Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Extraktion von kleinen RNAs aus menschlichem Serum. Wir haben diese Methode verwendet, um microRNAs von Krebsserum für den Einsatz in DNA-Arrays isolieren und auch Singleplex quantitative PCR. Das Protokoll nutzt Phenol und Guanidiniumthiocyanat Reagenzien mit Modifikationen, um qualitativ hochwertige RNA ergeben.

Zusammenfassung

Die Analyse von RNA und deren Ausdruck ist ein gemeinsames Merkmal in vielen Labors. Von Bedeutung ist die Entstehung von kleinen RNAs wie microRNAs, die in Säugetierzellen zu finden sind. Diese kleinen RNAs sind potente Genregulatoren Steuerung Vitalwege wie Wachstum, Entwicklung und Tod und hat viel Interesse an ihren Ausdruck in Körperflüssigkeiten gerichtet. Dies ist aufgrund der Fehlregulation im menschlichen Krankheiten wie Krebs und ihre potentielle Anwendung als Serum Biomarker. Jedoch kann die Analyse der miRNA-Expression in serum problematisch sein. In den meisten Fällen die Menge an Serum und Serum Begrenzungs geringe Mengen an Gesamt-RNA, von denen kleine RNAs bilden nur 0,4-0,5% ^1. So ist die Trennung von ausreichenden Mengen an Qualität RNA aus Serum ist eine große Herausforderung für Forscher heute. In diesem Fachbeitrag zeigen wir, ein Verfahren, das nur 400 ul Humanserum verwendet, um eine ausreichende RNA entweder für DNA-Arrays oder qPCR-Analyse zu erhalten. Die einorteile dieser Methode sind seine Einfachheit und Fähigkeit, qualitativ hochwertige RNA ergeben. Es erfordert keine speziellen Spalten für die Reinigung von kleinen RNAs und nutzt allgemeine Reagenzien und Hardware gemeinsam Laboratorien gefunden. Unsere Methode nutzt eine Phase Lock Gel zu Phenol Verunreinigung zu beseitigen, während zur gleichen Zeit ergibt hohe Qualität RNA. Außerdem stellen wir einen weiteren Schritt, um alle Verunreinigungen während der Isolierung Schritt weiter zu entfernen. Dieses Protokoll ist sehr effektiv bei der Isolierung von Gesamt-RNA-Ausbeuten von bis zu 100 ng / &mgr; l aus Serum, sondern kann auch für andere biologische Gewebe angepasst werden.

Einleitung

In den letzten Jahren hat es eine wachsende Druck neuartige Biomarker für die Früherkennung von menschlichen Krankheiten zu entdecken. Viel Aufmerksamkeit wurde zur Verwendung von kleinen RNAs, wie microRNAs ² (miRNAs oder miRs) als potenzielle Marker konzentriert. Diese kleinen RNAs werden in Körperflüssigkeiten wie Serum und Studien gefunden haben gezeigt, sie sind robust, um den Abbau und sind über einen Bereich von ³ unterschiedlichen Umweltbedingungen stabil. Angesichts dieser Eigenschaften, Serum oder zirkulierenden miRNAs sind die ideale Biomarker ^{4, 5.} Derzeit gibt es zwei Hauptansätze zur Isolierung von kleinen RNA aus biologischen Flüssigkeiten. Der erste Ansatz verwendet spaltenbasierte Technologie zu binden und zu eluieren die kleinen RNAs ^6, während der zweite Ansatz nutzt die langjährige Protokoll mit Phenol und Guanidiniumthiocyanat Reagenzien ^7. Wir haben eine einfache, effektive, stützenfreie Protokoll an kleinen RNAs aus menschlichem Serum isolieren entwickelt. Die isolierte RNA wird sofortLICH verwendbar in nachgelagerten Anwendungen, einschließlich DNA-Oligonukleotid-Arrays und RNA-Sequenzierung.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, weil wir mit einigen Problemen bei der Verwendung von Phenol-basierte Methoden zur RNA aus Serum isolieren konfrontiert. Die traditionelle Chomczynski Ansatz wird häufig in den meisten Labors mit einer Reihe von Reagenzien von den meisten kommerziellen Anbietern verwendet. Jedoch unter Berücksichtigung ihrer Verbreitung haben strenge Richtlinien nicht entwickelt worden, um konsequent qualitativ hochwertige RNA aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut oder Serum.

Häufige Probleme mit Isolierung von RNA aus Serum assoziiert sind geringe RNA-Ausbeuten und Kontamination mit Reagenzien während der Trennung, insbesondere Phenol. Unser Ansatz eliminiert diese Schadstoffe Phenol, qualitativ hochwertige RNA für Downstream-Analyse wie die quantitative PCR (qPCR) und RNA-Sequenzierung bieten. Wir haben weiter diesen RNA getestet auf miRNA-Arrays.

Protokoll

Hinweis: Humanes Serumproben von gesunden Patienten oder Patienten mit Krebs wurden mit Einwilligung im Rahmen genehmigter menschlichen ethischen Protokolle aus der Royal Prince Alfred Hospital in Sydney (Protokollnummer X10-0016 und HREC/10/RPAH/24) und der University of Technology erhalten, Sydney. Serumproben wurden von Patienten vor der Operation aus verschiedenen Krankenhäusern Sydney gesammelt und bei -80 ° C platziert

1. Kleine RNA-Isolierung aus Serum

Gesamt-RNA wurde aus menschlichem Serum unter Verwendung einer modifizierten Version des Tri-Reagent RT LS Protokoll hergestellt.

1. Tauen Sie gefrorene Serum-Probe auf Eis und dann übertragen 400 ul der frisch aufgetauten Serum in einem markierten Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Verdünnt das Serum mit 100 &mgr; l RNase-freiem H ₂ O und fügen Proteinase K in einer Konzentration von 1 mg / ml.
3. Inkubieren bei 37 ° C für 20 min, um die Proteinverdauung durch Proteinase K. ermöglichen
4. To vollständige Auflösung zu gewährleisten, fügen Sie das 1,5-fache seines Volumens an Tri-Reagenz RT LS und 100 ul 4-Bromanisol.
5. Kurz invertieren die Homogenat, sich wiederholende Pipettieren für 5 Sekunden und Transfer in einem markierten 2 ml schwere Phase Lock Röhre.
6. Drehe das Homogenat bei 12.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
7. Mindestens 1 ml der resultierenden wässrigen Lösung vorsichtig dekantieren in eine frische DNA LoBind Röhre. Die organische und die Zwischenphase sollte unterhalb der weißen Gel der Phase Lock Rohr eingeklemmt werden.
8. Add 5,0 ul Glycogen (5 mg / ml) und 500 &mgr; l 100% igem Isopropanol zu der wässrigen Lösung, Mischen durch Umdrehen und inkubiert O / N bei 20 ° C.
9. Folgenden O / N Inkubation Zentrifuge die Probe für 20 min bei 12.000 × g bei 4 ° C zentrifugiert.
10. Entsorgen Sie die klare Überstand und führen Sie einen "Flash"-Spin für 2 min bei 16.000 × g in einem 4 ° C zentrifugiert.
11. Die klare Sol vorsichtig entfernenution rund um das Pellet mit einer Pipette.
12. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 min. Dekantiert man die Waschlösung und wiederholen Waschschritt.

2. RNA Resuspension in Lösung

1. Das Pellet in 10 ul RNase freiem H ₂ O, wodurch das Pellet vollständig gelöst ist. Um sicherzustellen, dass die RNA vollständig solubilisiert die Probe auf 55 ° C für 5 min erhitzt werden. Während dieser Zeit mischen die Probe mit wiederholten Pipettieren. Für eine höhere Gesamt-RNA-Ausbeute, bündeln zwei RNA-Präparationen des gleichen Patienten.
2. Quantifizieren der resuspendiert RNA mit Hilfe eines UV-Vis-Spektrophotometer und Beurteilung der RNA-Qualität mit einem Bioanalyzer 2100. Speichern die gepoolte RNA-Proben bei -80 ° C zur Verwendung in nachfolgenden Anwendungen.

Ergebnisse

Figur 1 stellt eine typische UV / Vis-Spektrum von RNA aus dem Serum isoliert. Aus diesem Profil haben wir festgestellt Protein-Kontamination bei 280 nm mit Phenol und organischen Verunreinigungen sowohl bei 270 nm und 230 nm auf. Rückstand Guanidiniumthiocyanat wurde bei 260 nm festgestellt. Um Verunreinigungen zu reduzieren, wurden eine Reihe von Optimierungsschritten zur Standard Tri-Reagent RT-LS-Verfahren hergestellt. Wir haben 5 mg / ml Glykogen, sowohl die Gesamt-RNA-Ausbeute zu erhöhen und die V...

Diskussion

Die Bevölkerung von microRNAs macht ungefähr 0,4 bis 0,5% der Gesamt-RNA im Serum gefunden. Ferner gibt es auch einen hohen Proteingehalt im menschlichen Serum gefunden. Um RNA zu verbessern und sowohl die Protein-und Phenol verseucht reduzieren wir den traditionellen Ansatz Chomczynski ⁹ mit dem Zusatz von mehreren Schritten modifiziert.

Gesamt-RNA wurde aus dem Serum unter Verwendung des Standard-Tri-Reagent RT-LS (Molecular Research Center) isoliert jedoch, wenn sie in unserem ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tri-Reagenz RT LS	Molecular Research Center, USA	TR 118
RNase frei H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinase K	Finnzymes, Finnland	EO0491
Heavy Phase Lock Röhrchen	5PRIME	2302830	2 ml
Fassungsvermögen DNA Lobind Röhrchen	Eppendorf	0030 108.078	1,5 ml Kapazität
Glykogen	Invitrogen, USA	10814-010	5 mg/ml
Isopropanol in RNA-Qualität	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
gekühlte Zentrifuge	John Morris
Nanodrop UV-Vis-Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific, USA
Ethanol in RNA-Qualität	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalysator	Agilent, Vereinigte Staaten von Amerika