vor 5B auftauen und bei 4 °C nicht mehr als 24 Stunden vor dem Mischen mit Antikörpern aufbewahren.
4. Bereiten Sie geeignete biotinylierte Antikörper für das Experiment vor.

2. Coverslip Cleaning in Vorbereitung auf chemische Behandlung

1. Legen Sie Deckellipsen in ein entsprechend großes Teflon-Abdeckungstuch, das sie in vertikaler Ausrichtung hält, und tauchen Sie sie in einen Becher, der mit gefiltertem (0,2 m) Ethylalkohol (190 Proof) gefüllt ist.
2. Beschallen Sie die Deckellipsen im gefilterten Ethylalkohol (190 Proof) für 30 min.
3. Entfernen Sie Dielips von Alkohol und spülen Sie Dielips ausgiebig mit Reinstwasser aus.
4. Spüldeckel in ein separates sauberes Teflon-Rack und Becher mit 1 M NaOH füllen.
5. Sonicate die Abdeckungen in der 1 M NaOH für 30 min.
6. Entfernen Sie Dielips von NaOH und spülen Sie sie ausgiebig mit Reinstwasser ab.
7. Die abspülten Abdeckungen mit einem Stickstoffstrom trocknen und in ein sauberes, trockenes Teflon-Rack geben.
8. Prüfen Sie die Abdeckungen auf sichtbare Folien oder Partikel, die auf dem Abdeckzettel verbleiben. Wenn sichtbares Material verbleibt, wurde der Deckelrutsch nicht ordnungsgemäß gereinigt und gespült. Wenn nicht richtig gereinigt wiederholen Schritte 2.1-2.7.
9. Reinigen Sie die Abdeckungen mit Sauerstoff-Plasma für 2 min. Dieser Schritt ist optional, wird jedoch empfohlen.

3. Bildung der PLL-g-PEG Dünnschicht

1. Unmittelbar nach dem Trocknen im Stickstoffstrom (oder dem optionalen Sauerstoffplasma) einen Deckelrutsch horizontal in eine sterile Petrischale legen. Pipetten in der Mitte des Deckelsrutschen eine entsprechende Menge an aufgetauten PBS gepuffert PLL-g-PEG-Biotin (siehe Tabelle 1).
2. Legen Sie einen weiteren gereinigten Deckelrutsch auf die Flüssigkeit in einem Sandwich-Verfahren. Beachten Sie, dass diese Methode darin besteht, dass zwei Decklippen ihre chemischen Folien inkubieren, indem sie ihre chemisch behandelten "aktiven Gesichter" aufeinander ausrichten, die nur durch die aktuelle chemische Schicht getrennt sind. Stellen Sie sicher, dass genügend Flüssigkeit vorhanden ist, so dass das Volumen zwischen den beiden Abdeckungen vollständig mit Flüssigkeit gefüllt ist, aber keine Flüssigkeit zwischen den Abdeckungen austritt (siehe Tabelle 1). Das "aktive Gesicht" bezeichnet fortan deckfeste Flächen, die in der Sandwichkonfiguration mit der Flüssigkeit in Berührung gekommen sind.
3. Legen Sie den Deckel der Petrischale über das Coverslip-Sandwich und brüten Sie bei RT für 45-60 min.
4. Entfernen Sie den Deckel der Petrischale und nehmen Sie das Sandwich mit einer Pinzette auf. Achten Sie darauf, überschüssige Flüssigkeit nicht herauszukneifen. Verwenden Sie Daumen und Zeigefinger, um das Sandwich leicht zu kneifen und schieben Sie die Abdeckungen in entgegengesetzte Richtungen horizontal in Bezug auf einander, dann trennen Sie die beiden Abdeckungen voneinander, ohne die aktiven Gesichter zu berühren.
5. Spülen Sie beide aktiven Gesichter mit reinstem Wasser, indem Sie 25 ml Reinstwasser über das aktive Gesicht 2-4x pfeifen, und trocknen Sie dann die Abdeckungen mit einem Stickstoffstrom. Achten Sie darauf, zu beachten, welche Deckslipflächen aktiv sind.
6. Verwenden Sie die Abdeckungen sofort, oder lagern Sie O/N mit der aktiven Face-up in einer sterilen Petrischale in einer staubfreien Umgebung mit niedriger Luftfeuchtigkeit platziert.

4. Avidin-Bindungsverbesserung

1. Legen Sie einen PLL-g-PEG behandelten Deckel mit aktivem Gesicht nach oben in eine sterile Petrischale.
2. Pipette eine angemessene Menge an aufgetautem Avidin im Puffer (in Schritt 1.2) auf die Mitte der aktiven Fläche vorbereitet.
3. Legen Sie einen weiteren Coverslip (aktives Gesicht nach unten) auf die Flüssigkeit in der Sandwich-Methode. Beachten Sie die aktive Fläche der Abdeckungen. Es ist wichtig, dass die aktiven Gesichter während der Inkubation mit der Flüssigkeit in Kontakt sind (siehe Schritt 3.2).
4. Legen Sie den Deckel der Petrischale über das Coverslip-Sandwich und brüten Sie bei RT für 25-30 min.
5. Entfernen Sie den Petrischalendeckel und trennen Sie die beiden Abdeckungen, wie in Schritt 3.4 beschrieben, und achten Sie darauf, die aktiven Gesichter zu verfolgen und nicht zu berühren.
6. Spülen Sie beide aktiven Gesichter mit Reinstwasser, indem Sie 25 ml Reinstwasser über das aktive Gesicht 2-4x pfeifen und dann die Abdeckungen mit einem Stickstoffstrom trocknen. Beachten Sie die aktive Fläche der Abdeckungen. Verwenden Sie sofort für die nächste Stufe.

WICHTIG: Es gibt zwei verschiedene Methoden zur Durchführung der Probenvorbereitung, abhängig von der Art des Assays, den das Experiment mit sich bringt. Der Experimentator sollte mit der Stufe 5A fortfahren, in der das Virus im Glas verankert ist, bevor eine zusätzliche Antikörperbehandlung hinzugefügt wird, die für die Hochauflösende Bildgebung erforderlich ist. 5B beschreibt eine alternative Methode, um das Virus in lösungsweise zu kennzeichnen, bevor es im Glas verankert wird. Die repräsentativen Daten in diesem Manuskript werden mit 5A erstellt. Eine geeignete Methode sollte nach experimentellem Assay-Typ ausgewählt werden.

5A. Aktiver Gesichtsantikörper Tether

1. Unmittelbar nach dem Trocknen mit einem Stickstoffstrom in Stufe 4.6 einen mit Avidin behandelten Coverslip aktiv nach oben in eine sterile Petrischale geben.
2. Pipette eine angemessene Menge an aufgetauten biotinylierten Antikörpern im Puffer auf die Mitte des aktiven Gesichts (siehe Tabelle 1).
3. Legen Sie einen weiteren Coverslip (aktives Gesicht nach unten) auf die Flüssigkeit in einer Sandwich-Methode. Beachten Sie die aktive Fläche der Abdeckungen, es ist wichtig, dass die aktiven Flächen in Kontakt mit der Flüssigkeit für die Inkubation sind (siehe Schritt 3.2.).
4. Legen Sie den Deckel der Petrischale über das Coverslip-Sandwich und brüten Sie bei RT für 45-60 min.
5. Entfernen Sie den Petrischalendeckel und trennen Sie die beiden Abdeckungen, wie in Schritt 3.4 beschrieben, und achten Sie darauf, die aktiven Gesichter zu verfolgen und nicht zu berühren.
6. Spülen Sie beide aktiven Gesichter mit PBS durch Pipettieren 25 ml PBS über die aktive Fläche 2-4x, nicht trocknen und sofort verwenden. Achten Sie darauf, nachzuverfolgen, welche Coverslip-Flächen aktiv sind.
7. Legen Sie einen Antikörper behandelt Abdeckung aktiv nach oben in eine sterile Petrischale, und Pipette eine entsprechende Menge an aufgetauten Virus in Puffer auf die Mitte des aktiven Gesichts.
8. Legen Sie einen weiteren Coverslip (aktives Gesicht nach unten) auf die Flüssigkeit in einer Sandwich-Methode. Beachten Sie die aktive Fläche, da es wichtig ist, dass die aktiven Flächen mit der Flüssigkeit zur Inkubation in Kontakt sind (siehe Schritt 3.2.).
9. Legen Sie den Deckel der Petrischale über das Coverslip-Sandwich und brüten Sie bei RT für 45-60 min.
10. Entfernen Sie den Petrischalendeckel und trennen Sie die beiden Abdeckungen, wie in Schritt 3.4 beschrieben, und achten Sie darauf, die aktiven Gesichter zu verfolgen und nicht zu berühren.
11. Spülen Sie beide aktiven Gesichter mit PBS, indem Sie 25 ml PBS über das aktive Gesicht 2-4x pipetieren. Trocknen Sie die Abdeckungen nicht, sondern legen Sie sie sofort in ein Teflongestell und bechern Sie mit PBS gefüllt. Achten Sie darauf, nachzuverfolgen, welche Coverslip-Flächen aktiv sind.
12. Verwenden Sie die vorbereiteten Proben sofort oder lagern Sie sie in einem geeigneten Puffer bei 4 °C für bis zu drei Tage ohne nennenswerten Unversehrtheitsverlust.
    
    Wichtiger Hinweis: Wenn Proben in einem AFM-Test verwendet werden sollen, ist die Zubereitung vollständig und sie können sofort verwendet oder wie in Schritt 5A.20 - 5A.21 beschrieben gespeichert werden. Wenn Proben in einem superauflösenden Fluoreszenz-Bildgebungstest verwendet werden sollen, fahren Sie mit der in den Schritten 5A.12 - 5A.19 beschriebenen Antikörperkennzeichnung fort.
13. Legen Sie beide virusbehandelten Coverlips aktiv nach oben in eine sterile Petrischale und Pfeifen genug Protein-Blockierungspuffer auf die Abdeckungen, um genügend Flüssigkeitsvolumen zu perlen, um die zentralen 95% des Abdeckungsrutsches zu decken, ohne einen Blockierenden Puffer aus dem Deckelzuschlag zu fließen (typischerweise 100 - 200 l). Inkubieren bei RT für 60-90 min.
14. Entfernen Sie vorsichtig den Sperrpuffer, indem Sie die Abdeckungen nacheinander aus der Petrischale entfernen und die Flüssigkeit aus dem Deckelinin in ein Abfallbecher gießen. Achten Sie darauf, den Coverslip nicht fallen zu lassen.
15. Spülen Sie beide aktiven Gesichter mit PBS durch Pipettieren 25 ml PBS über die aktive Fläche 2-4x, nicht trocknen und sofort verwenden. Achten Sie darauf, nachzuverfolgen, welche Coverslip-Flächen aktiv sind.
16. Legen Sie einen einzelnen blockierenden Puffer behandeltAbdeckung aktiv nach oben in eine sterile Petrischale, und Pipette eine entsprechende Menge an fluoreszierend markierten viralen Antikörper in Puffer auf die Mitte des aktiven Gesichts.
17. Legen Sie einen weiteren Coverslip (aktives Gesicht nach unten) auf die Flüssigkeit in einer Sandwich-Methode. Beachten Sie, welche Fläche aktiv ist, ist es wichtig, dass die aktiven Flächen in Kontakt mit der Flüssigkeit für die Inkubation sind (siehe Schritt 3.2).
18. Legen Sie den Deckel der Petrischale über das Coverslip-Sandwich und brüten Sie 30 min bei RT.
19. Entfernen Sie den Petrischalendeckel und trennen Sie die beiden Abdeckungen, wie in Schritt 3.4 beschrieben, und achten Sie darauf, die aktiven Gesichter zu verfolgen und nicht zu berühren.
20. Spülen Sie beide aktiven Gesichter mit PBS durch Pipettieren 25 ml PBS über die aktive Fläche 2-4x, nicht trocknen und sofort verwenden. Achten Sie darauf, nachzuverfolgen, welche Coverslip-Flächen aktiv sind.
21. Trocknen Sie die Abdeckungen nicht, sondern legen Sie sie in einem Teflon-Rack in einem mit PBS gefüllten Becher. Achten Sie darauf, nachzuverfolgen, welche Coverslip-Flächen aktiv sind.
22. Verwenden Sie die vorbereiteten Proben sofort oder lagern Sie sie in einem geeigneten Puffer bei 4 °C für bis zu drei Tage ohne nennenswerten Unversehrtheitsverlust.

5B. In Solution Antikörper-Angriff

Diese Methode ist eine optionale Erweiterung der Etikettierungsstrategie für die superauflösende Fluoreszenz-Bildgebung. Durch die Anwendung des In-Lösung-Angriffs kann eine bessere Antikörperbeschichtung auf der viralen Oberfläche erreicht werden.

1. Mischen Sie Antikörperlösungen in Verhältnissen nach Experimenten. Beispiel 1:4 Verhältnis von 0,01 mg/ml biotinylierten Antikörpern zu 0,01 mg/ml fluoreszierend markiertem Antikörper gibt eine gute Bindungsaffinität und ermöglicht eine gute Hüllkurvenrückgewinnung in einem superauflösenden Bildgebungstest.
2. Mischen Sie gleiche Teile der Antikörper- und Viruslösungen, die in (5B.1) und (1.3) hergestellt werden. Mischen Sie sanft durch Pipettieren auf und ab ein paar Mal in der Aliquot. Diese resultierende Lösung kann bis zu einem Bedarf von bis zu 24 Stunden bei 4 °C gelagert werden.
3. Nach Abschluss von Schritt 4.6 einen mit Avidin behandelten Deckelrutsch mit aktivem Gesicht in eine sterile Petrischale geben.
4. Pipette eine entsprechende Menge an Virus mit Antikörperlösung (in Schritt 5B.2) auf die Mitte des aktiven Gesichts vorbereitet.
5. Legen Sie einen weiteren Coverslip (aktives Gesicht nach unten) auf die Flüssigkeit in einer Sandwich-Methode. Beachten Sie die aktive Fläche, da es wichtig ist, dass die aktiven Flächen zur Inkubation mit der Flüssigkeit in Kontakt sind (siehe Schritt 3.2).
6. Legen Sie den Deckel der Petrischale über das Coverslip-Sandwich und brüten Sie bei RT für 45-60 min.
7. Entfernen Sie den Petrischalendeckel und trennen Sie die beiden Abdeckungen, wie in Schritt 3.4 beschrieben, und achten Sie darauf, die aktiven Gesichter zu verfolgen und nicht zu berühren.
8. Spülen Sie beide aktiven Gesichter mit PBS, indem Sie 25 ml PBS über das aktive Gesicht 2-4x pipetieren. Trocknen Sie die Abdeckungen nicht, sondern legen Sie sie sofort in ein Teflongestell und bechern Sie mit PBS gefüllt. Achten Sie darauf, nachzuverfolgen, welche Coverslip-Flächen aktiv sind.
9. Verwenden Sie vorbereitete Proben sofort oder lagern Sie bei 4 °C für bis zu drei Tage ohne signifikanten Verlust der Integrität.

6. Atomkraft-Mikroskopie Material-Eigenschaftsmessung

1. Schalten Sie die AFM-Laser ein und öffnen Sie die AFM-Software. Wählen Sie im Dialogfeld für den gewünschten Test den entsprechenden Scanmodus für den gewünschten Test aus. Alle erforderlichen Fenster sollten standardmäßig geöffnet werden. wenn Sie nicht in der Bedienungsanleitung lesen, um die gewünschten Fenster zu öffnen.
2. Wählen Sie einen Ausleger passend zur gewünschten Messung und legen Sie ihn gemäß herstellerspezifischen Richtlinien in das Auslegergehäuse ein. Es gibt eine Breite von Bedingungen und Experimenttypen, für die es eine Vielzahl von Auslegern gibt. Der Experimentator sollte Ausleger nach ihren Bedarf erforschen.
3. Setzen Sie das Auslegergehäuse gemäß den Herstellerrichtlinien in den AFM-Kopf ein.
4. Wenn die Probe unter nassen Bedingungen verwendet werden soll, entfernen Sie die Probe aus dem Speicherpuffer, und fahren Sie mit Schritt 6.7 fort.
5. Wenn die Probe unter Umgebungsbedingungen (trocken) verwendet werden soll, entfernen Sie die Probe aus ihrem Lagerpuffer und spülen Sie sie kurz, indem Sie sie in ein Becherglas mit Reinstwasser tauchen. Hinweis: Dadurch wird eine dünne Hydratationsschicht auf der Probe hinterlassen, die kapillare Anziehungskraft bei Auslegern mit einer niedrigen Federkonstante auslösen kann.
6. Wenn die Probe unter Umgebungsbedingungen (trocken) verwendet werden soll, trocknen Sie die Probe vorsichtig mit einem Stickstoffstrom.
7. Trocknen Sie die Rückseite des Deckels vorsichtig mit einem staubfreien Filterpapier, um sicherzustellen, dass die aktive Seite der Probe nicht berührt wird.
8. Legen Sie die Probe in den entsprechenden AFM-Probenhalter und legen Sie die Probe dann auf die AFM-Stufe.
9. Wenn die Probe unter nassen Bedingungen abgebildet werden soll, pipette eine kleine Menge Puffer auf die Mitte der Probe (ca. 10 l).
10. Legen Sie den AFM-Kopf über die Probe.
11. Wenn die Probe nass ist, stellen Sie sicher, dass der Ausleger und die AFM-Spitze in die Oberflächenschicht eindringen und dass es keine Blasen zwischen dem Ausleger- und auslegergehäusen.
12. Richten Sie den AFM-Laser entsprechend den Herstellerempfehlungen mit dem Ausleger aus, um das optimale Signal zu erhalten.
13. Messen Sie die Auslegerfrequenz und legen Sie die Scanfrequenz entsprechend dem Experimenttyp fest.
14. Senken Sie die AFM-Spitze auf die Oberfläche und optimieren Sie die Signaleinstellungen.
15. Führen Sie einen 20 m großen AFM-Scan im Modus Ihrer Wahl durch. Der Tapping-Modus (AC) wurde bei der Generierung repräsentativer Daten verwendet. Identifizieren Sie Viruskandidaten anhand der ungefähren Höhe, die in der Regel als scharfe Spitzen auf der Glasoberfläche angesehen werden kann.
16. Wählen Sie einen Viruskandidaten aus, und zentrieren Sie den Scankopf darüber.
17. Führen Sie einen 250 nm-Quadrat-Scan (oder einen entsprechenden Superauflösungsscan) über das ausgewählte Virus durch, um seine Topologie und Ausrichtung zu erhalten.
18. Wählen Sie einen Punkt auf dem Virus für die Materialeigenschaftsmessung(z.B. das Zentrum eines sphärischen Virus für die Messung eines Young-Moduls) und führen Sie die Messung entsprechend den Anweisungen des Herstellers durch.

7. Super-Auflösung-Bildgebungsmethode

1. Öffnen Sie die Super-Auflösung-Bildgebungssoftware und kalibrieren Sie die Software gemäß den Herstellerrichtlinien.
2. Kalibrieren Sie die hochauflösenden Bildgebungsgeräte gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von Fluoreszenzperlen.
3. Montieren Sie den Proben-Bildgebungspuffer aus Denbeständen kurz vor der Bildgebung, indem Sie 50 l mit 1 M MEA und 100 l 10x Gloxy bis 850 l Stammpuffer kombinieren. Halten Sie den Bildgebungspuffer für die Dauer des Experiments auf Eis.
4. Entfernen Sie einen vorbereiteten Deckelschlupf mit Probe aus seinem Speicherpuffer und spülen Sie ihn 5x, indem Sie ihn in ein Becherglas mit reinem Reinstwasser tauchen.
5. Trocknen Sie die nichtaktive Deckslipfläche mit einem staubfreien Filterpapier. Achten Sie darauf, das aktive Gesicht nicht zu berühren.
6. In ein Bildgebungssystem einzufügen und dem Probenhalter 250 l Bildgebungspuffer hinzufügen. Es ist sinnvoll, den Bildgebungspuffer auf der Probe alle 2 Stunden auszutauschen, um konsistente Ergebnisse zu erhalten.
7. Bedecken Sie den Probenhalter mit Parafilm, um die atmosphärische Interaktion mit der Raumumgebung zu verringern.
8. Legen Sie den Probenhalter in das Bildgebungsgerät für die Bildgebung.
9. Bringen Sie die Probe unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers in den Fokus.
10. Bild der Probe nach der verwendeten Super-Auflösungstechnik. Achten Sie darauf, die bildgebenden Bedingungen anzupassen, um das Signal zu optimieren und gleichzeitig eaktbare Aktivierungen von fotoschaltbaren Fluorophoren zu verringern.
    
    WICHTIG: Bildgebende Bedingungen sind stichprobenabhängig und variieren je nach experimentellem Bedarf. Ein typisches Experiment, bei dem Alexa 647 effizient in ihren dunklen Zustand im Bildgebungspuffer initialisiert wird, kann dann durch Anwendung von 405 nm UV-Licht photoaktiviert werden. Die Bilder werden durch das Spannende einer spärlichen Teilmenge von Alexa 647 Molekülen in einer dicht beschrifteten Probe und die Lokalisierung jedes Fluorophors mit einer Präzision, die in erster Linie durch die Anzahl der gesammelten Photonen begrenzt wird, erhalten. Dieses Verfahren wird von der Software wiederholt iteriert, bis eine gewünschte Anzahl von Erfassungszyklen stattgefunden hat. Der Experimentator sollte diese Einstellung mit jedem Fluorophor in der Probe korrelieren lassen, nachdem er fotogebleicht war.
11. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, fahren Sie die Bildgebunggemäße gemäß den Anweisungen des Herstellers herunter. Die Software kann für die Datenanalyse offen gelassen werden.
12. Die Datenanalyse ist stark vom Experiment abhängig; In allen Fällen identifizieren Sie Viren jedoch durch ihre volle Breite bei maximal der Hälfte, was mit den bekannten Virusdimensionen verglichen wird, und achten Sie darauf, die zusätzliche Größe der Fluoreszenzetiketten zu berücksichtigen.
13. Zur besseren Visualisierung können Sie Beispiele anzeigen, indem Sie entweder die Isosurface-Rendering-Option oder die volumetrische Rendering-Option verwenden, die beide in der Regel in der Bildverarbeitungssoftware mit superauflösung zu finden sind.

Results

Einzelvirionen-Bildgebung mit AFM:

Das oben beschriebene Probenvorbereitungsprotokoll wurde bei der Verankerung von Wildartenvirionen an der Glasoberfläche verwendet. VSV-Virionen sind kugelförmig mit einer Länge von 180 nm und einem Durchmesser von 80 nm. Da es eine Vielzahl von Virions gibt, für die diese Technik angewendet werden kann, wird das Konzept auch hier auf biotinylierten 36 nm Perlen demonstriert. Die resultierenden AFM-Experimente sind in Abbildung 1dargestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass die VSV-Virionen einen niedrigeren Young-Modul (100 MPa) im Vergleich zu den nicht umhüllten Viren (GPa) haben. Die besonderen Bilder von Single Virion VSV wurden im Abstichmodus unter Umgebungsbedingungen mit einem steifen Ausleger erhalten. Das Ziel war es, das Virus so weit zu verformen, dass die zusätzliche Proteindichte innerhalb des Virus als Beule innerhalb des AFM-Bildes sichtbar wird. Diese Methode wird verwendet, um die zusätzliche Proteindichte innerhalb der Virushöhle¹⁹zu erkennen.

Einzelvirion Super Auflösung Bildgebung:

Alexa 647 mit VSV-G-Antikörpern beschriftet wurden verwendet, um die Hülle einzelner VSV-Virionen für Super-Auflösungsexperimente mit Methode 5A zu beschichten. Um die Tetheringdichte und die geringe unspezifische Bindung zu veranschaulichen, ist in Abbildung 2Aein großer Scan der Probe dargestellt. Die Wiederherstellung des viralen Umschlags auf einer repräsentativen Virion ist in Abbildung 2B (blaue Isooberfläche) dargestellt.

Abbildung 1. AFM-Bildgebung von Perlen und VSV auf der funktionalisierten PEGG-Oberfläche. AFM-Scan von 36 nm biotinylierten Perlen (A, B) und einem VSV Virion (C), der mit einem biotinylierten VSVG-Antikörper an der Oberfläche verankert ist. AFM wurde im AC-Luft-Topographie-Scan-Modus durchgeführt. Der Spitzenradius beträgt <25 nm und Messungen wurden unter Kraftmodulation und Lichtabstich durchgeführt. Die Spitze hatte eine Kraftkonstante von 3 N/m und Resonanzfrequenz 75 kHz mit einer Unsicherheit von 15 kHz. Während die Perlen während des AFM-Scans ihre Höhe beibehalten haben, hat das VSV Virion einen deutlich kleineren Jungmodul und ist in der Höhe deutlich verformt. In diesem Bild wurde das Virion speziell mit einem steifen Ausleger im Abstichmodus abgebildet, der eine kleine xy-Konvolution erzeugte (zur Bestimmung der Spitze vs. stumpfes Ende des Virus) und der Höhenunterschied zwischen der Spitze und dem stumpfen Ende des Virus wird verwendet, um zusätzliche Proteindichte am stumpfen Ende des Virus¹⁹zu erkennen.

Abbildung 2. Fluoreszenzbasierte Abbildung von VSV-Virionen auf der funktionalisierten Oberfläche von PEGG. A) rekombinante VSV-Virionen, die auf der PEGG-Oberfläche mit einem biotinylierten Anti-VSVG-Antikörper in Weitfeldfluoreszenz immobilisiert wurden. B) Hochauflösende Fluoreszenzrekonstruktion der Anhüllung von VSV, die durch einen biotinylierten Anti-VSVG-Antikörper an der PEGG-Oberfläche befestigt ist und mit Alexa 647-beschrifteten Anti-VSVG-Antikörpern verziert ist (Methode 5A wurde zur Erstellung dieser Bilder verwendet). Die blaue Oberfläche ist eine 2D-Isooberflächenprojektion. Links zeigt ein Modell des kugelförmigen Virus. 

Coverslip Größe	Flüssigkeit
40 mm	65 l
35 mm	50 l
30 mm	36 l
25 mm	25 l
20 mm	16 l

Tabelle 1. Fluid aliquots nach Deckslipgröße.

Discussion

Als alternative Methode zur CryoEM-Tomographie kann eine Einzelvirion-Bildgebung mit AFM und hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung verwendet werden. Jede dieser Methoden hat ihre spezifischen Stärken. Zum Beispiel kann AFM auf WT Virionen ohne Anforderung auf Diepging der Probe oder der internen viralen Proteine durchgeführt werden. Die Lage viraler Strukturen ist von ihren Beiträgen zu den elastischen Eigenschaften der Virion entkoppelt.

Single Virion Super-Resolution Imaging in Kombination mit den neu entwickelten viralen Reverse genetischen Ansätzen wird eine leistungsfähige Technik zur Lokalisierung der niedrigen Kopierzahl viraler Proteine²⁰. Rekombinante Viren mit Ersatz ihrer Proteine durch Proteine, die zu fluoreszierenden Proteinen verschmolzen sind, können mit diesen umgekehrten genetischen Ansätzen hergestellt und gereinigt werden. Obwohl die Superauflösungsabbildung zum Teil aufgrund der genetischen Kennzeichnung Spezifität hat, erfordert sie die Verwendung der mutierten Viren.

AFM und Super-Resolution Imaging sind kostenlose Methoden, die sehr ähnliche Probenpräparate verwenden. Die in diesem Papier beschriebenen Methoden, die von früheren Einzelmolekül-Bildgebungs-Assays übernommen werden, ermöglichen die Verankerung einzelner Virionen mit geringen Auswirkungen auf die Topologie der Virionen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glasdeckgläser (fPALM)	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	72225-01	25 mm Deckgläser
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)	SuSoS-Bestand		: 0,5 mg/ml in PBS
NeutrAvidin Biotin-bindendem Protein	Invitrogen	A2666	Bestand: 0,25 mg/ml in PBS
Alexa Fluor 647 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Invitrogen	A21245	1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% Glykol, pH 7,2 Puffer
α-VSV-G	Invitrogen	ab34774	1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% Glykol, pH 7,2 Puffer
Gluox	Sigma	G2133-250KU	Glukoseoxidase Typ sieben von Aspergillius
Katalase	Sigma	C40-100mg	Katalase aus Rinderleber
MEA	Sigma	30070-10G	Cysteamin (MEA
Stammpuffer			50 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 10 mM NaCl + 10 % Glukose
NTE			10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA
Slide-A-Lyzer, Mini-Dialysegerät	Thermo Scientific		10.000 MW
Mikroskop-Deckglas: 35 CIRCLE #1	Fisherbrand	35 CIRCLE #1