Methoden zur Erleichterung des mikrobiellen Wachstums in Abfallströmen von Zellstofffabriken und Charakterisierung des biologischen Abbaupotenzials von kultivierten Mikroben

Zusammenfassung

Industrieabfälle können gesammelt und modifiziert werden, um das mikrobielle Wachstum zu analysieren. Lignocellulose-Extraktionstechniken liefern Komponenten zur Analyse der spezifischen biologischen Abbaufähigkeit. Die Gaschromatographie-Massenspektrometrie identifiziert Fermentationsprodukte von Mikroorganismen, die auf Zellstoffabfällen gezüchtet wurden. Mit diesen Methoden wird die metabolische Fähigkeit von Mikroorganismen zum Abbau von Zellstoffabfällen bestimmt.

Zusammenfassung

Das Kraftverfahren wird auf Holzhackschnitzel angewendet, um Lignin von den Polysacchariden in der Lignozellulose für Zellstoff zu trennen, der ein hochwertiges Papier herstellt. Schwarzlauge ist ein Zellstoffabfall, der durch den Kraftprozess erzeugt wird und das Potenzial für eine nachgelagerte Biokonversion hat. Die widerspenstige Natur der Lignocellulose-Ressourcen, ihre chemischen Derivate, die den Großteil des verfügbaren organischen Kohlenstoffs in der Schwarzlauge ausmachen, und ihr basischer pH-Wert stellen jedoch eine Herausforderung für den mikrobiellen biologischen Abbau dieses Abfallmaterials dar. Verfahren zur Sammlung und Modifikation von Schwarzlauge für das mikrobielle Wachstum zielen auf die Verwertung dieser Zellstoffabfälle ab, um das Lignin, die organischen Säuren und die Nebenprodukte des Polysaccharidabbaus in wertvolle Chemikalien umzuwandeln. Die vorgestellten Lignocellulose-Extraktionstechniken stellen eine reproduzierbare Methode zur Herstellung von Lignocellulose-Wachstumssubstraten dar, um die metabolischen Fähigkeiten von kultivierten Mikroorganismen zu verstehen. Der Einsatz der Gaschromatographie-Massenspektrometrie ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung der Fermentationsprodukte, die aus dem Wachstum von Mikroorganismen auf Zellstoffabfällen entstehen. Wenn diese Methoden zusammen verwendet werden, können sie die Bestimmung der Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen erleichtern, die das Potenzial haben, Fermentationsprodukte herzustellen, die dem Zellstoffsystem einen größeren Wert verleihen und Abwasserabfälle reduzieren würden, wodurch die potenziellen Gewinne der Papiermühle gesteigert und zusätzliche Verwendungsmöglichkeiten für Schwarzlauge geboten würden.

Einleitung

Das Auflösen von Holz ist ein chemisch intensiver Prozess, der über viele Jahre hinweg optimiert wurde, um ein System mit minimalem Abfall zu schaffen. Einige Ergebnisse dieses Prozesses könnten jedoch verwendet werden, um höherwertige Produkte herzustellen. Schwarzschnaps ist ein solches Beispiel. Es wird aus dem Kraftverfahren gewonnen, dem dominierenden chemischen Aufschlussverfahren, das 85 % der weltweiten Ligninproduktion ausmacht¹. Das Kraftverfahren (Abbildung 1) nutzt die Temperatur (160-200 °C), den Druck (120 psig) und die in der Testlauge enthaltenen Chemikalien (Natriumhydroxid und Natriumsulfid), um das Lignin aus den Holzfasern aufzulösen^2,3. Schwarzlauge enthält Lignin, organische Säuren und Nebenprodukte des Polysaccharidabbaus⁴. Es wird verbrannt, um Dampf zu erzeugen und Chemikalien im Rückgewinnungskessel zurückzugewinnen, der thermische Energie für nachgelagerte Papierherstellungs- und Zellstoffprozesse liefert. Das Volumen der beim Aufschluss erzeugten Schwarzlauge kann die Menge übersteigen, die der Rückgewinnungskessel effektiv verarbeiten kann. Die Entsorgung der Schwarzlauge als Abwasser wirkt sich negativ auf die Wasserflora und -fauna aus und ist daher keine Option. Der Einsatz von mikrobiellen Organismen, die Schwarzlauge für das Wachstum nutzen könnten, wäre im Hinblick auf die Steigerung der chemischen Rückgewinnung und die Erzeugung von Mehrwertprodukten von Vorteil, die die gesamte Lebenszyklusanalyse des Zellstoffsystems verbessern würden. Die chemische und biologische Umwandlung von Lignin-abgeleiteten Monomeren hat erfolgreich Vanillin und Zimtsäure für die Verwendung als Lebensmittelsüßstoffe und Duftzusätze, Phenol für Kunststoffe und Harze sowie Cyclohexan, das für Kraftstoff verwendet werden könnte⁵, hergestellt.

Frühere Arbeiten zum biologischen Abbau dieser Zellstoffabfälle konzentrierten sich auf die Lignin-Depolymerisation. Das International Lignin Institute (ILI) berichtet, dass jedes Jahr zwischen 40 und 50 Millionen Tonnen Lignin produziert werden (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Nur 1,5 % dieses Lignins werden für kommerzielle industrielle Prozesse verwendet⁶. Die Lignin-Depolymerisation durch Laccase- und Peroxidase-Enzyme, die von Weißfäulepilzen der Gattungen Phanerochaete und Trametes produziert werden, wurde ausführlich untersucht⁷. Bodenbakterien, von denen bekannt ist, dass sie aromatische Verbindungen abbauen, wie Nocardia und Rhodococcus⁸, Pseudomonas putida mt-2⁹ und Streptomyces viridosporus T7A¹⁰, haben sich ebenfalls als in der Lage erwiesen, Lignin abzubauen. Der bakterielle Abbau von Zellstoffabfällen ist vielversprechend, da einige Bakterien unter salzhaltigen und alkalischen Bedingungen (pH 10-14) gedeihen können, die für die Abwässer von Zellstoffabfällen charakteristisch sind¹¹. Während Lignin der Hauptbestandteil der Schwarzlauge ist, können Mikroorganismen auch die anderen Bestandteile der Schwarzlauge abbauen. Diese Techniken dienen nicht ausschließlich der Identifizierung von ligninabbauenden Mikroorganismen, sondern dienen der Identifizierung von Mikroorganismen, die anstelle ihrer weiterverarbeiteten Bestandteile direkt auf die Zellstoffabfälle Schwarzlauge ausgebracht werden können.

Schwarzlauge wurde gesammelt und durch Neutralisation und Filtersterilisation für mikrobielles Wachstum modifiziert. Die Anforderungen an das mikrobielle Wachstum eines mikrobiellen Umweltisolats wurden durch Experimente mit minimalem Medienwachstum an lignozellulosehaltigen Komponenten identifiziert, die durch ein neuartiges Lignocellulose-Extraktionsprotokoll hergestellt wurden. Die Wachstumsmedien wurden mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) analysiert, um die Stoffwechselprodukte des mikrobiellen Isolats aus der Umwelt zu bestimmen, wenn es auf Schwarzlauge als alleiniger Kohlenstoffquelle gezüchtet wird. Die Kombination dieser Techniken bietet ein Bewertungsinstrument zur Bestimmung der Stoffwechselkapazität eines Mikroorganismus, wenn er auf Zellstoffabfällen wie Schwarzlauge angebaut wird. Der Einsatz solcher Techniken bietet auch einen Einblick in den Wert der Anwendung spezifischer Mikroorganismen auf Zellstoffabfälle zur Erzeugung von Nebenprodukten.

Protokoll

1. Sammeln von Schwarzlauge und Aufbereitung von Schwarzlauge für Wachstumskulturen

1. Entnehmen Sie eine Probe der Schwarzlauge aus dem Auslassventil, das am Kraftfermenter befestigt ist, in einer sterilen Glasflasche und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie mit den folgenden Schritten fortfahren.
   Neutralisierung
2. 100 ml Schwarzlauge-Probe werden in ein 500-ml-Becherglas gegeben, das mit einem Rührstab versehen ist.
3. Den Becher auf eine Rührplatte stellen und die Geschwindigkeit auf mittlere Stufe stellen.
4. Tropfen Phosphorsäure langsam zugeben, bis die Schwarzlauge zähflüssig wird (Viskosität ähnlich wie Glycerin).
5. Aliquotieren Sie die gesamte Schwarzlaugenlösung, indem Sie sie langsam in konische 50-ml-Röhrchen gießen und 30 Minuten lang bei 9.300 x g zentrifugieren.
6. Legen Sie den Überstand in das Becherglas und messen Sie den pH-Wert mit pH-Testbändern. Das Pellet aus gefälltem Lignin kann entsorgt und als ungefährlicher fester Abfall behandelt werden.
7. Weiter Phosphorsäure zugeben und die Lösung zentrifugieren, bis die pH-Streifen einen neutralen pH-Wert des Überstands anzeigen.
   Sterilisation
8. Geben Sie die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter, um alle kontaminierenden Bakterien zu entfernen, und geben Sie die gefilterte Lösung zur Lagerung in einen sterilen Behälter. Bei Raumtemperatur lagern.

2. Extraktion von Lignocellulose

Kohlenhydrat-Trennung

1. 5 g Rutenhirse, Kiefer oder Bermudagras (gemahlen auf 1 mm oder kleinere Korngröße) in einen 500 ml Erlenmeyerkolben geben. Dann werden 200 ml destilliertes oder entionisiertes Wasser, 7,5 g NaClO₂, 2,5 ml Eisessig und ein Rührstab in den Kolben gegeben.
2. Den Kolben 1 Std. lang in ein Ölbad stellen, das auf einer Rührplatte bei 80 °C aufgesetzt ist. Die Geschwindigkeit der Rührplatte auf mittlere Stufe stellen.
3. Weitere 7,5 g_{NaClO 2} und 2,5 ml Eisessig werden in den Kolben gegeben. Bei 80 °C im Ölbad 30 min weiterrühren.
4. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt 2x (Hinweis: Insgesamt werden 30 g_{NaClO 2} und 10 ml Eisessig in den Kolben mit der lignozellulosehaltigen Biomasse gegeben). Kühle die Lösung auf Raumtemperatur ab.
5. Legen Sie ein Blatt Filterpapier in einen Büchner-Trichter. Setzen Sie den Trichter auf einen Seitenarmkolben und befestigen Sie ihn an einem Vakuum
.
6. Gießen Sie die Lösung langsam in den Trichter.
7. Waschen Sie das feste Material 3x mit 100 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser. Entsorgen Sie das Filtrat nach dem Waschen des Feststoffs.
8. Bewahren Sie 1 g des festen Materials auf und legen Sie es auf ein sauberes Blatt Filterpapier.
9. Trocknen Sie diesen Feststoff über Nacht in einem 50 °C heißen Ofen. Nachdem Sie die Probe aus dem Ofen genommen haben, geben Sie sie in ein Vorratsfläschchen mit der Aufschrift "Holocellulose".
10. Den restlichen Feststoff geben Sie zu 250 ml 10 % NaOH (v/v) in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben. Verschließen Sie den Kolben mit einem Stopfen.
11. Die Lösung 1 Stunde lang bei 70 °C in einen Inkubator geben und bei 250 U/min schütteln.
12. Kühlen Sie die Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ab.
13. Entfernen Sie das Festmaterial mit Filterpapier und einem Büchner-Trichter, der an einem Seitenarmkolben befestigt ist.
14. Das feste Material auf einem sauberen Blatt Filterpapier in einen 50 °C heißen Ofen geben und über Nacht trocknen lassen.
15. Nachdem der Rückstand getrocknet ist, geben Sie ihn in ein Vorratsfläschchen und beschriften Sie ihn mit "Zellulose".
16. Das Filtrat aus Schritt 2.13 wird in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben überführt und mit 30 ml Essigsäure und 250 ml Isopropylalkohol versetzt. Verschließen Sie den Kolben und stellen Sie die Lösung für mindestens 8 Stunden bei Raumtemperatur auf die Tischplatte.
17. Füllen Sie die gesamte Lösung in konische 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Lösung 30 Minuten lang bei 9.300 x g. Pipettieren Sie die Lösung vorsichtig aus dem konischen Röhrchen und entsorgen Sie sie.
18. Das Pellet wird in 30 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser durch Vortexen resuspendiert.
19. Wiederholen Sie die Schritte 2.17-2.18 15x, um das Pellet gründlich zu waschen.
20. Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet zum Gefriertrocknen auf. Nach der Gefriertrocknung wird die Probe entnommen und in ein Fläschchen mit der Aufschrift "Hemicellulose" gegeben.
    Lignin-Trennung
    Lignin-Trennungsprotokoll basierend auf Karaaslan et al. ¹²
21. 5 g Rutenhirse, Kiefer oder Bermudagras (gemahlen auf 1 mm oder kleinere Partikelgröße) zu 500 ml einer Lösung von 0,25 M NaOH und 30 % Ethanol geben. Die Gülle wird 2 Stunden lang bei 75 °C und 250 U/min in einen Inkubator gestellt.
22. Kühle die Lösung auf Raumtemperatur ab.
23. Legen Sie ein Blatt Filterpapier in einen Büchner-Trichter auf einen Seitenarmkolben. An einem Vakuum befestigen und die Lösung langsam in den Trichter gießen.
24. Entsorgen Sie das feste Material.
25. Geben Sie einen Rührstab in den Kolben mit dem Filtrat und stellen Sie den Kolben auf eine auf mittlere Geschwindigkeit eingestellte Rührplatte. Konzentrierte Salzsäure wird tropfweise in die Lösung gegeben, bis ein pH-Wert von 2,0 erreicht wird (ca. 20 ml).
26. Lassen Sie die angesäuerte Lösung über Nacht bei Raumtemperatur ziehen.
27. Die Lösung wird bei 9.300 x g für 30 min in konischen Röhrchen zentrifugiert. Pipettieren Sie die Lösung vorsichtig aus dem konischen Röhrchen und verwerfen Sie sie.
28. Das Pellet wird in 30 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser durch Vortexen resuspendiert.
29. Wiederholen Sie die Schritte 2.27-2.28 15x, um das Pellet gründlich zu waschen.
30. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und bewahren Sie das Pellet zum Gefriertrocknen auf. Nach der Gefriertrocknung wird die Probe in ein Fläschchen mit der Aufschrift "Lignin" gegeben.

3. Vorbereitung von mikrobiellen Wachstumskulturen

Agar-Platten

1. 0,2 % (w/v) sterile Lignocellulose-Extraktionsprodukte zu M9 minimal Medium¹³ Agar hinzufügen, bevor die Platten gegossen werden.
2. Erstarrte Streifenplatten mit ca. 200 μl einer Bakterienkultur, gezüchtet in M9-Minimalmedien mit einem Außendurchmesser von ca. 2,0.
3. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C und überwachen Sie das Wachstum.
   Flüssige Kulturen
4. 50 ml steriles Luria-Bertani (LB) Medium¹³ oder M9 minimal^{Medium 13} werden in einen sterilen 125 ml Kolben gegeben. Geben Sie Schwarzlauge in einer Menge von 10 % (v/v) oder 0,2 % (w/v) Lignocellulose-Extraktionsprodukten zu.
5. Beimpfen Sie das Medium mit 0,1 % (v/v) einer Bakterienkultur bei einem Außendurchmesser von ca. 2,0.
6. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 200 U/min.
7. Beurteilen Sie das Wachstum alle 6 Stunden während der Kultivierungsperiode, indem Sie die optische Dichte (λ = 600 nm) messen. Ein Aliquot von 1 ml der Kultur wird in eine Küvette gegeben. Bestimmen Sie die optische Dichte von Kulturen, die gegen ungeimpfte Medien ausgeblendet wurden.
8. Übertragen Sie die Bakterien in der Mitte der logarithmischen Phase in eine anaerobe Serumflasche.
   1. Zur Vorbereitung der anaeroben Serumflasche: Verschließen Sie die Serumflasche mit einem Butylkautschukstopfen und einem Aluminium-Bördelverschluss unter aeroben Bedingungen und autoklavieren Sie sie. Verändern Sie den Kopfraum in der Serumflasche nach der Sterilisation nicht.
   2. Die gesamte 50-ml-Kultur aus dem 125-ml-Kolben wird mit einer Spritze in die versiegelte sterile Serumflasche überführt.
   3. Inkubieren bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min.

4. Probenvorbereitung für GC-MS

Bereiten Sie Proben gemäß Raj, Reddy und Chandra¹⁴ vor. Die für den Vergleich verwendete Negativkontrolle besteht aus M9-Minimalmedien mit 10 % Schwarzlauge und wird auch als unbeimpfte Probe bezeichnet.

1. Zentrifugieren Sie ungeimpfte und inokulierte Bakterienkulturen (50 ml) bei 9.300 x g für 30 Minuten nach 450 Stunden Inkubation.
2. 10 ml des Überstands werden in ein Reagenzglas aus Glas gegeben. (Hinweis: Kunststoff ist mit den Chemikalien in den folgenden Schritten nicht kompatibel.)
3. Säuern Sie den Überstand mit konzentriertem HCl auf pH 1-2 an.
4. Fügen Sie 3 Volumen Ethylacetat (30 ml) hinzu, verschließen Sie das Röhrchen und mischen Sie, indem Sie es 4-6x umdrehen.
5. Geben Sie eine kleine Menge wasserfreies Na₂SO₄ (1-2 g) in ein sauberes Reagenzglas aus Glas.
6. Entnehmen Sie vorsichtig die organische Schicht (oben) von der Ethylacetatlösung, indem Sie sie mit einer Einweg-Pasteurpipette aus Glas pipettieren.
7. Legen Sie die organische Schicht mit wasserfreiem Na₂SO₄ in das Reagenzglas.
8. Entwässern Sie die organische Schicht über dem wasserfreien Na₂SO₄, indem Sie vorsichtig auf das Reagenzglas klopfen, um es zu mischen. Nach und nach kleine Mengen wasserfreies Na₂SO₄hinzufügen und mischen, bis keine großen Klumpen mehr vorhanden sind.
9. Legen Sie ein Blatt Filterpapier in einen Büchner-Trichter auf einem Seitenarmkolben, der an einem Vakuum befestigt ist.
10. Gieße die Lösung in den Trichter. Entsorgen Sie das feste Material.
11. Die Lösung in einen Verdampferkolben überführen und das Filtrat mit einem Rotationsverdampfer verdampfen.
12. 3 mg Extraktionsrückstand aus Ethylacetat in ein 2-ml-Durchstechflasche für die Bernsteinchromatographie geben.
13. Der Rückstand wird unter Zugabe von 100 μl 1,4-Dioxan und 10 μl Pyridin aufgelöst
.
14. 50 μl N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid mit Trimethylcholorsilan 99:1% (BSTFA) zugeben. Dann in einen Inkubator bei 60 °C stellen und 15 min schütteln.
15. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei 4 °C.

5. GC-MS

Rüsten Sie den Gaschromatographen (GC) an Schnittstelle mit einem Massenspektrometer (MS) mit einer unpolaren Kapillarsäule und Helium als Trägergas mit einer Durchflussrate von 1 ml/min aus.

1. Nachdem sich die Ofentemperatur bei 50 °C stabilisiert hat, wird 1 μl der Probe in einem Teilungsverhältnis von 1/50 injiziert.
2. Halten Sie die Säule 5 min lang bei 50 °C und erhöhen Sie sie auf 280 °C bei 5 °C/min. Halten Sie die Endtemperatur von 280 °C für 20 min.
3. Die Transferleitung zwischen Gaschromatograph und Massenspektrometer ist auf 300 °C zu halten.
4. Wählen Sie eine Lösungsmittelverzögerung von 15 Minuten.
5. Aufzeichnung von Elektronenionisationsmassenspektren im Bereich von 10-500 (m/z) bei einer Elektronenenergie von 70 eV.
6. Derivatisieren und chromatographieren Sie den Standard wie oben. Identifizieren Sie Verbindungen, indem Sie die Aufbewahrungszeiten von gekauften Standards oder Daten in der Massenspektraldatenbank des National Institute of Standards and Technology (NIST) vergleichen.

Ergebnisse

Die Sammlung und Modifikation von Schwarzlauge, die beim Kraftaufschlussprozess erzeugt wird (Abbildung 1), ermöglicht es, diese Aufschlussabfälle zu verwenden, um die biologische Abbaukapazität eines einzelnen Bakterienisolats oder einer Mischkultur zu bestimmen. Abbildung 2 zeigt das aerobe Wachstum, gemessen an der optischen Dichte des mikrobiellen Umweltisolats, das nur in LB-Medien und LB-Medien mit 10 % neutralisierter Schwarzlauge kultiviert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf h...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Kombination von Techniken, die darauf abzielt, Mikroorganismen zu identifizieren, die Zellstoffabfälle abbauen können, die Kohlenstoffquellen, die während des Wachstums auf Zellstoffabfällen verwendet werden, und die mikrobiellen Stoffwechselprodukte, die beim Anbau auf Zellstoffabfällen entstehen. Wir haben den Erfolg dieses Protokolls mit dem mikrobiellen Umweltisolat gezeigt: eine fakultative Anaerobe, die auf 10 % Schwarzlauge wachsen kann und die Komponenten der Lignozellulose-Extrak...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,4-Dioxan (ACS-zertifiziert)	Fisher	D111	Entflammbare, voroxidierbare Chemikalie
Schwarzlauge	Department of Forest Biomaterials an der North Carolina State University	N/A	pH 12,72, 13,67 % Feststoffe
Ethanol (mikrobiologische Qualität)	Fisher	BP2818
Ethylacetat (ACS-Reagenzqualität)	EMD	EX0240-9	Entzündlich
Eisessig (ACS-zertifiziert)	EMD	AX0073	Ätzendes
Guajakol	Sigma Aldrich	PHR1136	Gesundheitsschädlich durch Verschlucken, ätzende
HP-5 Kapillarsäule	Agilent	19091J-577	60 m x 0,18 mm Innendurchmesser, 0,18 μ m Dicke
Salzsäure (ACS-zertifiziert)	EMD	HX0603P
N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid mit Trimethylcholorsilan 99:1% (BSTFA)	Fluka	15238	Entzündlich, verursacht Hautverbrennungen und Augenschäden bei Kontakt
Na2SO4 (FCC-Qualität)	VWR	BDH8026
NaClO2 (80%)	Sigma Aldrich	244155	Entzündlich, giftig
NaOH (zertifiziert ACS)	EMD	1.06498.1000	Korrosive
Alkacid pH-Testbänder Fisher		A979
Phosphorsäure (zertifiziert ACS)	Fisher	A242
Polaris Q Massenspektrometer	Thermo Electron Corporation
Pyridin (99%)	Alfa Aesar	A12005	Entflammbar, giftig bei Berührung mit der Haut
Switchgrass	Cherry Research Farm Goldsboro, NC	N/A	Erntet August 2011
Thermo Finnigan Spurengaschromatograph	Thermo Electron Corporation
Whatman Nr. 1 Filterpapier	Whatman	1001-150