Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Zusammenfassung

Es stehen mehrere Methoden zur Messung des intrazellulären pH-Werts zur Verfügung, aber nur sehr wenige davon ermöglichen die gleichzeitige Messung des zytoplasmatischen und organellären pH-Werts. Hier beschreiben wir detailliert eine schnelle und genaue Methode zur gleichzeitigen Messung des zytoplasmatischen und vesikulären pH-Werts durch ratiometrische Bildgebung lebender Zellen.

Zusammenfassung

Der intrazelluläre pH-Wert ist streng reguliert und es wurden Unterschiede im pH-Wert zwischen dem Zytoplasma und den Organellen berichtet¹. Die Regulierung des zellulären pH-Werts ist entscheidend für die homöostatische Kontrolle physiologischer Prozesse, zu denen gehören: Protein-, DNA- und RNA-Synthese, vesikulärer Transport, Zellwachstum und Zellteilung. Veränderungen der zellulären pH-Homöostase können zu nachteiligen funktionellen Veränderungen führen und das Fortschreiten verschiedener Krankheiten fördern². Für die Messung des intrazellulären pH-Werts stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, von denen jedoch nur sehr wenige die gleichzeitige Messung des pH-Werts im Zytoplasma und in Organellen ermöglichen. Hier beschreiben wir detailliert eine schnelle und genaue Methode zur gleichzeitigen Messung des zytoplasmatischen und organellären pH-Werts mittels konfokaler Mikroskopie an lebenden Zellen³. Dieses Ziel wird durch die Verwendung von zwei pH-empfindlichen ratiometrischen Farbstoffen erreicht, die eine selektive zelluläre Kompartimentpartitionierung aufweisen. Zum Beispiel ist SNARF-1 im Zytoplasma kompartimentiert, während HPTS in endosomalen/lysosomalen Organellen kompartimentiert ist. Obwohl HPTS häufig als zytoplasmatischer pH-Indikator verwendet wird, kann dieser Farbstoff nach seiner Aufnahme durch die Pinozytose spezifisch Vesikel entlang des endosomal-lysosomalen Weges markieren^3,4. Mit diesen pH-empfindlichen Sonden ist es möglich, den pH-Wert innerhalb des endozytären und zytoplasmatischen Kompartiments gleichzeitig zu messen. Die optimale Anregungswellenlänge von HPTS variiert je nach pH-Wert, während sie für SNARF-1 von der optimalen Emissionswellenlänge abhängt. Nach der Beladung mit SNARF-1 und HPTS werden die Zellen in verschiedenen pH-kalibrierten Lösungen kultiviert, um für jede Sonde eine pH-Standardkurve zu erstellen. Die Zellbildgebung durch konfokale Mikroskopie ermöglicht die Eliminierung von Artefakten und Hintergrundgeräuschen. Aufgrund der spektralen Eigenschaften von HPTS ist diese Sonde besser geeignet für die Messung des leicht sauren endosomalen Kompartiments oder zum Nachweis einer Alkalisierung der endosomen/lysosomalen Organellen. Diese Methode vereinfacht die Datenanalyse, verbessert die Genauigkeit von pH-Messungen und kann verwendet werden, um grundlegende Fragen im Zusammenhang mit der pH-Modulation während der Zellreaktion auf externe Herausforderungen zu beantworten.

Protokoll

1. Herstellung von Lösungen für Cellular pH-Kalibrierung

1. Fügen Sie die folgenden Verbindungen zu fünf separate 50 ml konische Röhrchen bis 5 Lösungen für die Kalibrierung verwendet werden vorbereitet:
   • NaCl (1 ml von 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml H ₂ 0)
   • KCl (6,75 ml 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml H ₂ 0)
   • Glucose (1 ml von 1 M D-Glucose) (1 M D-Glucose = 1,80 g in 10 ml H ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0,05 ml von 1 M MgSO ₄₎ (1 M MgSO ₄ = 1,20 g in 10 ml H ₂ 0)
   • 20 mM HEPES (1 ml von 1 M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml....

Ergebnisse

Für die gleichzeitige Messung von pH-Wert sowohl in der intrazellulären und der endosomalen / lysosomalen Zellkompartimenten wurden die ratiometrische Fluoreszenz-pH-Messfühler SNARF-1 und HPTS verwendet. SNARF-1 ist mit dem Zytosol beschränkt wohin HPTS ermöglicht ratiometrische pH-Messung der endosomalen / lysosomalen Kompartiment. Zellbeladung mit HPTS für 16 Stunden ermöglicht seine selektive Lokalisierung in Endosomen / Lysosomen ^4. Ein typisches Beispiel der Fluoreszenz von HT-1080-Zellen mit den pH-Mes.......

Diskussion

Quantitative pH-Messung in lebenden Zellen von verschiedenen zellulären Kompartimenten wird benötigt, um pH-Schwankungen in Zell-Antworten auf externen Herausforderungen genau zu messen. Allerdings ist eine der größten Hürden, die bleibt, um einfach und gezielt zellulären Kompartimenten. In diesem Zusammenhang haben einige Studien den Einsatz von HPTS als intrazellulärer pH-Indikator durch Elektroporation oder Mikroinjektion in Zellen eingebracht ^8-10 hervorgehoben. Diese Techniken leiden unter schwerwiegende.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lösungen für die Kalibrierung
Natriumchlorid	Fischer	L-11621
Kaliumchlorid	Fischer	M-12445
D-Glukose (Dextrose)	Fischer	D16-1
Magnesiumsulfat	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Calciumchlorid-Dihydrat	Fischer	M-1612
Deionisiertes Wasser	N/A	N/A
Nigericin	Calbiochem	481990	Giftig durch Einatmen oder bei Berührung mit der Haut
Vor Licht geschützt bei 4 & Grad; C
Kulturschalen & leer 35 mm	BD Biosciences	354456
pH-Messsonden
8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (HPTS)	Life technologies	H-348	Bei Raumtemperatur von Licht fernhalten
5-(und-6)-Carboxyy SNARF®-1, Acetoxymethylester, Acetat	Life Technologies	C-1271	Von Licht und Luftfeuchtigkeit bei -20 Grad fernhalten; C
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Fischer	BP231-1	schädlich
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 100X
Kaliumchlorid	Fischer	M-12445	20 g
Natriumphosphat einbasisch	Fischer	S369-1	115 g
Kaliumphosphat einbasisch	J.T Baker	3246-01	20 g
Deionisiertes Wasser	N/A	N/A Auf	1 L
Autoklav bringen und pH-Wert auf 7,4	einstellen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Natriumchlorid	Fischer	L-11621	40,5 g
Entsalztes Wasser	N/A	N/A	Bringen Sie auf 5 L
pH-Modulatoren
Bafilomycin A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amilorid (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Ammoniumchlorid	Fischer	A649-500