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Methodenartikel

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

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DOI:

10.3791/51408

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29. Mai 2014

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Einzelzell-Genexpression Test wird für das Verständnis der Stammzell Heterogenitäten benötigt.

Zusammenfassung

Heterogenität der Stammzellpopulation erschwert detailliertes Verständnis der Stammzellbiologie, wie ihre Neigung zur Differenzierung verschiedener Linien. Eine einzelne Zelle Transkriptom-Test kann ein neuer Ansatz zum Präparieren individuelle Variation sein. Wir haben die Einzelzelle qRT-PCR-Verfahren entwickelt und bestätigt, dass diese Methode funktioniert auch in mehreren Genexpressionsprofilen. In Einzelzellebene, die jeweils mit menschlichen embryonalen Stammzellen, sortiert nach OCT4 :: EGFP-positiven Zellen, hat eine hohe Expression in OCT4, aber eine andere Ebene der NANOG Ausdruck. Unsere Einzelzell Genexpression Test sollte sinnvoll, Heterogenitäten Bevölkerung zu befragen sein.

Einleitung

Meisten höheren Eukaryonten sind heterogene Populationen somit Analyse einer gepoolten Population, ist es oft schwierig, ihre zellulären Funktionen interpretiert. Einzelnen Zellen in einer Population kann leicht unterschiedliche sein, und diese Unterschiede können wichtige Konsequenzen für die Eigenschaft und Funktion der gesamten Population 1 und 2 haben. Insbesondere werden humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) bekannt heterogene, die verschiedenen Ebenen der Pluripotenz und vielfältige Potenziale zur Linie Spezifikation in zart unterschiedlichen Wegen 3, 4 verursacht sein. Zum Beispiel können verschiedene Zelloberflächenantigene verwendet, um undifferenzierte pluripotente Stammzellen zu kategorisieren, 5 und der Austin Smith Gruppe vorgeschlagenen verschiedenen Ebenen der Pluripotenz in embryonalen Stammzellen der Maus anhand ihrer Morphologie, Differenzierung Neigung und Abhängigkeit von Signalwegs 6. Dieses Phänomen wurde in menschlichen Embryo Hypothese aufgestellt,nic Stammzellen 7. Während die Gesamt Studien wurden zwischen verschiedenen Stammzelllinien, nicht individuelle Einzel Stammzellen durchgeführt wird, könnte es sehr interessant sein, verschiedene Ebenen der Pluripotenz auf Einzelzellebene, die möglicherweise Auswirkungen auf ihre Differenzierungsmöglichkeiten gegenüber allen somatischen Zelllinien zu analysieren.

Zelluläre und molekulare Heterogenität könnte durch Transkriptionsprofilierung diktiert werden, die aufgerufen wird, die "einzelne Zelle Transkriptom" und betont, neue Ansätze zur Quantifizierung der Genexpression 10.08. Für die Analyse der Genexpression in einzelnen Zellen, wir eine einfache, aber robuste Protokoll von Einzelzell quantitative RT-PCR entwickelt. Wir bestätigten die Wirksamkeit und Durchführbarkeit von unserem Protokoll, indem jeder die Hälfte der Einzel Zelllysaten sowie seriell verdünnt Gesamt-RNAs von HES, was zu minimalen technischen Variationen und Unterschiede. Ferner haben wir eine genetische Linie Reporter homogene p isolierenEVÖLKERUNG von HES mit Gen-Targeting-System. Der Donor-Vektor für die Ausrichtung OCT4 Locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro-Konstrukt) und ein Paar von TALEN Plasmide wurden verwendet, 11. Der Spender Vektor und ein Paar TALEN Plasmide wurden in hESCs (H9, WA09) mit unserem Nukleofektion und klonalen Protokoll und Wartung von HES wurde auf der Grundlage unserer Routine-Protokoll 12 durchgeführt wird eingeführt. Wir bestätigten diese genetische Reporter Linie exprimieren EGFP für OCT4 Ausdruck in OCT4 :: EGFP hESCs.

Unser Ergebnis zeigt, dass die einzelnen HES (sortiert nach OCT4 :: EGFP stark positive Zellen) halten hohe OCT4 Ausdruck, aber verschiedene Ebenen der NANOG Ausdruck. Also, sollten Sie unsere Einzelzelle Genexpression Test sinnvoll, Bevölkerung Heterogenitäten von pluripotenten Stammzellen zu studieren.

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Protokoll

1. Herstellung einer Platte mit 96 Vertiefungen

  1. Mischen Sie 1 ul Single Cell DNase1 bis 9 ul Single Cell Lysis Solution.
  2. Setzen Sie die 10 ul Mischlösung in jede Vertiefung der 96-Well-PCR-Platte.

2. Abnehmen hESCs für die FACS-Reinigung

  1. Nehmen OCT4 :: EGFP ES-Zelllinie aus der 60-mm-Schale mit 1 ml Accutase für 20 min bei 37 ° C, die mit menschlichen ES-Medien neutralisiert wurden.
  2. Vorbereitung Zellpopulation in 1 ml FACS-Puffer und Einstellen der Zelle auf 1 x 10 6 Zellen / ml.
  3. Übergeben Sie die Zellprobe durch eine 35 um Zellsieb Kappe Röhre.
  4. Lagern Sie das Röhrchen in Eis vor der Zellsortierung.

3. Lyse der FACS-gereinigte Single Cell in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte

  1. Sortieren Sie die Probe für die EGFP-positiven Zellen auf einem Zellsortierer mit einem geschulten Bediener. Setzen Sie die einzelne Zelle in Einzelzell Lysis/DNase1 Lösung in 96-Well-PCR-Platte. Wenn nötig, die 96-Well-Platte mit der Probe in einem -80 ° C Gefrierschrank weniger als einen Monat aufbewahrt werden.
  2. Inkubiere die Proben 5 min bei RT Zelllyse.
  3. 1 ul-Stop-Lösung, um die Lyse Reaktion zu stoppen.
  4. Inkubation 2 min bei RT.

4. Reverse Transkription

  1. In den jeweils einer 0,5 ul Aliquot von 20 uM SMA-T15, SMA-A.
  2. In 4 ul 5X-Puffer, 2 ul DTT, 1 ul Reverse Transkriptase und 1 ul dNTP in jede Vertiefung.
  3. Führen reverse Transkription in einem Thermocycler.
    1. Stellen Sie die thermische Programm bei 42 ° C × 90 min inaktiviert und Reverse Transkriptase bei 85 ° C × 5 min.

5. Amplification

  1. In 4 ul ExoSAP-IT-Reagenz zu jedem umkehren transkribiert Probe.
    1. Proben bei 37 ° C für 15 min und 80 ° C für 15 min, um die ExoSAP IT-Reagenz zu inaktivieren.
  2. Bereiten PCR-Reaktionsmischung with SMA-p2 (2 nM)
  3. In 10 ul PCR-Reaktionsmischung zu jedem Reverse Transkription Probe.
  4. Führen die Verstärkung, bestehend aus 20 Zyklen von Denaturierung (94 ° C für 30 Sekunden), Annealing (57 ° C für 30 Sekunden) und Verlängerung (68 ° C für 10 min).

6. QRT-PCR Leistungs

  1. In 10 ul 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul amplifizierte cDNA, 2 nM Primer und 7 ul Wasser in jede Vertiefung.
    1. Stellen Sie das Programm, gefolgt von 95 ° C für 3 Sekunden, 60 ° C für 30 sec x 40 Zyklen.
  2. Führen Sie in zweifacher Ausfertigung für technische Fehler.

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Ergebnisse

Effiziente und robuste Einzelzelle RNA-Amplifikation

Um die Unterschiede zwischen den Transkriptions hESCs zu minimieren, haben wir OCT4 :: EGFP hES-Klon für FACS Reinigung. Nach dem Sortieren OCT4 :: EGFP positive Zellen in eine 96-Well-Platte wird jede Zelle in Lysepuffer lysiert, und konvertiert die Poly (A) + RNA zu cDNA voller Länge unter Verwendung von SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) Primer und Verankerung mit SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) unter Ver...

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Diskussion

Einzelzell-Gen-Profiling könnte ein wichtiges Instrument, um die Funktionalität einer einzelnen Zelle oder eine ganze Bevölkerung vorherzusagen. Aufgrund technischer Einschränkung, hat ganze Gen-Profiling-Analyse wurde die Bevölkerungsdurchschnittswerte beschränkt. Variationen in Genexpressionsmustern und Ebenen zwischen den einzelnen Zellen und den Subpopulationen wurden vorgeschlagen, um Fehlinterpretationen führen. Solche vielfältigen zellulären Aspekte in hESCs gefunden werden und ihre Heterogenität verursacht leich...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir möchten den Mitgliedern des Lee-Labor für wertvolle Diskussionen zum Manuskript danken. Die Arbeit im Labor Lee wurde durch Zuschüsse von Robertson Investigator Award der New York Stem Cell Foundation und von Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-PCR-PlatteUSA scientific1402-8900
Ambion Cell Lysis KitLife Technologies4458235
SMARTScribe Reverse TranskriptaseClonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
Platinum Taq DNA-Polymerase High FidelityInvitrogen11304
10 mM dNTP Mix, PCR GradeInvitrogen18427
SYBR Universal 2X Master MixKapa BiosystemKR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
FACS Puffer45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μ l DNase, Filter sterilisiert
35 μ m cell Siebdeckel RöhrchenBD Biosciences352235

Referenzen

  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
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  3. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
  4. Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
  5. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
  6. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
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  14. Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
  15. Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Einzelzell-qRT-PCRfluoreszenzaktivierte Zellsortierungreverse TranskriptionPolymerase-KettenreaktionOCT4::EGFP-positive ZellenGenexpressionsprofilierungPopulationsheterogenitätStammzellmarker
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