Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Zusammenfassung

Es stehen mehrere Methoden zur Messung des intrazellulären pH-Werts zur Verfügung, aber nur sehr wenige davon ermöglichen die gleichzeitige Messung des zytoplasmatischen und organellären pH-Werts. Hier beschreiben wir detailliert eine schnelle und genaue Methode zur gleichzeitigen Messung des zytoplasmatischen und vesikulären pH-Werts durch ratiometrische Bildgebung lebender Zellen.

Zusammenfassung

Der intrazelluläre pH-Wert ist streng reguliert und es wurden Unterschiede im pH-Wert zwischen dem Zytoplasma und den Organellen berichtet¹. Die Regulierung des zellulären pH-Werts ist entscheidend für die homöostatische Kontrolle physiologischer Prozesse, zu denen gehören: Protein-, DNA- und RNA-Synthese, vesikulärer Transport, Zellwachstum und Zellteilung. Veränderungen der zellulären pH-Homöostase können zu nachteiligen funktionellen Veränderungen führen und das Fortschreiten verschiedener Krankheiten fördern². Für die Messung des intrazellulären pH-Werts stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, von denen jedoch nur sehr wenige die gleichzeitige Messung des pH-Werts im Zytoplasma und in Organellen ermöglichen. Hier beschreiben wir detailliert eine schnelle und genaue Methode zur gleichzeitigen Messung des zytoplasmatischen und organellären pH-Werts mittels konfokaler Mikroskopie an lebenden Zellen³. Dieses Ziel wird durch die Verwendung von zwei pH-empfindlichen ratiometrischen Farbstoffen erreicht, die eine selektive zelluläre Kompartimentpartitionierung aufweisen. Zum Beispiel ist SNARF-1 im Zytoplasma kompartimentiert, während HPTS in endosomalen/lysosomalen Organellen kompartimentiert ist. Obwohl HPTS häufig als zytoplasmatischer pH-Indikator verwendet wird, kann dieser Farbstoff nach seiner Aufnahme durch die Pinozytose spezifisch Vesikel entlang des endosomal-lysosomalen Weges markieren^3,4. Mit diesen pH-empfindlichen Sonden ist es möglich, den pH-Wert innerhalb des endozytären und zytoplasmatischen Kompartiments gleichzeitig zu messen. Die optimale Anregungswellenlänge von HPTS variiert je nach pH-Wert, während sie für SNARF-1 von der optimalen Emissionswellenlänge abhängt. Nach der Beladung mit SNARF-1 und HPTS werden die Zellen in verschiedenen pH-kalibrierten Lösungen kultiviert, um für jede Sonde eine pH-Standardkurve zu erstellen. Die Zellbildgebung durch konfokale Mikroskopie ermöglicht die Eliminierung von Artefakten und Hintergrundgeräuschen. Aufgrund der spektralen Eigenschaften von HPTS ist diese Sonde besser geeignet für die Messung des leicht sauren endosomalen Kompartiments oder zum Nachweis einer Alkalisierung der endosomen/lysosomalen Organellen. Diese Methode vereinfacht die Datenanalyse, verbessert die Genauigkeit von pH-Messungen und kann verwendet werden, um grundlegende Fragen im Zusammenhang mit der pH-Modulation während der Zellreaktion auf externe Herausforderungen zu beantworten.

Protokoll

1. Herstellung von Lösungen für Cellular pH-Kalibrierung

1. Fügen Sie die folgenden Verbindungen zu fünf separate 50 ml konische Röhrchen bis 5 Lösungen für die Kalibrierung verwendet werden vorbereitet:
   • NaCl (1 ml von 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml H ₂ 0)
   • KCl (6,75 ml 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml H ₂ 0)
   • Glucose (1 ml von 1 M D-Glucose) (1 M D-Glucose = 1,80 g in 10 ml H ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0,05 ml von 1 M MgSO ₄₎ (1 M MgSO ₄ = 1,20 g in 10 ml H ₂ 0)
   • 20 mM HEPES (1 ml von 1 M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml H ₂ 0)
   • CaCl ₂ (0,05 ml 1 M CaCl ₂₎ (1 M CaCl ₂ = 1,47 g in 10 ml H ₂ 0)
     Bereiten alle Lösungen in doppelt destilliertem H ₂ O (ddH ₂ O).
2. Füllen Sie jede Lösung mit 35 ml _ddH2O und mit einem Magnetrührer mischen, bis soLösung erreicht wird.
3. Der pH-Wert jeder Lösung mit 1 N KOH oder 1 N HCl auf pH-Werte von 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 und 7,5 erhalten. Dann wird das Volumen mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml einzustellen.
4. Maßnahme 5 mg Nigericin und es auf 670 ul absolutem EtOH hinzufügen, um eine 10 mM Stammlösung Nigericin vorzubereiten.
   Achtung: Nigericin ist hochtoxisch und müssen mit großer Sorgfalt (Handschuhe, Schutzbrille und Maske) behandelt werden. Mische die Lösung durch Umdrehen bis die Nigericin vollständig gelöst ist.
5. In 0,05 ml 10 mM Nigericin (Endkonzentration 10 uM), um die Eichlösungen. Ionophor Nigericin ist, die Permeabilität der Zellmembran erhöht und bewirkt Äquilibrierung von intrazellulären und extrazellulären pH-Wert in Gegenwart eines depolarisierenden Konzentration der extrazellulären K ^+.
6. Eichlösungen kann bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden,

2. Zellpräparation

1. Unter einer biologischen safety Haube, Samenzellen in 35 mm x 10 mm Kulturschalen in 2 ml Wachstumsmedium mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt. Verwenden der Menge von Zellen benötigt wird, um ungefähr 50% Konfluenz nach 24 Stunden zu gewährleisten.
   HINWEIS: In unseren Experimenten verwenden wir die HT-1080-Zelllinie und Platte 1 x 10 ⁵ Zellen pro Kulturschale.
2. Bestimmen der Anzahl von Kulturschalen für das Experiment und die Platte 5 zusätzliche Kulturschalen für die Kalibrierung verwendet werden, benötigt.
3. Ort Kulturschalen bei 37 ° C / 5% CO _2-Inkubator für mindestens 24 Stunden.

3. Herstellung von pH-Messsonden

1. Bereiten Sie eine 1 M Stammlösung des fluoreszierenden pH-Sonde 8-Hydroxypyren-1, 3,6 trisulfonsäure, Trinatriumsalzes (HPTS / Pyranin) in ddH ₂ 0. Diese Lösung muss bei RT gelagert und vor Licht geschützt werden.
2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mM 5 - (und-6)-Carboxy seminaphthorhodafluor Acetoxymethylester Acetat (C-SNARF-01.00; genannt Thereâach SNARF-1) durch Lösen von 1 mg SNARF-1 in 1,76 ml DMSO. Durch wiederholtes Pipettieren gründlich mischen. SNARF-1-Lösung muss bei -20 ° C gelagert und vor Licht geschützt werden.

4. Zellmarkierung

1. Sechzehn Stunden vor der Live-Cell-Imaging, fügen 2 ul 1M HPTS Stammlösung (Endkonzentration 1 mM) zu jeder Kulturschale mit 2 ml Vollmedium.
2. Bringen Sie die Kulturschalen in den Inkubator. Die HPTS Sonde zell impermeante, daher Label Organellen muss die Sonde durch pinocytosis genommen werden. Diese Bedingung erfordert, dass die Zell Inkubationen mit HPTS in serumhaltigem Kulturmedium durchgeführt.
3. Nach der Inkubation mit HPTS, waschen Sie die Zellen zweimal mit sterilem PBS und 2 ml Serum-freiem Medium für mindestens 2 Stunden. Inkubation mit SNARF-1 benötigt, um in serumfreiem Medium durchgeführt, da Serum kann die Aufnahme der Sonde zu verhindern.
4. In 10 ul einer 1 mM SNARF-1-Stammlösung zu erhalten afinal Konzentration von 5 uM und lassen Zellen für 20 min bei 37 ° C unter schwachem Licht inkubiert. C-SNARF-1-Konzentration und Inkubationszeit kann je nach Zelltyp variieren.
5. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen zweimal Waschen in sterilem PBS und 2 ml serumfreies Medium.

5. Zugabe von pH-Modulatoren

1. Um zu beurteilen, ob die Methode können pH-Veränderungen in den Zellen erkennen können verschiedene Reagenzien, die intrazellulären pH-Modulation verwendet werden:
   • Bafilomycin A1, ein spezifischer Inhibitor der ^V-ATPase-5
   • Na ⁺ / H ^{+-Austauscher} Isoform 1 (NHE-1) ⁶
   • NH ₄ Cl, eine schwache Base, die intrazelluläre pH ⁷ erhöht
   1. Stocklösungen der oben genannten Reagenzien:
      • Bafilomycin A1: 160 ul DMSO hinzufügen 10 ug Bafilomycin A1 um eine Stammlösung von 100 uM erhalten
      • EIPA: add 25 mg EIPA auf 1,67 ml Methanol obtaina Endkonzentration von 50 mM
      • NH ₄ Cl: Man löst 0,53 g Ammoniumchlorid in 10 ml ddH ₂ O auf eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
      
      Hinweis: Alle Stammlösungen sind bei 4 ° C aufbewahrt werden, außer Bafilomycin A1, die bei -20 ° C gelagert und vor Licht geschützt werden müssen.
   2. In getrennten Kulturschalen, fügen Sie eines der Reagenzien, wie unten beschrieben:
      • 2 ul 100 uM Bafilomycin A1 (Endkonzentration 100 nM)
      • 1 ul 50 mM EIPA (Endkonzentration 25 uM)
      • 40 ul 1 M NH ₄ Cl-Lösung (Endkonzentration 20 mM)
   3. Die Zellen für 30 min bei 37 ° C.
2. Fahren Sie mit der Bildaufnahme.

6. Technische Daten des Live-Cell-Imaging-Mikroskop und Akquisition Einstellungen

1. Führen Sie Live-Cell-Imaging mit ein 40X-Objektiv auf einer spektralen invertierten konfokalen Mikroskopie montiertpe mit einem motorisierten XY-Tisch, eine Kammer, die mit Glasboden Kulturschalen in einer kontrollierten Umweltbedingungen (Temperatur, Luftfeuchtigkeit, CO _2)-Stufe Inkubator bietet Platz ausgestattet.
2. Das konfokale Instrument (Olympus FV1000) verwendet, hier ist ausgestattet mit:
   • Ein Diodenlaser 405 nm
   • A 40 mW Argon-Laser (458 nm, 488 nm, 515 nm)
   • Ein Helium-Neon-Laser (543 nm)
   • Fluorit-10X-Objektiv, NA0.4
   • Ein LUCPLFLN 40X-Objektiv, NA0.60
   • Ein PLAPONSC PLAN APO 60x Öl-Objektiv, NA1.4
   • Ein dichroitischen Spiegel DM 405/458/488/543
   • Ein SDM 560 und ein SDM 640 dichroitischen Filter
   • Ein BA655-755-Sperrfilter
   • Ein Strahlteiler BS20/80
   • Datenanalyse-Software für die Bildaufnahme und-analyse,
3. Sobald die Bühne Inkubator hat bis zu 37 ° C erwärmt und das Mikroskop aufgebaut ist, legen Sie eine Kulturschale zuvor mit HPTS und SNARF-1 in der konfokalen Imaging-Bühne Kammer inkubiert.
4. Aach Ortung einen Bereich von Interesse, stellen die Anschaffungs Einstellungen Software Abbildung 1.
   • Richten Sie zwei virtuelle Kanalsätze.
   • Initiieren Sie die erste Phase, die HPTS Anregung bei 405 nm und Emission bei 505 entspricht Sammlung - 525 nm und SNARF-1-Anregung bei 543 nm und Emissions Kollektion bei 570 bis 600 nm auf.
   • Initiieren Sie die zweite Phase, die HPTS Anregung bei 458 nm und Emission bei 505 entspricht Sammlung - 525 nm und SNARF-1-Anregung bei 543 nm und Emissions Kollektion bei 640 bis 650 nm auf.
   • Das konfokale Blende ist standardmäßig auf 175 um eingestellt und optimale Blende muss auf 300 um manuell eingestellt werden.
   • Nehmen Bild von Stapelserien horizontale optische Schnitte (800 x 800 Pixel) von 0,4 um Dicke.

HINWEIS: Ein 40X-Objektiv ist sinnvoll, mehrere Zellen gleichzeitig zu beobachten und funktioniert gut für Organelle Betrachtung. , Räumliche Auflösung und Signalintensität sind jedoch better erreicht mit einem 60x Öl-Objektiv. Darüber hinaus gibt es keine Anregung oder Emission Übersprechen zwischen den beiden Farbstoffen.

7. Kalibrierung von pH-Messsonden

1. Vor der Kalibrierung entfernen Medium von der Kulturschale zuvor mit HPTS und SNARF-1 inkubiert, zweimal mit sterilem PBS und dann 2 ml einer der fünf Kalibrierungslösungen.
2. Legen Sie die Kulturschale in die konfokale Stufenkammer.
3. Fahren Sie mit Zeitraffer-Bildaufnahme nach den folgenden Einstellungen:
   1. Stellen Sie die Anzahl der Bilder und Intervalldauer Zeiten für das Experiment.
      Hinweis: Wir verwenden in der Regel eine 1 min Intervall zwischen den Bildern für bis zu 30 min.
   2. Programmieren Sie den Auslöser, um zwischen dem Erwerb von jedem Bild zu schließen.
4. Notieren Sie sich die Fluoreszenzintensität pro min in einem Tabellenkalkulationssoftware und bestimmen Sie die Zeit, in der Fluoreszenzintensität ist stabil. Die intrazelluläre pH-Wert in der Regel nach 15 stabil - 20 min.
5. REPEAT Schritte 7.1 bis 7.4 mit einer neuen Kulturschale für jede verbleibende Kalibrierungslösung.

8. Datenerfassung

1. Sobald die Kalibrierung durchgeführt wurde, zu erwerben Beispieldaten 4-5 zufällig ausgewählten Feldern mit 15-20 Zellen pro Feld. Zwei Bilder werden für jedes Feld erhalten: eine für HPTS Kennzeichnung (Vesikel) und die zweite für SNARF-1-Kennzeichnung (Cytosol).
2. Hintergrundfluoreszenz (extrazellulären Bereich) ist digital von Fluoreszenzbilder der beiden Sonden abgezogen. Beschriftete Vesikel und Cytosol von ihren jeweiligen gespeicherten Bilder werden mit Hilfe eines binären Maske ausgewählt. Für jeden pH-Messfühler sind Fluoreszenzintensitäten auf einer numerischen Skala (0-4,095 Graustufenskala) gemessen. Eine mittlere Intensität aller Pixel in der Organelle oder Zytoplasma wird berechnet und die Werte werden verwendet, um Fluoreszenz-Verhältnisse zu berechnen.

9. Datenanalyse

1. Verschiedene Software-Pakete sind für die Datenanalyse im Handel erhältlich. DhFluoView Software.
2. In einer Tabellenkalkulation, Datensatzwerte und berechnen Fluoreszenzverhältnisse wie folgt: Im Fall von HPTS, R = (F _{458 nm} / F _{405 nm)} und, im Fall von SNARF-1, R = (F _{644 nm} / F _{584 nm} ).
3. Zeichnen Sie die Daten mit Hilfe wissenschaftlicher Grafik-Software wie GraphPad Prism. Das Grundstück sollte Fluoreszenzverhältnisse (Y-Achse) in Abhängigkeit von pH-Wert (X-Achse) zu porträtieren. Kurvenanpassung unter Verwendung nicht-linearer Regression gelöst.
4. Sammeln Fluoreszenzintensitäten der Proben, wie in Schritt 8.2 beschrieben und berechnen Fluoreszenzverhältnisse. Verwenden Eichkurven-Verhältnisse in pH-Werte zu transformieren.

Ergebnisse

Für die gleichzeitige Messung von pH-Wert sowohl in der intrazellulären und der endosomalen / lysosomalen Zellkompartimenten wurden die ratiometrische Fluoreszenz-pH-Messfühler SNARF-1 und HPTS verwendet. SNARF-1 ist mit dem Zytosol beschränkt wohin HPTS ermöglicht ratiometrische pH-Messung der endosomalen / lysosomalen Kompartiment. Zellbeladung mit HPTS für 16 Stunden ermöglicht seine selektive Lokalisierung in Endosomen / Lysosomen ^4. Ein typisches Beispiel der Fluoreszenz von HT-1080-Zellen mit den pH-Mes...

Diskussion

Quantitative pH-Messung in lebenden Zellen von verschiedenen zellulären Kompartimenten wird benötigt, um pH-Schwankungen in Zell-Antworten auf externen Herausforderungen genau zu messen. Allerdings ist eine der größten Hürden, die bleibt, um einfach und gezielt zellulären Kompartimenten. In diesem Zusammenhang haben einige Studien den Einsatz von HPTS als intrazellulärer pH-Indikator durch Elektroporation oder Mikroinjektion in Zellen eingebracht ^8-10 hervorgehoben. Diese Techniken leiden unter schwerwiegende...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lösungen für die Kalibrierung
Natriumchlorid	Fischer	L-11621
Kaliumchlorid	Fischer	M-12445
D-Glukose (Dextrose)	Fischer	D16-1
Magnesiumsulfat	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Calciumchlorid-Dihydrat	Fischer	M-1612
Deionisiertes Wasser	N/A	N/A
Nigericin	Calbiochem	481990	Giftig durch Einatmen oder bei Berührung mit der Haut
Vor Licht geschützt bei 4 & Grad; C
Kulturschalen & leer 35 mm	BD Biosciences	354456
pH-Messsonden
8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (HPTS)	Life technologies	H-348	Bei Raumtemperatur von Licht fernhalten
5-(und-6)-Carboxyy SNARF®-1, Acetoxymethylester, Acetat	Life Technologies	C-1271	Von Licht und Luftfeuchtigkeit bei -20 Grad fernhalten; C
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Fischer	BP231-1	schädlich
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 100X
Kaliumchlorid	Fischer	M-12445	20 g
Natriumphosphat einbasisch	Fischer	S369-1	115 g
Kaliumphosphat einbasisch	J.T Baker	3246-01	20 g
Deionisiertes Wasser	N/A	N/A Auf	1 L
Autoklav bringen und pH-Wert auf 7,4	einstellen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Natriumchlorid	Fischer	L-11621	40,5 g
Entsalztes Wasser	N/A	N/A	Bringen Sie auf 5 L
pH-Modulatoren
Bafilomycin A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amilorid (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Ammoniumchlorid	Fischer	A649-500