Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) haben eine Kapazität zur Selbsterneuerung in vitro und haben Pluripotenz, die potenziell nützlich für Krankheit Modellierung sein könnte, für Wirkstoff-Screening, und zellbasierte Therapien zu entwickeln, um Krankheiten und Gewebeverletzungen zu behandeln. Allerdings haben hESCs eine Beschränkung für die Zell-Ersatztherapie wegen der immunologischen, onkologischen und ethischen Schranken, und im Zusammenhang mit Krankheit Gene studieren, konnte krankheitsspezifische hESCs durch Präimplantations-Diagnostik (PID) Ansätze isoliert werden, aber es ist immer noch eine technische Herausforderung und die Embryo-Spenden sind ziemlich selten. Diese Fragen werden an die Fortschritte in der Stammzellbiologie, die zur Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) geführt hat, zusammen.

Menschliche iPS sind genetisch aus menschlichen adulten somatischen Zellen umprogrammiert und Hafen pluripotente Stammzelle-ähnliche Funktionen ähnlich hESCs, der sie macht eine nützliche Quelle für die regenerative Medizin wie dTeppich Entdeckung, Krankheit Modellierung und Zelltherapie in Patienten-spezifischen Weise ^1,2.

Bis jetzt gibt es mehrere Methoden, um menschliche iPS-Zellen zu generieren, einschließlich Virus-vermittelte (Retrovirus und Adenovirus) ^3, nicht-Virus-vermittelte (BAC-System und Vektoren Transfektion) ^4-Gen Transduktionen und Protein-Liefersystem ^7.5.

Obwohl eine Lieferung von Virus-vermittelte Gene können ein gewisses Maß an Effizienz zu gewährleisten, konnte virale Vektoren genetischen Fußabdruck zu verlassen, weil sie in Wirts Chromosomen zu integrieren, um eine Anpassung Gene unkontrolliert auszudrücken. Selbst wenn virale Integration Transkriptionsfaktoren aktivieren oder inaktivieren Wirtsgene ⁸ kann eine unerwartete genetische Aberration und das Risiko von Tumorgenese ^5,9 verursachen. Auf der anderen Seite wurden die direkte Einführung von Proteinen oder RNA in somatische Zellen berichtet, haben aber einige Nachteile, wie arbeitsintensiv, wiederholt transfbschnitt, und niedrige Niveau der Umprogrammierung ^7,10. Auch episomal und nicht-integrierenden Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus und Plasmid-Vektoren sind noch relativ weniger effizient ^11. Aus diesen Gründen ist es plausibel, Nicht-Integration Umprogrammierung Verfahren mit hoher Wirksamkeit iPSC Erzeugung und weniger genetische Anomalien zu wählen. In dieser Studie verwenden wir ein Sendai-Virus-basierten Neuprogrammierung. Diese Methode ist bekannt, dass in das Wirtsgenom nicht integrierten und konsequent produziert menschlichen iPS-Zellen ohne Transgen-Integrationen.

1. Herstellung von Zell und Medien (Tag 1)

1. Kultur und erweitern menschlichen Fibroblasten mit DMEM-Medium mit 10% FBS.
2. Teller menschlichen Fibroblasten (Abbildung 1) auf eine 24-Well-Platte auf der entsprechenden Dichte pro Well am Tag vor der Transduktion.
   HINWEIS: Die folgenden serielle Verdünnungen werden empfohlen (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K und 6.25K), weil verschiedene Zelltypen haben unterschiedliche Befestigungs Fähigkeit.
3. Die Zellen für einen Tag Inkubation in einem 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator, wodurch die Zellen vollflächig verklebt und erweitert.

2. Führen Transduction (Tag 2)

1. Am Tag der Transduktion, überprüfen Sie die Zelldichte und wählte die effizientesten Dichte Brunnen (Abbildung 2). Es ist besser, drei verschiedenen Dichten wählen: hoch (80 ~ 90%), Mitte (50 ~ 70%) und niedriger (20 ~ 40%).
2. Mindestens 1 Stunde vor Übertragungs absaugen fibroblast Medien aus den Zellen und verändern neue 300 ul von Fibroblasten-Medium.
3. Entfernen Sie einen Satz von 4 verschiedenen Sendai-Virus-Rohre von -80 ° C-Lagerung. Auftauen jedes Rohr in der gleichen Zeit in einem 37 ° C Wasserbad für einige Sekunden und dann die Rohre aus dem Wasserbad. Danach auftauen sie auf Raumtemperatur; Zentrifugenröhrchen bei 6000 g für 10 sec und legen sie auf Eis, bis Gebrauch. Wieder einfrieren und auftauen Sie nicht das Virus, da die Titer nicht aufrecht zu erhalten.
4. Hinzufügen der angegebenen Mengen von jedem der vier Röhrchen Sendai-Virus (Oct-4, Klf-4, c-Myc und Sox-2) auf den Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung auch durch Pipettieren vorsichtig gemischt.
   Zum Beispiel, wenn 50K Zellen / ein gut 24-Well-Platte für die Transduktion Lookwell:
   (Titer auf der Grundlage der Analysezertifikat von Life Technologies, kann von Charge zu Charge sein)
   Rohr hOct-4 = 6,0 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 5 ul
   Rohr hSox-2 = 6,5 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 4,6 μ; L
   Rohr hKlf-4 = 6,3 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 4,8 ul
   U-hc-Myc = 7,8 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 3,8 ul
   Total = 18,2 ul von vier Faktoren Virus Mischung / ein gut (50K-Zellen) von 24-Well-Platte
5. Je nach Zelldichte; hinzufügen 2X, 1X, 0,5 X und Volumen der Virusgemisch in den Brunnen. Schütteln Sie die Platte von vorne nach hinten, links und rechts (2X: 36,4 ul Virus Mischung, 1X: 18,2 ul 0,5 X und 9,1 ul).
6. Platzieren der Zellen in ein 37 º C, 5% CO _2-Inkubator über Nacht inkubieren.

3. Austausch von Kultur-Medium (Tag 3 und Tag 5)

1. 24 Stunden nach der Transduktion, ersetzen Sie das Medium mit 500 ul frisch Fibroblasten-Medium.
2. An Tag 5, verändern Medium mit frischen Fibroblasten-Medien.

4. Bereiten MEF Geschirr für die Co-Kultur (Tag 8)

1. Bereiten MEF-Zellen in 60 mm-Kulturschalen mit 10% FBS enthielt DMEM-Medium, da einy vor Passagieren des transduzierten Fibroblasten auf MEF Feeder-Zellen.
   Hinweis: Wir sind mit 5 x 10 ⁵ von MEF in jedem 60 mm-Schale.

5. Starten Co-Kultur Transduzierte MEF-Zellen mit Feeder-Zellen (Tag 9)

1. Vor der Beschichtung transduzierten Zellen absaugen 10% FBS enthielt DMEM-Medium von MEF Feeder-Gerichte und fügen Sie frisches 10% FBS DMEM-Medium enthalten ist.
2. Entfernen des Mediums von den transduzierten Fibroblasten, die in der 24-Well-Platte und wasche die Zellen einmal mit D-PBS. Nach Zugabe von 200 ul 0,25% Trypsin / EDTA in die Fibroblastenzellen inder 24-Well-Platte. Nach weniger als 5 min Inkubation mit Trypsin / EDTA, wenn die Zellen beginnen, von der Platte zu lösen, sammeln Sie die Zellen mit Wachstumsmedium in 15 ml konischen Röhrchen. Dann zentrifugieren in 6000 g für 4 min.
   HINWEIS: Die Bündelung 2X, 1X und 0,5 X Virus transduzierten Fibroblasten wird empfohlen.
3. Entfernen Sie das überstehende Medium und zu waschen, um erneut zu suspendierendas Zellpellet mit 4-5 ml frischem Fibroblasten-Medium für die Neutralisation von Trypsin. Dann zentrifugieren bei 135 × g für 4 min.
4. Platte Zellen als serielle Verdünnung Dichte und beginnen zu Kokultur mit Fibroblasten-Medium auf MEF: z. B. 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 und 1/128 pro 60 mm-Schale. Je nach Zellsterberate während der ersten Woche der Transduktion kann man nicht zu auf 1/2 oder 1/128 Dichte zu verdünnen. Beiseite verbleibenden Zellen Gesamt-RNA als Positivkontrolle für Transgene RT-PCR zu extrahieren.
5. Platz 60 mm Schalen in 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator über Nacht.

6. Feed-menschlichen embryonalen Stammzellen Medium und Überwachung der Zellen (Tag 10)

1. Am nächsten Tag ändern Fibroblasten-Medien auf menschliche ES-Medien mit 10 uM Y-27632. Danach ändern Medium täglich mit menschlichen ES-Medium: 800 ml + 200 ml DMEM/F12 Knockout Serumersatz + 10 ml L-Glutamin + 10 ml 10 mM MEM Mindest nicht-essentiellen Aminosäuren+ 1 ml 2-Mercaptoethanol + 10 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor.
2. Führen Sie eine tägliche Medienwechsel mit frischen menschlichen ES-Medien. Nach einer Woche, prüfen die Gerichte einmal pro 2 ~ 3 Tage unter einem Mikroskop für die Bildung von ES-Kolonie-wie Zellklumpen. Je nach Zelltyp, wird die Kultur mehr oder weniger Zeit in Anspruch nehmen, bevor Kolonien gefunden.

7. Picking die induzierten pluripotenten Stammzellen Kolonien und erweitern die Zellen (Tag 20 ~)

1. Drei Wochen nach Transduktion, sollte Kolonien richtig für die Kommissionierung gewachsen erscheinen.
2. Am Tag vor der Kommissionierung die Kolonien, bereiten MEF Feeder im 24-Well-Platte.
   HINWEIS: Wir sind mit 12,5 x 10 ⁵ von MEF in einer 24-Well-Platte.
3. Am nächsten Tag ändern Medium der MEF Gerichte aus Fibroblasten-Medien auf menschliche ES-Medien mit 10 uM Y-27632. Manuell holen eine Kolonie zu jeder Zeit unter dem Mikroskop in der Kommissionierung-Haube und machen kleinere Klumpen durch Pipettieren und übertragen Sie sieauf neu erstellten MEF dishes.Try mehrere Klone holen.
4. Passage und erweitern die jeweils auch von einer 24-Well-Platte mit einer 6-Well-Platte zunächst. Dann aus einer 6-Well-Platte auf eine 60-mm-Schalen, bevor die weitere Vermehrung.

8. Charakterisierung humaner iPS-Zellen (nach 10 Passagen)

1. Immunfluoreszenz
   1. Teller menschlichen iPS-Zellen in 24-Well-Platte und Kultur während 4-5 Tage mit täglichen Medienwechsel.
   2. Zum Starten Immunfluoreszenz-Test, waschen Sie die Platte mit D-PBS einmal. Dann fixieren Sie die Zellen sofort in 0,4% Paraformaldehyd für 30 min. Danach waschen dreimal in D-PBS für 5 min.
   3. Behandlung von fixierten Zellen mit 0,1% Triton X-100-Lösung in PBS für 15 min bei Raumtemperatur.
   4. Absaugen Permeabilisierung Lösung (0,1% Triton X-100-Lösung), dann mit 0,5% BSA-Blockierungslösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
   5. Führen Sie eine Erkennung von Nanog, Oct-4, SSEA (Stufe spezifischen embryonalen Antigde) und TRA-1 bis 81 (Tumorantigen) mit einem Anti-Human-Antikörper in 0,5% BSA-Lösung (überprüfen Sie die Materialtabelle für die Antikörperverdünnungsrate). Inkubieren des primären Antikörpers für 2 h bei Raumtemperatur. Dann waschen dreimal in D-PBS für jeweils 5 min.
   6. Überprüfen mittels Fluoreszenzmikroskopie nach 1 h Inkubation mit Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus-IgG-Antikörper als ^2. Antikörper, der 1:2000 in 0,5% BSA-Lösung bei Raumtemperatur verdünnt. Stain alle Kerne von je MEF Feeder-Zellen und hiPSCs mit DAPI.
2. RT-PCR von Transgene Bestätigung
   1. Auszug Gesamt-mRNA aus Zellpellet durch RNA-Extraktion mit Reagenzien.
   2. Ein Reverse Transkription von Aliquoten (1 ug) von Gesamt-RNA und die resultierende cDNA für die PCR-Amplifikation durch reverse Transkriptase.
   3. Die PCR-Gemische zu 2 ul cDNA-Matrize wurden 10 ul 2X PCR-Master-Mix, 2 &mgr; l von 2 pmol Primer enthalten(Vorwärts: 1 ul-und Rückwärts: 1 ul) und 6 ul der DW. Um die Genexpression zu erfassen, führen die RT-PCR mit den in Tabelle 1 angegebenen Primer.
   4. Führen die RT-PCR mit GAPDH-Gen als Kontrolle für die Effizienz der Amplifikationsreaktionen. Visualisieren und PCR-Produkt analysieren, um 1% Agarose-Gel-Elektrophorese.

Normalerweise infizierten Fibroblasten keine morphologischen Veränderungen in mehrere Tage nach Sendai-Virus-Transduktion zu zeigen, aber fünf Tage später, beginnen sie zu verschiedenen Formen (Abbildung 1) zu haben. Wie im rechten Teil der Abbildung 1 beschrieben, funktionieren Zellen nicht typisch Fibroblastenmorphologie mehr. Sie haben eine runde Form und größeren Kern als Zytoplasma. Auch bei Übertragungs wird in 80% zellulären Konfluenz durchgeführt wird, sieht es aus wie sie sind weniger in der konfluenten gut, nachdem sie beginnen, neu zu programmieren. Wenn diese Art von morphologischen Veränderungen beginnen, in der die meisten der gut zu erkennen ist, sind transduzierten Fibroblasten bereit, auf MEF-Feeder-Kulturschalen plattiert werden.

In unserem Protokoll, minimiert wir Zellkultur Skala und gab auch verschiedene Möglichkeiten Reprogrammierung, wie Fibroblasten, die unterschiedliche Zelldichte und Viren-Titer und die anschließende Re-Beschichtung mehrere Verhältnis MEF, die hiPSCs Erzeugungseffizienz erhöhen wird (

Zu Beginn der Umprogrammierung auf MEF Feeder, ist es schwer zu transduzierten Zelltypen zu unterscheiden, aber nach über einer Woche Co-Kultur, erscheinen teilweise neu programmiert Fibroblasten und sehen aus wie gelockert ES-ähnliche Form (Abbildung 3). Aus diesem Grund, wenn menschliche iPS-Kolonien sind bereit für die Passage in neue MEF Feeder-Gericht, ist die manuelle Kommissionierung effizienter Weg für die Übertragung statt Spaltung mit dem Enzym.

In Abbildung 3 und Abbildung 4, unter dem Mikroskop nur menschliche iPS-Zellen haben klare Kanten, die eine klare Unterscheidung zwischen menschlichen iPS-Zellen (als 'völlig neu programmiert Zellen "betrachtet) und" unvollständig Zellen umprogrammiert' von Morphologie zu machen. Komplett neu programmiert Zellen look, wie kompakt und dicht verpackt. Vor allem die Kolonien haben klare Grenze, während teilweise neu programmiert Zellen aussehen versammeln, um Kolonie zu machen, aber sehr zerbrechlich zu verlieren und zu brechen. Selbst wenn wir eine Pipettieren vorsichtig tun, es ist leicht gelöst. Auch nach dem Ausschluss teilweise umprogrammiert menschlichen iPS-Zellen Kolonien (während sie erweitern und Passagieren), müssen vollständig neu programmiert menschlichen iPS-Zellen, die von der manuellen Kommissionierung gepflegt werden.

Nach der Kommissionierung Kolonien und den Ausbau hiPSC Klone in mehreren Wochen, Ausdruck stemness Marker bestimmt werden muss. Nach dem Ausbau der hiPSC Klone, haben wir sie überprüfen mit verschiedenen Gruppen von Tests, einschließlich Antikörperfärbung (SSEA4, Oct-4, TRA-81 und Nanog) und RT-PCR von pluripotenten Marker (Daten nicht gezeigt) als eine Qualitätskontrolle.

Im Vergleich zu H9, sind zwei verschiedene hiPSCs positiv SSEA4, Oct-4, TRA-81, und Nanog. Dieses Ergebnis zeigt, dass isolierte menschliche pluripotente iPS erworben Qualität (

Schließlich Abbildung 6 zeigt, dass wir keine Expression des Transgens in hiPSC Klone nicht erkennen, durch RT-PCR. Zumindest über 10 Passagen hiPSCs, spezifischen Primern (Tabelle 1) für exogene Oct-4, Sox-2, Klf-4 und c-Myc mit positiven Kontrollproben mit starker Expression des Transgens Ebene verwendet werden.

Abbildung 1. Morphologische Veränderung nach Sendai-Virus-Transduktion. Vor der Transduktion, Fibroblasten zeigen typische spindelförmig (links). Etwa acht Tage nach Transduktion, Morphologie der transduzierten Zellwechsel wie viel mehr runde Form (rechts). Bitte klicken Sie hehe um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Diagramm der Einarbeitungsplan, um maximale Effizienz zu gewährleisten. Über vier verschiedene Zelltypen können in einer 24-Well-Platte überzogen werden (von 1 bis 4). Da ihre Befestigung und Zellüberlebensfähigkeit könnte abhängig von den verschiedenen Zelltypen sein, wird vorgeschlagen, unterschiedliche Zelldichte (von 200 K bis 6.25K Zellen pro Vertiefung) zu plattieren. Darüber hinaus kann Viruskonzentration eingestellt werden (0,5 X, 1X und 2X).

Abbildung 3. Bildung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen Zellkolonie aus transduzierten fibroblast. In etwa zwei Wochen nach der erneuten Plattierung sie in MEFs, sollte umgehen Kolonien erscheinen und sehen aus wie menschliche embryonale Stammzellkolonien. Normalerweise werden die vollständig neu programmiert menschlichen iPS-Kolonien haben sehr klare Grenzen. (Pfeil: vollständig neu programmiert menschlichen iPS Kolonien, Pfeilspitze: teilweise neu programmiert menschlichen iPS-Zellen). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 4. Picking up menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen Zellkolonien. Menschliche iPS Kolonien werden oft von teilweise neu programmiert Zellen (links) umgeben ist. Unter dem Mikroskop, Kommissionierung der ES-Kolonie nur wie, brechen in kleine Klumpen und dann Übertragung (rechts). Nach 2 bis 3 Passagen, es sind undifferenzierte hiPSC Kolonien (unten und links). (Pfeil: vollständig neu programmiert menschlichen iPS Kolonien, Pfeilspitze: teilweise neu programmiert menschlichen iPS-Zellen) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 5. Immunfluoreszenzfärbung mit pluripotenten Stammzellmarker. Immunfluoreszenz-Test zeigt menschliche iPS-Zellen haben stemness features.SSEA-4, TRA-81, Nanog, Oct-4as pluripotenten Marker und DAPI ist eine Steuerung für Kernfärbung. (A) stellt H9-Färbung als eine Kontrollprobe. (B) und (C) zeigen menschlichen iPS-Klone.et = "_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

6. Bestätigung der Transgenexpression Ebene. Spätestens nach 10 Gang Kultur menschlicher iPSCs, Silencing von exogenen Sox2, Klf-4, c-Myc und Oct-4-Genexpression wird durch reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion bestätigt. hGAPDH ist eine interne Kontrolle. Für eine positive Kontrolle wird RNA aus Rest transduzierten Fibroblasten (Tag 7 nach der Sendai-Virus-Infektion) extrahiert. (Spur 1: Marker, Spuren 2-6: GAPDH, Klf4, c-Myc, Oct-4, Sox-2 und in Positiv-Kontrolle, Bahnen 7-11: GAPDH, Klf4, c-Myc, Oct-4 und Sox -2 in hiPSCs).

Tabelle 1. RT-PCR-Primer für Transgen Bestätigung. Sind die Primer-Sequenzen, die für tra verwendet werden,NsGene Bestätigung. T m 50,6 ° C in allen Primer-Sets.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.