Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Zusammenfassung

Vor ein paar Jahren, die Einrichtung des menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) in eine neue Ära in der Biomedizin eingeläutet. Mögliche Verwendung von menschlichen iPS-Zellen umfassen Modellierung Pathogenese der menschlichen genetischen Erkrankungen, autologe Zelltherapie nach der Gen-Korrektur und personalisierte Wirkstoff-Screening durch eine Quelle von Patienten-spezifischen und Symptom relevanten Zellen. Allerdings gibt es einige Hürden zu überwinden, wie die Beseitigung der verbleibenden Umprogrammierung Faktor Transgen-Expression nach menschlichen iPS-Zellen-Produktion. Noch wichtiger ist, könnte Rest Transgen-Expression in undifferenzierten menschlichen iPS richtige Differenzierungen behindern und verleiten die Auslegung von krankheitsrelevanten In-vitro-Phänotypen. Mit diesem Grund haben die Integration frei und / oder Transgen-freien menschlichen iPS-Zellen mit verschiedenen Methoden, wie z. B. Adenovirus, der piggyBac System, Minicircle-Vektor, episomaler Vektoren, direkte Lieferung Protein entwickelt und synthetisiert mRNA. Jedoch Effizienz reprogrammierung mit Integration freie Verfahren ist in den meisten Fällen sehr gering.

Hier präsentieren wir eine Methode, um menschliche iPS-Zellen unter Verwendung von Sendai-Virus (RNA-Virus) auf der Basis Umprogrammierung System zu isolieren. Diese Umprogrammierung Methode zeigt, konsistente Ergebnisse und eine hohe Effizienz in kostengünstiger Weise.

Einleitung

Menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) haben eine Kapazität zur Selbsterneuerung in vitro und haben Pluripotenz, die potenziell nützlich für Krankheit Modellierung sein könnte, für Wirkstoff-Screening, und zellbasierte Therapien zu entwickeln, um Krankheiten und Gewebeverletzungen zu behandeln. Allerdings haben hESCs eine Beschränkung für die Zell-Ersatztherapie wegen der immunologischen, onkologischen und ethischen Schranken, und im Zusammenhang mit Krankheit Gene studieren, konnte krankheitsspezifische hESCs durch Präimplantations-Diagnostik (PID) Ansätze isoliert werden, aber es ist immer noch eine technische Herausforderung und die Embryo-Spende....

Protokoll

1. Herstellung von Zell und Medien (Tag 1)

1. Kultur und erweitern menschlichen Fibroblasten mit DMEM-Medium mit 10% FBS.
2. Teller menschlichen Fibroblasten (Abbildung 1) auf eine 24-Well-Platte auf der entsprechenden Dichte pro Well am Tag vor der Transduktion.
   HINWEIS: Die folgenden serielle Verdünnungen werden empfohlen (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K und 6.25K), weil verschiedene Zelltypen haben unterschiedliche Befestigungs Fähigkeit.
3. Die Zellen für einen Tag Inkubation in einem 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator, wodurch die Zellen vollflächig verklebt und erweitert.

Ergebnisse

Normalerweise infizierten Fibroblasten keine morphologischen Veränderungen in mehrere Tage nach Sendai-Virus-Transduktion zu zeigen, aber fünf Tage später, beginnen sie zu verschiedenen Formen (Abbildung 1) zu haben. Wie im rechten Teil der Abbildung 1 beschrieben, funktionieren Zellen nicht typisch Fibroblastenmorphologie mehr. Sie haben eine runde Form und größeren Kern als Zytoplasma. Auch bei Übertragungs wird in 80% zellulären Konfluenz durchgeführt wird, sieht es aus wie sie sind .......

Diskussion

Reprogrammierung menschlicher Körperzellen zu hiPSCs hält beispiellosen Versprechungen in Grundlagen der Biologie, persönliche Medizin, Transplantation und ^12. Zuvor benötigte menschlichen iPS Generationen DNA-Virus, das Integrationsrisiko in das Wirtsgenom, die unerwünschte genetische Mutationen, die weitere klinische Anwendungen wie Arzneimittelentwicklung und Transplantationstherapien ¹³ begrenzen erstellen hat. Mit aus diesem Grund haben viele Studien wurde berichtet, Vektor-und gentechnikfreie.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CytoTune-iPS Reprogrammierungskit	Invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, Neomycin-resistent, Mitomycin C behandelt	Globaler Stiel	GSC-6105M	5 x 105/6 cm oder 12,5 x 105/24-Well-Platte
Trypsin EDTA 0,25 % Trypsin mit EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 Medium	Invitrogen	11330-032
24-Well-Zellkulturplatte, flacher Boden mit Deckel	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μ M (Lagerbestand: 10 mM)
basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Lagerbestand: 100 μg)
Knock-out-Serumersatz	Gibco	10828028
Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), flüssig (hoher Glukose)	Invitrogen	11965118
Fötales Rinderserum	Thermo Scientific Fermentas	SH30071,03
L-Glutamin-200 mM (100X), flüssig	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Lösung nicht-essentieller Aminosäuren, 100X	LIFE TECHNOLOGIES		1/100
2-Mercaptoethanol (1.000X), flüssig	GIBCO	21985023	1/1.000
Hausser Phasenkontrast-Hämazytometer	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0,1% Gelatinelösung	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Cell Signaling	4745S	1/200
Maus monoklonaler Oct4 Antikörper	Santa Cruz	SC-5279	1/1.000
Nanog	R& D	AF1997	1/1.000
Alexa Flouor 488 Anti-Maus für Ziegen	Invitrogen	948492	1/2.000
DPBS (Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung), 1X ohne Kalzium & magnesium	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect Reverse Transkriptionskit	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
Zupfhaube	NuAire	NU-301
Präparierfernrohr	Nikon	SMZ745

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