Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Summary

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Abstract

Vor ein paar Jahren, die Einrichtung des menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) in eine neue Ära in der Biomedizin eingeläutet. Mögliche Verwendung von menschlichen iPS-Zellen umfassen Modellierung Pathogenese der menschlichen genetischen Erkrankungen, autologe Zelltherapie nach der Gen-Korrektur und personalisierte Wirkstoff-Screening durch eine Quelle von Patienten-spezifischen und Symptom relevanten Zellen. Allerdings gibt es einige Hürden zu überwinden, wie die Beseitigung der verbleibenden Umprogrammierung Faktor Transgen-Expression nach menschlichen iPS-Zellen-Produktion. Noch wichtiger ist, könnte Rest Transgen-Expression in undifferenzierten menschlichen iPS richtige Differenzierungen behindern und verleiten die Auslegung von krankheitsrelevanten In-vitro-Phänotypen. Mit diesem Grund haben die Integration frei und / oder Transgen-freien menschlichen iPS-Zellen mit verschiedenen Methoden, wie z. B. Adenovirus, der piggyBac System, Minicircle-Vektor, episomaler Vektoren, direkte Lieferung Protein entwickelt und synthetisiert mRNA. Jedoch Effizienz reprogrammierung mit Integration freie Verfahren ist in den meisten Fällen sehr gering.

Hier präsentieren wir eine Methode, um menschliche iPS-Zellen unter Verwendung von Sendai-Virus (RNA-Virus) auf der Basis Umprogrammierung System zu isolieren. Diese Umprogrammierung Methode zeigt, konsistente Ergebnisse und eine hohe Effizienz in kostengünstiger Weise.

Introduction

Menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) haben eine Kapazität zur Selbsterneuerung in vitro und haben Pluripotenz, die potenziell nützlich für Krankheit Modellierung sein könnte, für Wirkstoff-Screening, und zellbasierte Therapien zu entwickeln, um Krankheiten und Gewebeverletzungen zu behandeln. Allerdings haben hESCs eine Beschränkung für die Zell-Ersatztherapie wegen der immunologischen, onkologischen und ethischen Schranken, und im Zusammenhang mit Krankheit Gene studieren, konnte krankheitsspezifische hESCs durch Präimplantations-Diagnostik (PID) Ansätze isoliert werden, aber es ist immer noch eine technische Herausforderung und die Embryo-Spenden sind ziemlich selten. Diese Fragen werden an die Fortschritte in der Stammzellbiologie, die zur Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) geführt hat, zusammen.

Menschliche iPS sind genetisch aus menschlichen adulten somatischen Zellen umprogrammiert und Hafen pluripotente Stammzelle-ähnliche Funktionen ähnlich hESCs, der sie macht eine nützliche Quelle für die regenerative Medizin wie dTeppich Entdeckung, Krankheit Modellierung und Zelltherapie in Patienten-spezifischen Weise ^1,2.

Bis jetzt gibt es mehrere Methoden, um menschliche iPS-Zellen zu generieren, einschließlich Virus-vermittelte (Retrovirus und Adenovirus) ^3, nicht-Virus-vermittelte (BAC-System und Vektoren Transfektion) ^4-Gen Transduktionen und Protein-Liefersystem ^7.5.

Obwohl eine Lieferung von Virus-vermittelte Gene können ein gewisses Maß an Effizienz zu gewährleisten, konnte virale Vektoren genetischen Fußabdruck zu verlassen, weil sie in Wirts Chromosomen zu integrieren, um eine Anpassung Gene unkontrolliert auszudrücken. Selbst wenn virale Integration Transkriptionsfaktoren aktivieren oder inaktivieren Wirtsgene ⁸ kann eine unerwartete genetische Aberration und das Risiko von Tumorgenese ^5,9 verursachen. Auf der anderen Seite wurden die direkte Einführung von Proteinen oder RNA in somatische Zellen berichtet, haben aber einige Nachteile, wie arbeitsintensiv, wiederholt transfbschnitt, und niedrige Niveau der Umprogrammierung ^7,10. Auch episomal und nicht-integrierenden Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus und Plasmid-Vektoren sind noch relativ weniger effizient ^11. Aus diesen Gründen ist es plausibel, Nicht-Integration Umprogrammierung Verfahren mit hoher Wirksamkeit iPSC Erzeugung und weniger genetische Anomalien zu wählen. In dieser Studie verwenden wir ein Sendai-Virus-basierten Neuprogrammierung. Diese Methode ist bekannt, dass in das Wirtsgenom nicht integrierten und konsequent produziert menschlichen iPS-Zellen ohne Transgen-Integrationen.

Protocol

1. Herstellung von Zell und Medien (Tag 1)

1. Kultur und erweitern menschlichen Fibroblasten mit DMEM-Medium mit 10% FBS.
2. Teller menschlichen Fibroblasten (Abbildung 1) auf eine 24-Well-Platte auf der entsprechenden Dichte pro Well am Tag vor der Transduktion.
   HINWEIS: Die folgenden serielle Verdünnungen werden empfohlen (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K und 6.25K), weil verschiedene Zelltypen haben unterschiedliche Befestigungs Fähigkeit.
3. Die Zellen für einen Tag Inkubation in einem 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator, wodurch die Zellen vollflächig verklebt und erweitert.

2. Führen Transduction (Tag 2)

1. Am Tag der Transduktion, überprüfen Sie die Zelldichte und wählte die effizientesten Dichte Brunnen (Abbildung 2). Es ist besser, drei verschiedenen Dichten wählen: hoch (80 ~ 90%), Mitte (50 ~ 70%) und niedriger (20 ~ 40%).
2. Mindestens 1 Stunde vor Übertragungs absaugen fibroblast Medien aus den Zellen und verändern neue 300 ul von Fibroblasten-Medium.
3. Entfernen Sie einen Satz von 4 verschiedenen Sendai-Virus-Rohre von -80 ° C-Lagerung. Auftauen jedes Rohr in der gleichen Zeit in einem 37 ° C Wasserbad für einige Sekunden und dann die Rohre aus dem Wasserbad. Danach auftauen sie auf Raumtemperatur; Zentrifugenröhrchen bei 6000 g für 10 sec und legen sie auf Eis, bis Gebrauch. Wieder einfrieren und auftauen Sie nicht das Virus, da die Titer nicht aufrecht zu erhalten.
4. Hinzufügen der angegebenen Mengen von jedem der vier Röhrchen Sendai-Virus (Oct-4, Klf-4, c-Myc und Sox-2) auf den Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung auch durch Pipettieren vorsichtig gemischt.
   Zum Beispiel, wenn 50K Zellen / ein gut 24-Well-Platte für die Transduktion Lookwell:
   (Titer auf der Grundlage der Analysezertifikat von Life Technologies, kann von Charge zu Charge sein)
   Rohr hOct-4 = 6,0 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 5 ul
   Rohr hSox-2 = 6,5 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 4,6 μ; L
   Rohr hKlf-4 = 6,3 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 4,8 ul
   U-hc-Myc = 7,8 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 3,8 ul
   Total = 18,2 ul von vier Faktoren Virus Mischung / ein gut (50K-Zellen) von 24-Well-Platte
5. Je nach Zelldichte; hinzufügen 2X, 1X, 0,5 X und Volumen der Virusgemisch in den Brunnen. Schütteln Sie die Platte von vorne nach hinten, links und rechts (2X: 36,4 ul Virus Mischung, 1X: 18,2 ul 0,5 X und 9,1 ul).
6. Platzieren der Zellen in ein 37 º C, 5% CO _2-Inkubator über Nacht inkubieren.

3. Austausch von Kultur-Medium (Tag 3 und Tag 5)

1. 24 Stunden nach der Transduktion, ersetzen Sie das Medium mit 500 ul frisch Fibroblasten-Medium.
2. An Tag 5, verändern Medium mit frischen Fibroblasten-Medien.

4. Bereiten MEF Geschirr für die Co-Kultur (Tag 8)

1. Bereiten MEF-Zellen in 60 mm-Kulturschalen mit 10% FBS enthielt DMEM-Medium, da einy vor Passagieren des transduzierten Fibroblasten auf MEF Feeder-Zellen.
   Hinweis: Wir sind mit 5 x 10 ⁵ von MEF in jedem 60 mm-Schale.

5. Starten Co-Kultur Transduzierte MEF-Zellen mit Feeder-Zellen (Tag 9)

1. Vor der Beschichtung transduzierten Zellen absaugen 10% FBS enthielt DMEM-Medium von MEF Feeder-Gerichte und fügen Sie frisches 10% FBS DMEM-Medium enthalten ist.
2. Entfernen des Mediums von den transduzierten Fibroblasten, die in der 24-Well-Platte und wasche die Zellen einmal mit D-PBS. Nach Zugabe von 200 ul 0,25% Trypsin / EDTA in die Fibroblastenzellen inder 24-Well-Platte. Nach weniger als 5 min Inkubation mit Trypsin / EDTA, wenn die Zellen beginnen, von der Platte zu lösen, sammeln Sie die Zellen mit Wachstumsmedium in 15 ml konischen Röhrchen. Dann zentrifugieren in 6000 g für 4 min.
   HINWEIS: Die Bündelung 2X, 1X und 0,5 X Virus transduzierten Fibroblasten wird empfohlen.
3. Entfernen Sie das überstehende Medium und zu waschen, um erneut zu suspendierendas Zellpellet mit 4-5 ml frischem Fibroblasten-Medium für die Neutralisation von Trypsin. Dann zentrifugieren bei 135 × g für 4 min.
4. Platte Zellen als serielle Verdünnung Dichte und beginnen zu Kokultur mit Fibroblasten-Medium auf MEF: z. B. 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 und 1/128 pro 60 mm-Schale. Je nach Zellsterberate während der ersten Woche der Transduktion kann man nicht zu auf 1/2 oder 1/128 Dichte zu verdünnen. Beiseite verbleibenden Zellen Gesamt-RNA als Positivkontrolle für Transgene RT-PCR zu extrahieren.
5. Platz 60 mm Schalen in 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator über Nacht.

6. Feed-menschlichen embryonalen Stammzellen Medium und Überwachung der Zellen (Tag 10)

1. Am nächsten Tag ändern Fibroblasten-Medien auf menschliche ES-Medien mit 10 uM Y-27632. Danach ändern Medium täglich mit menschlichen ES-Medium: 800 ml + 200 ml DMEM/F12 Knockout Serumersatz + 10 ml L-Glutamin + 10 ml 10 mM MEM Mindest nicht-essentiellen Aminosäuren+ 1 ml 2-Mercaptoethanol + 10 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor.
2. Führen Sie eine tägliche Medienwechsel mit frischen menschlichen ES-Medien. Nach einer Woche, prüfen die Gerichte einmal pro 2 ~ 3 Tage unter einem Mikroskop für die Bildung von ES-Kolonie-wie Zellklumpen. Je nach Zelltyp, wird die Kultur mehr oder weniger Zeit in Anspruch nehmen, bevor Kolonien gefunden.

7. Picking die induzierten pluripotenten Stammzellen Kolonien und erweitern die Zellen (Tag 20 ~)

1. Drei Wochen nach Transduktion, sollte Kolonien richtig für die Kommissionierung gewachsen erscheinen.
2. Am Tag vor der Kommissionierung die Kolonien, bereiten MEF Feeder im 24-Well-Platte.
   HINWEIS: Wir sind mit 12,5 x 10 ⁵ von MEF in einer 24-Well-Platte.
3. Am nächsten Tag ändern Medium der MEF Gerichte aus Fibroblasten-Medien auf menschliche ES-Medien mit 10 uM Y-27632. Manuell holen eine Kolonie zu jeder Zeit unter dem Mikroskop in der Kommissionierung-Haube und machen kleinere Klumpen durch Pipettieren und übertragen Sie sieauf neu erstellten MEF dishes.Try mehrere Klone holen.
4. Passage und erweitern die jeweils auch von einer 24-Well-Platte mit einer 6-Well-Platte zunächst. Dann aus einer 6-Well-Platte auf eine 60-mm-Schalen, bevor die weitere Vermehrung.

8. Charakterisierung humaner iPS-Zellen (nach 10 Passagen)

1. Immunfluoreszenz
   1. Teller menschlichen iPS-Zellen in 24-Well-Platte und Kultur während 4-5 Tage mit täglichen Medienwechsel.
   2. Zum Starten Immunfluoreszenz-Test, waschen Sie die Platte mit D-PBS einmal. Dann fixieren Sie die Zellen sofort in 0,4% Paraformaldehyd für 30 min. Danach waschen dreimal in D-PBS für 5 min.
   3. Behandlung von fixierten Zellen mit 0,1% Triton X-100-Lösung in PBS für 15 min bei Raumtemperatur.
   4. Absaugen Permeabilisierung Lösung (0,1% Triton X-100-Lösung), dann mit 0,5% BSA-Blockierungslösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
   5. Führen Sie eine Erkennung von Nanog, Oct-4, SSEA (Stufe spezifischen embryonalen Antigde) und TRA-1 bis 81 (Tumorantigen) mit einem Anti-Human-Antikörper in 0,5% BSA-Lösung (überprüfen Sie die Materialtabelle für die Antikörperverdünnungsrate). Inkubieren des primären Antikörpers für 2 h bei Raumtemperatur. Dann waschen dreimal in D-PBS für jeweils 5 min.
   6. Überprüfen mittels Fluoreszenzmikroskopie nach 1 h Inkubation mit Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus-IgG-Antikörper als ^2. Antikörper, der 1:2000 in 0,5% BSA-Lösung bei Raumtemperatur verdünnt. Stain alle Kerne von je MEF Feeder-Zellen und hiPSCs mit DAPI.
2. RT-PCR von Transgene Bestätigung
   1. Auszug Gesamt-mRNA aus Zellpellet durch RNA-Extraktion mit Reagenzien.
   2. Ein Reverse Transkription von Aliquoten (1 ug) von Gesamt-RNA und die resultierende cDNA für die PCR-Amplifikation durch reverse Transkriptase.
   3. Die PCR-Gemische zu 2 ul cDNA-Matrize wurden 10 ul 2X PCR-Master-Mix, 2 &mgr; l von 2 pmol Primer enthalten(Vorwärts: 1 ul-und Rückwärts: 1 ul) und 6 ul der DW. Um die Genexpression zu erfassen, führen die RT-PCR mit den in Tabelle 1 angegebenen Primer.
   4. Führen die RT-PCR mit GAPDH-Gen als Kontrolle für die Effizienz der Amplifikationsreaktionen. Visualisieren und PCR-Produkt analysieren, um 1% Agarose-Gel-Elektrophorese.

Results

Normalerweise infizierten Fibroblasten keine morphologischen Veränderungen in mehrere Tage nach Sendai-Virus-Transduktion zu zeigen, aber fünf Tage später, beginnen sie zu verschiedenen Formen (Abbildung 1) zu haben. Wie im rechten Teil der Abbildung 1 beschrieben, funktionieren Zellen nicht typisch Fibroblastenmorphologie mehr. Sie haben eine runde Form und größeren Kern als Zytoplasma. Auch bei Übertragungs wird in 80% zellulären Konfluenz durchgeführt wird, sieht es aus wie sie sind ...

Discussion

Reprogrammierung menschlicher Körperzellen zu hiPSCs hält beispiellosen Versprechungen in Grundlagen der Biologie, persönliche Medizin, Transplantation und ^12. Zuvor benötigte menschlichen iPS Generationen DNA-Virus, das Integrationsrisiko in das Wirtsgenom, die unerwünschte genetische Mutationen, die weitere klinische Anwendungen wie Arzneimittelentwicklung und Transplantationstherapien ¹³ begrenzen erstellen hat. Mit aus diesem Grund haben viele Studien wurde berichtet, Vektor-und gentechnikfreie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CytoTune-iPS Reprogrammierungskit	Invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, Neomycin-resistent, Mitomycin C behandelt	Globaler Stiel	GSC-6105M	5 x 105/6 cm oder 12,5 x 105/24-Well-Platte
Trypsin EDTA 0,25 % Trypsin mit EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 Medium	Invitrogen	11330-032
24-Well-Zellkulturplatte, flacher Boden mit Deckel	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μ M (Lagerbestand: 10 mM)
basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Lagerbestand: 100 μg)
Knock-out-Serumersatz	Gibco	10828028
Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), flüssig (hoher Glukose)	Invitrogen	11965118
Fötales Rinderserum	Thermo Scientific Fermentas	SH30071,03
L-Glutamin-200 mM (100X), flüssig	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Lösung nicht-essentieller Aminosäuren, 100X	LIFE TECHNOLOGIES		1/100
2-Mercaptoethanol (1.000X), flüssig	GIBCO	21985023	1/1.000
Hausser Phasenkontrast-Hämazytometer	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0,1% Gelatinelösung	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Cell Signaling	4745S	1/200
Maus monoklonaler Oct4 Antikörper	Santa Cruz	SC-5279	1/1.000
Nanog	R& D	AF1997	1/1.000
Alexa Flouor 488 Anti-Maus für Ziegen	Invitrogen	948492	1/2.000
DPBS (Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung), 1X ohne Kalzium & magnesium	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect Reverse Transkriptionskit	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
Zupfhaube	NuAire	NU-301
Präparierfernrohr	Nikon	SMZ745