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Ein In vivo Vernetzung Ansatz zur Proteinkomplexe Von Isolieren Drosophila Embryonen

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DOI:

10.3791/51387

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23. April 2014

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1Department of Biological Sciences, Murray State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mehrkomponenten-Protein-Komplexe spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Funktion und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Verfahren verwendet, um native Protein-Komplexe von Drosophila-Embryonen isoliert nach in vivo Vernetzung durch Reinigung der vernetzten Komplexe für die nachfolgende Struktur-Funktions-Analyse.

Zusammenfassung

Viele zelluläre Prozesse werden von mehreren Unterproteinkomplexe gesteuert. Häufig werden diese Komplexe zu bilden vorübergehend und erfordern nativen Umgebung zu montieren. Deshalb, um diese funktionellen Protein-Komplexe zu identifizieren, ist es wichtig, sie in vivo vor der Zell-Lyse und anschließender Reinigung stabilisieren. Hier beschreiben wir eine Methode verwendet, um große Bona-fide-Protein-Komplexe von Drosophila-Embryonen zu isolieren. Dieses Verfahren wird auf den Embryo Permeabilisierung und Stabilisierung der Komplexe in den Embryonen von in vivo Vernetzung unter Verwendung einer niedrigen Konzentration an Formaldehyd, die leicht überqueren die Zellmembran beruht. Anschließend wird die Proteinkomplex von Interesse immungereinigt, gefolgt von der Gelreinigung und durch Massenspektrometrie analysiert. Wir veranschaulichen dieses Verfahren unter Verwendung eines Reinigungs Tudor-Protein-Komplex, die für die Keimbahn-Entwicklung ist. Tudor ist ein großes Protein, das mehrere Tudor-Domänen enthält - kleinModule, die mit methylierte Lysine oder Arginine von Zielproteinen wechselwirken. Diese Methode kann für die Isolierung von nativen Proteinkomplexe aus verschiedenen Organismen und Geweben angepasst werden.

Einleitung

Isolierung von Protein aus mehreren Unterbaugruppen und DNA-oder RNA-Protein-Komplexen durchgeführt, um Proteinkomplexe, genomische Loci von DNA-bindenden regulatorischen Proteine ​​oder RNA-Targets von RNA-bindenden Proteinen erkannt identifizieren. Verschiedene Methoden ermöglichen genomweiten Identifizierung von DNA-Stellen von Transkriptionsfaktoren oder Chromatin-Proteine ​​(ChIP-Seq) 1 und RNA-Targets mit einer bestimmten RNA-bindenden Protein (CLIP-Seq) 2 zugeordnet anerkannt. Die Bibliotheken der RNA-oder DNA-cDNAs abgeleiteten Ziele werden dann tief sequenziert. Diese Verfahren verwenden chemische oder UV-induzierte Vernetzung, um die Komplexe, gefolgt von Immunopräzipitation (IP) mit einem Antikörper gegen ein Protein-Komponente des Komplexes untersucht stabilisieren.

Während der Entwicklung eines Organismus bilden viele Proteinkomplexe transient. Daher ist es von entscheidender Bedeutung zur Analyse der Zusammensetzung und Funktion dieser Komplexe in vivo, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Entwickler zu steuernelopment. Solch ein in vivo-Analyse überlegen wäre in vitro-Ansatz, da es praktisch unmöglich ist, nativen Konzentrationen der zusammenwirkenden Komponenten und zelluläre biochemische Umgebung in vitro zu reproduzieren. Hier zeigen wir eine in vivo-Ansatz, den wir verwenden, erfolgreich auf großen Proteinkomplexen von Drosophila-Embryonen zu isolieren. In diesem Verfahren werden Protein-Komplexe in den lebenden Embryonen mit einer niedrigen Konzentration von Formaldehyd und anschließender Proteinkomplexe von Interesse werden von IP mit einem Antikörper isoliert gegen eine bekannte Komponente des Komplexes, gefolgt von der Gelreinigung der Komplexe und Massenspektrometrie-Analyse zu vernetzenden identifizieren unbekannt komplexe Bauteile. Da Formaldehyd in der Lage ist, die Zellmembran zu durchdringen und eine Vernetzungs Bereich von 2,3-2,7 Å 3, können Protein-Komplexen in vivo, vernetzt werden und die komplexen Bauteilen, die nahe zueinander zu sein. In diesem Artikel werden wirbeschreiben dieses Verfahren mit der Isolierung von Tudor (TUD) Proteinkomplex als Beispiel. Tud ist eine Keimbahn-Protein, die für die Entwicklung der Keimbahn 4-7 ist. Dieses Protein enthält 11 Tud Domains bekannt, mit methylierte Arginine Lysine oder von anderen Polypeptiden 8-10 interagieren.

Früher haben wir eine transgene Drosophila-Linie, die HA-markierte Funktions Tud 5 drückt, und daher wird spezifische Anti-HA-Antikörper verwendet, um komplexe Tud nach Vernetzung Pulldown generiert haben.

Zusätzlich zu Protein-Protein-Quervernetzungen können Formaldehyd Nukleinsäure-Protein-Vernetzungen zu erzeugen, und wird in der Chip-seq Experimente verwendet. Ferner ist in Drosophila, in vivo Vernetzung mit Formaldehyd hat die Identifizierung eines RNA-Ziel-RNA-Helicase-Protein Vasa 11 erlaubt.

Während in diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren für die In-vivo-und Vernetzungs purifizierung von Proteinkomplexen von Drosophila-Embryonen, kann dieses Verfahren für andere Organismen und Gewebe angepasst werden.

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Protokoll

1. Vorbereiten Große Apfelsaft-Agar-Platten

  1. Um 4 Platten zu machen, fügen 375 ml H 2 O, 11,25 g Agar und Fliege einen Rührstab zu einem 1000-ml-Kolben. Dies ist A. Autoklav Mix Mix A mit dem Kolben Deckel lose auf einem 30 min-Sterilisationszyklus für flüssige Güter begrenzt.
  2. In 125 ml Apfelsaft, 12,5 g Haushaltszucker und einen Rührstab in einen 500-ml-Becherglas. Dies ist Mix B. Wärme Mix B auf einer Plattform unter Rühren erhitzt und die Temperatur bei ungefähr 70 ° C bis zum Autoklavieren der Mischung A ist abgeschlossen.
  3. Nach Abschluss der Mix Ein Autoklavieren übertragen Mix zu Mix B A. Halten Rühren der kombinierten Mischung vorsichtig und lassen Sie es 15 Minuten abkühlen. Vermeidung von Überkühlung und der Folge Agar Verfestigung vor der Zugabe des Konservierungsmittels.
  4. Machen Sie 10% (Gewicht / Volumen) Methyl-4-hydroxybenzoat Lösung in Ethanol. Dies wird als Konservierungsmittel dienen. Hinzufügen 3,75 ml der Lösung des oben Apfelsaft-Agar-Mischung. Halten Rühren another 5 min.
  5. Gießen Sie 125 ml Apfelsaft-Agar-Mischung mit Konservierungsmittel in jeweils 300 cm 2 Kunststoff-oder Styroporplatte. Lassen Sie es auf RT abkühlen und sich verfestigen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen beim Gießen.
    Hinweis: Die Apfelsaft-Agar-Platten sind sofort einsatzbereit. Unbenutzte Platten mit klaren Wraps und lagern bei 4 ° C bis zu einer Woche.

2. Drosophila Embryo Sammlung und Pre-Vernetzungsbehandlung

  1. Legen Sie eine Bevölkerung Käfig mit etwa 40.000 bis 50.000 Fliegen aus dem Embryonen werden nicht erhoben.
  2. Machen Sie zwei Platten, die jeweils 125 ml von Standard-Maismehl-Melassen Medium 12 bestreuen und ca. 4 g getrocknete Bäckerhefe auf jeder Platte. Legen Sie diese Platten in der Bevölkerung Käfig in einem 25 ° C-Inkubator für 48 Stunden, um die Fliegen zu mästen.
  3. Warm 2 Apfelsaft-Agar-Platten auf 25 ° C Streuen Sie ca. 1 g getrocknete Bäckerhefe auf jedemPlatte. Legen Sie die 2 Platten in der Bevölkerung Käfig zu sammeln 0-1 h alten Embryonen.
  4. Nehmen Sie die Platten am Ende des 1 h-Sammlung. Ersetzen mit 2 neuen Platten, wenn eine weitere Runde der Sammlung benötigt.
  5. Fügen Sie genug Wasser, um die Platten bedeckt und resuspendieren Embryonen vorsichtig mit einem feinen Pinsel. Gießen Sie die resuspendiert Embryonen durch eine Zweischicht-Sieb aus Edelstahl-Drahtgewebe.
    Hinweis: Die oberste Schicht ist von mittlerer Porengröße (850 um), die große Fliegengitterteile sammelt während der Vermietung durch Embryonen hergestellt. Die untere Schicht ist aus feinem mesh (75 um), die Embryonen sammelt während der Vermietung durch Hefe und Wasser hergestellt.
  6. Verwenden Sie den feinen Pinsel, um die gesammelten Embryonen in einer Sammlung Korb mit einem 50-ml-Tube und feinen Nylongewebe übertragen. Mit Wasser spülen die Embryonen dann kurz trocknen Sie die Masche auf Küchenpapier trocknen.
  7. Tauchen die Embryonen in 50% Bleichmittel unter leichtem Schwenken für 3 min. Spülen Sie gründlichlich mit Wasser, um alle verbleibenden Bleichmittel entfernen. Tupfen Sie die Maschen auf Küchenpapier trocknen lassen.
  8. Tauchen Sie die dechorionated Embryonen in Isopropanol unter leichtem Schütteln für 15 Sekunden oder bis zum Zusammenbruch der Multi-Embryo Klumpen (dies sollte nicht länger als 30 Sekunden dauern). Tupfen Sie die Maschen auf Küchenpapier gut trocknen lassen.
  9. Tauchen die Embryonen in Heptan für 5 min, während mit einer Pipette, Heptan in den Embryonen zu streamen, um sie resuspendierten halten. Tupfen Sie die Maschen auf Küchenpapier trocknen lassen.
  10. Ströme mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (PBS), enthaltend 0,1% Triton X-100 (PBST) für 3 min Spülen der Embryonen.
  11. Zerlegen Sie den Sammelkorb und die Übertragung der Embryonen zusammen mit dem Mesh zu einem 15-ml-Tube mit 10 ml PBST. Das Röhrchen vorsichtig, um die Embryonen aus dem Netz zu waschen.
  12. Das Gitter aus der Tube. , Das Glas in einer vertikalen Position und ließ die Embryonen sinken auf den Boden des Rohres durch Schwerkraft.
    Anmerkung: Etwa 100 bis 300ul von Embryonen für eine 1 Stunde Sammlung von einem Käfig erwartet.
  13. Entfernen Sie die PBST und weiter zu führen sofort Vernetzung.

3. In vivo Vernetzung der gesammelten Embryonen

  1. Bereiten 0,2% Formaldehyd in PBST unmittelbar vor der Verwendung. 10 ml Formaldehyd-Fixierungsmittel, um die Embryonen und Inkubation bei 25 ° C unter leichtem Schütteln auf einem Rundschüttler für 10 min. Nicht verbrauchte Fixierlösung bis zum Ende des Tages.
  2. Stillen Sie die Vernetzungsreaktion
    1. Am Ende der Vernetzung können die Embryonen sinken auf den Boden des Röhrchens.
    2. Entfernen Sie die Formaldehyd-Lösung. Sofort 10 ml 0,25 M Glycin in PBST hinzufügen, um die Vernetzungsreaktion zu quenchen. Inkubieren bei 25 ° C unter leichtem Schütteln auf einem Rotationsschüttler für 5 min.
    3. Lassen die Embryonen sinken auf den Boden des Röhrchens. Entfernen Sie den Löschlösung. Mit 10 ml PBST dreimal Waschen der Embryos.
    4. Vollständig entfernen Sie die PBST Waschlösung mit einer Pipette. Speicher Embryonen bei -80 ° C bis zur Verwendung.

4. Protein-Probenvorbereitung und Immunpräzipitation

  1. Homogenisieren 500 ul vernetzten Embryonen mit einem Dounce Homogenisator in 2 ml Lyse-Puffer (0,5 M Harnstoff, 0,01% SDS, 2% Triton X-100, 2 mM Phenylmethansulfonylfluorid [PMSF] und Protease-Inhibitor-Cocktail in PBS).
    Hinweis: Führen Sie dieses und die folgenden Schritte bei RT sofern nicht anders angegeben.
  2. Transfer des Lysats in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen und schaukeln auf einer rotierenden Plattform 15 Minuten lang, um eine gründliche Lyse sicherzustellen. Zentrifugieren des Lysats bei 16.000 × g für 5 min, um Zelltrümmer zu pelletieren. Speichern Sie den Überstand in ein sauberes 15-ml-Tube.
  3. 40 &mgr; l Anti-HA-Agarosekügelchen Aufschlämmung in den Überstand und Inkubation auf einer rotierenden Plattform für 2,5 Stunden.
  4. Pellet die Kügelchen durch Zentrifugation bei 2.500 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand, aber lassen Sie entximately 250 ul in die Röhre. Resuspendieren der Perlen in der verbleibenden Überstand und Transfer in ein 1,5-ml-Spin-Säule mit 10-um Porenfilter.
  5. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 12.000 g für 10 sec und verwerfen die Strömung durch.
  6. Waschen der Kügelchen durch Zugabe von 200 ul Waschpuffer (0,1 M Glycin, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20 in PBS). Zentrifugieren Sie die Spalte bei 12.000 g für 10 sec und entsorgen Sie die Wäsche. Wiederholen Sie den Wasch zwei weitere Male.
  7. 40 &mgr; l Elutionspuffer (2 mg / ml HA-Peptid in PBS) zu den Kügelchen und Inkubation bei 37 ° C für 15 min unter leichtem Schütteln alle 5 min. Zentrifugieren Sie die Spalte bei 12.000 g für 10 sec und sammeln das Eluat.
  8. Elution des Komplexes durch Western-Blot-Analyse Bestätigen Sie mit Anti-HA-13.

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Ergebnisse

Schritt 7% Gel (in 1 dargestellt), gefolgt von Western-Blot (Fig. 2) - die Wirksamkeit der Vernetzung und die erfolgreiche Reinigung des vernetzten Tud Protein-Komplex wurden durch SDS-PAGE auf einem 3% analysiert.

Der Zweck der Verwendung von 3% - 7% Schritt Gel auf die wirksame Trennung von vernetzten Tud Proteinkomplex aus dem verbleibenden unvernetzten Tud Protein und Konzentration des Komplexes beruht. Unter unseren oben erwähnten in vivo Verne...

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Diskussion

Formaldehyd wurde üblicherweise als Vernetzungsmittel für die Identifizierung von Protein-Protein-und Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen verwendet. Seine gute Löslichkeit und Permeabilität der Zellmembran, zusammen mit der Kompatibilität mit nachgeschalteter Massenspektrometrie Verfahren machen Formaldehyd ein idealer Kandidat für die intrazelluläre Vernetzungsmittel Anwendungen 3,15-17. Insbesondere wurde es erfolgreich eingesetzt, um mRNAs mit Vasa, einen kritischen Keimzelle RNA-Helikase in Drosophi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler und Jimiao Zheng für ihre technische Hilfe zu dieser Studie. Diese Arbeit wurde von der NSF CAREER unterstützt gewähren MCB-1054962 ALA

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Drosophila AgarLab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1Autoklavieren Sie die Wasser-Agar-Mischung nicht über einen längeren Zeitraum, da dies dazu führt, dass die Apfelsaftplatten brüchig werden
Methyl-4-hydroxybenzoatSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501Anderer Name: TEGOSEPT
PopulationskäfigFliegenzeug ( http://www.flystuff.com/)59-104
Feines NylonnetzFlystuff (http://www.flystuff.com/)57-102Schneiden Sie bei der Herstellung des Auffangkorbs das Netz etwas größer als die Öffnung der Falcon Tube Cap, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten
Dounce HomogenisatorSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETKühlen Sie den Homogenisator auf Eis und spülen Sie ihn vor Gebrauch mit kaltem Lysepuffer vor, um einen Proteinabbau zu verhindern
Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS könnte zur Herstellung von konzentrierten Proteaseinhibitor-Stammlösungen verwendet werden
Anti-HA-Agarose-KügelchenMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Das Kit enthält auch HA-Peptid und Spin-Säulen
HA-PeptidMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Vorbereiten auf 2 mg/ml mit PBS 
Spin ColumnMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Spin Säulen sind im Kit
IsopropanolFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)
Triton X-100Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP151-500
HeptanFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625Gebrauch von 10X auf 1X mit Nanoreinem Wasser verdünnen
FormaldehydFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
GlycinBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
HarnstoffBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0730
PhenylmethansulfonylfluoridSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1G200 mM Stammlösung in Isopropanol herstellen und dann in Lysepuffer
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
zwischen 20verdünnen Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
15-ml-TubenUSA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
Bleichmittelder MarkeVerdünnen Sie es mit dem gleichen Volumen an Nanoreinstwasser, um 50 % Bleichmittel
herzustellen 50-ml-RöhrchenBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
Sieb der DeckschichtFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
UnterschichtsiebFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)Tel.: 04-884-1BA
.BP26324 Vor Clorox

Referenzen

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Schlagwörter

Isolierung von ProteinkomplexenFormaldehyd QuervernetzungImmunpr zipitationWestern Blot AnalyseMassenspektrometrieEmbryo PermeabilisierungGelreinigungTudor Proteinkomplex

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