Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Zusammenfassung

Einzelzell-Genexpression Test wird für das Verständnis der Stammzell Heterogenitäten benötigt.

Zusammenfassung

Heterogenität der Stammzellpopulation erschwert detailliertes Verständnis der Stammzellbiologie, wie ihre Neigung zur Differenzierung verschiedener Linien. Eine einzelne Zelle Transkriptom-Test kann ein neuer Ansatz zum Präparieren individuelle Variation sein. Wir haben die Einzelzelle qRT-PCR-Verfahren entwickelt und bestätigt, dass diese Methode funktioniert auch in mehreren Genexpressionsprofilen. In Einzelzellebene, die jeweils mit menschlichen embryonalen Stammzellen, sortiert nach OCT4 :: EGFP-positiven Zellen, hat eine hohe Expression in OCT4, aber eine andere Ebene der NANOG Ausdruck. Unsere Einzelzell Genexpression Test sollte sinnvoll, Heterogenitäten Bevölkerung zu befragen sein.

Einleitung

Meisten höheren Eukaryonten sind heterogene Populationen somit Analyse einer gepoolten Population, ist es oft schwierig, ihre zellulären Funktionen interpretiert. Einzelnen Zellen in einer Population kann leicht unterschiedliche sein, und diese Unterschiede können wichtige Konsequenzen für die Eigenschaft und Funktion der gesamten Population ^{1 und 2} haben. Insbesondere werden humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) bekannt heterogene, die verschiedenen Ebenen der Pluripotenz und vielfältige Potenziale zur Linie Spezifikation in zart unterschiedlichen Wegen ^{3, 4} verursacht sein. Zum Beispiel können verschiedene Zelloberflächenantigene verwen....

Protokoll

1. Herstellung einer Platte mit 96 Vertiefungen

1. Mischen Sie 1 ul Single Cell DNase1 bis 9 ul Single Cell Lysis Solution.
2. Setzen Sie die 10 ul Mischlösung in jede Vertiefung der 96-Well-PCR-Platte.

2. Abnehmen hESCs für die FACS-Reinigung

1. Nehmen OCT4 :: EGFP ES-Zelllinie aus der 60-mm-Schale mit 1 ml Accutase für 20 min bei 37 ° C, die mit menschlichen ES-Medien neutralisiert wurden.
2. Vorbereitung Zellpopulation in 1 ml FACS-Puffer und Einstellen der Zelle auf 1 x 10 ⁶ Zellen / ml.
3. Übergeben Sie die Zellprobe durch eine 35 um Zellsieb Kappe Röhre.
4. Lagern....

Ergebnisse

Effiziente und robuste Einzelzelle RNA-Amplifikation

Um die Unterschiede zwischen den Transkriptions hESCs zu minimieren, haben wir OCT4 :: EGFP hES-Klon für FACS Reinigung. Nach dem Sortieren OCT4 :: EGFP positive Zellen in eine 96-Well-Platte wird jede Zelle in Lysepuffer lysiert, und konvertiert die Poly (A) + RNA zu cDNA voller Länge unter Verwendung von SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) Primer und Verankerung mit SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) unter Ver.......

Diskussion

Einzelzell-Gen-Profiling könnte ein wichtiges Instrument, um die Funktionalität einer einzelnen Zelle oder eine ganze Bevölkerung vorherzusagen. Aufgrund technischer Einschränkung, hat ganze Gen-Profiling-Analyse wurde die Bevölkerungsdurchschnittswerte beschränkt. Variationen in Genexpressionsmustern und Ebenen zwischen den einzelnen Zellen und den Subpopulationen wurden vorgeschlagen, um Fehlinterpretationen führen. Solche vielfältigen zellulären Aspekte in hESCs gefunden werden und ihre Heterogenität verursacht leich.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
96-Well-PCR-Platte	USA scientific	1402-8900
Ambion Cell Lysis Kit	Life Technologies	4458235
SMARTScribe Reverse Transkriptase	Clonetech	639536
ExoSAP-IT	USB	78200
Platinum Taq DNA-Polymerase High Fidelity	Invitrogen	11304
10 mM dNTP Mix, PCR Grade	Invitrogen	18427
SYBR Universal 2X Master Mix	Kapa Biosystem	KR0389
Accutase	Innovative Cell Tech	S-1100-1
FACS Puffer			45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μ l DNase, Filter sterilisiert
35 μ m cell Siebdeckel Röhrchen	BD Biosciences	352235