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Methodenartikel

Juxtacellular Überwachung und Lokalisierung von einzelnen Neuronen im Sub-kortikalen Hirnstrukturen der Alarm, Head-zurückhaltende Ratten

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⸱

DOI:

10.3791/51453

⸱

27. April 2015

 ,  , 
1Department of Physics 0374, University of California, San Diego, 2Department of Psychiatry and Neuroscience, Centre de Recherche de l’Université Laval Robert-Giffard

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Design und die chirurgische Implantation eines kopffixierenden Mechanismus zur Überwachung der neuronalen Aktivität in subkortikalen Gehirnstrukturen bei wachen Ratten. Es beschreibt Verfahren zur Isolierung einzelner Neuronen in der juxtazellulären Konfiguration und zur effizienten Identifizierung ihrer anatomischen Positionen.

Zusammenfassung

Es gibt eine Vielzahl von Techniken, um die extrazelluläre Aktivität einzelner neuronaler Einheiten zu überwachen. Die Überwachung dieser Aktivität von tiefen Hirnstrukturen bei sich verhaltenden Tieren bleibt jedoch eine technische Herausforderung, insbesondere wenn die Strukturen stereotaktisch angegriffen werden müssen. Dieses Protokoll beschreibt praktische chirurgische und elektrophysiologische Techniken, die den Kopf des Tieres in der stereotaktischen Ebene halten und die Spike-Aktivität einzelner Neuronen eindeutig isolieren. Das Protokoll kombiniert die Kopffessel von warnenden Nagetieren, die juxtazelluläre Überwachung mit Mikropipettenelektroden und die Injektion iontophoretischer Farbstoffe, um die Position der Neuronen in der Post-hoc-Histologie zu identifizieren. Während jede dieser Techniken für sich genommen gut etabliert ist, konzentriert sich das Protokoll auf die Besonderheiten ihrer kombinierten Anwendung in einem einzigen Experiment. Diese neurophysiologischen und neuroanatomischen Techniken werden mit einer Verhaltensüberwachung kombiniert. Im vorliegenden Beispiel werden die kombinierten Techniken verwendet, um zu bestimmen, wie selbst erzeugte Vibrissa-Bewegungen in der Aktivität von Neuronen innerhalb des somatosensorischen Thalamus kodiert sind. Im Allgemeinen ist es einfach, dieses Protokoll anzupassen, um die neuronale Aktivität in Verbindung mit einer Vielzahl von Verhaltensaufgaben bei Ratten, Mäusen und anderen Tieren zu überwachen. Entscheidend ist, dass die Kombination dieser Methoden es dem Experimentator ermöglicht, anatomisch identifizierte neurophysiologische Signale direkt mit dem Verhalten in Beziehung zu setzen.

Einleitung

Überwachung der neuronalen Aktivität in einem Alert Tier aktiv an einer Verhaltensaufgabe engagiert ist entscheidend für das Verständnis der Funktion und Organisation des Nervensystems. Die extrazelluläre Aufnahme der elektrischen Aktivität von einzelnen neuronalen Einheiten ist seit langem ein Grundnahrungsmittel Werkzeug für Systemische Neurowissenschaften und ist immer noch weit verbreitet in Gebrauch heute. Eine Vielzahl von Elektrodentypen und Konfigurationen sind abhängig von den wissenschaftlichen und technischen Anforderungen einer bestimmten Experiment. Chronisch implantierten Microdrives oder Elektroden-Arrays werden häufig in sich frei bewegenden Tieren, darunter Vögel, Nagetiere und Primaten 1-4 verwendet. Alternativ werden akuten Durch mit Metall- oder Glasmikroelektroden über einen externen Mikromanipulator oft verwendet, um von narkotisierten oder Kopf-zurückhaltende Tiere aufnehmen. Glasmikroelektroden haben den Vorteil, dass sie in der juxtacellular oder verwendet werden "Zelle angebracht" Konfiguration eindeutig zu isolierenAktivität einzelner Nervenzellen, ohne die Komplikationen der Post-hoc-Spike-Sortier 5. Diese Elektroden weiter erlauben die Aufnahme von anatomisch-identifizierten Zellen oder Standorte, wie sie verwendet werden, um kleine Ablagerungen von Farbstoff oder neuroanatomische Tracer injizieren oder sogar zum Ausfüllen der einzelnen Zelle aufgezeichnet werden. Diese Konfiguration wurde erfolgreich bei Ratten, Mäusen und Vögeln 6-10 angelegt. Die hier beschriebene Technik konzentriert sich auf juxtacellular Überwachung und extrazelluläre Farbstoffablagerungen in Alarm, Kopf-zurückhaltende Ratten. Beachten Sie, dass im Gegensatz zu Einzelzell juxtacellular füllt diese Farbstoffablagerungen bieten keine Informationen über die Zellmorphologie oder axonalen Projektionen 11, aber sie exakte anatomische Lokalisation auf ca. 50 & mgr; m zu ermöglichen und, entscheidend, eine deutlich höhere Ausbeute bei der Benachrichtigung Tiere. Informationen zur Einzelzell juxtacellular füllt wird dennoch als eine alternative Strategie für anatomische Kennzeichnung versehen.

Kurz gesagt, dieProtokoll besteht aus drei Hauptphasen. In der ersten Phase wird die Ratte Körperhaltung in einem Tuch Socke (Figur 1) über einen Zeitraum von 6 Tagen akklimatisieren. In der zweiten Phase wird eine Kopfrückhaltevorrichtung (Abbildung 2) und Aufnahmekammer chirurgisch implantiert, so dass die Ratten in der stereotaktischen Flugzeug bei mehreren nachfolgenden Aufnahmen (Abbildung 3) gehalten werden; Dieses Verfahren ermöglicht es dem Experimentator insbesondere subkortikalen Regionen des Gehirns, die für elektrophysiologische Untersuchung Ziel basierend auf Standardreferenzkoordinaten 12. Die dritte Phase umfaßt das Anordnen der Ratte in einer entsprechenden Spannvorrichtung für die Durchführung der Verhaltens- und elektrophysiologischen Experimenten (Figur 4), die Konstruktion der Elektrode von einem Quarz Kapillarrohr (5), so dass juxtacellular neuronalen Aufnahmen, eindeutig einzelnen Betriebseinheiten 6-9 zu isolieren, und Markieren der anatomischen locatian der Aufzeichnungsstelle mit Chicago Sky Blue Farbstoff (6 und 7). Die Aufnahmen werden bei gleichzeitiger Verhaltensüberwachung durchgeführt; jedoch werden die technischen Einzelheiten des Verhaltens auf den wissenschaftlichen Ziele jedes Experiments abhängt und damit über den Umfang eines einzelnen Protokolls. Nach Beendigung der Versuchsdurchführung, die an mehreren Tagen wiederholt werden kann, wird das Tier getötet. Das Gehirn ist nach Norm neuroanatomische Methoden entweder mit Hellfeld-Fluoreszenzmikroskopie oder extrahiert und verarbeitet.

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Protokoll

(- 350 g 250) in Übereinstimmung mit staatlich vorgeschriebene Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Kalifornien San Diego genehmigten Versuchsprotokolle wurden an weiblichen Long-Evans-Ratten durchgeführt.

1. acclimating den Rat zur Körperrückhalte

HINWEIS: Setzen Sie die Ratte auf einer eingeschränkten Diät. Führen Sie die Ratte einmal am Tag unmittelbar nach jedem täglichen Umgang Sitzung, um die Ratte auf die Zurückhaltung (siehe unten) zu akklimatisieren. Geben Sie genug Futter, um das Tier bei 80% des Ausgangsgewicht zu halten. Diese Menge ist ungefähr 6 Gramm Futter pro Tag für einen 250 g weibliche Long Evans Ratten.

  1. Akklimatisieren die Ratte, die von den Menschen behandelt werden. Zurückhalten vorsichtig die Ratte mit der Hand für einen Zeitraum von ca. 5 s alle 30 sec. Tun Sie dies für 15 Minuten ein Tag, an 2 aufeinander folgenden Tagen. Überwachen Sie die Ratten täglich auf Anzeichen von Stress während der Ausbildungszeit. Symptome sind kämpfen in Reaktion auf Zurückhaltung, Stimmgebung und zahn Rattern.
  2. Am 3. Tag, legen Sie die Ratte in einem Körper-beschränke Stofffutteral (Bild 1) für 15 Minuten pro Tag an zwei aufeinander folgenden Tagen.
  3. Am 5. Tag, legen Sie die Ratte in der Socke, und legen Sie die Socke in einem starren Rohr auf der Versuchsvorrichtung (Abbildung 4). Verlassen Sie die Ratte in der Röhre für 15 Minuten ein Tag, an 2 aufeinander folgenden Tagen.
  4. Feed the rat unmittelbar nach jeder Trainingseinheit. Am Ende der letzten Sitzung (6. Tag) erhalten freien Zugang zu Nahrung. Wählen Sie für die Implantation nur die Ratten, die keine Zeichen einer übermäßigen Betonung auf der letzten Trainingstag zeigen müssen.
    Hinweis: Obwohl Auswahl von Ratten implantiert ist subjektiv, in der Hand über 90% der Ratten gefunden wurden, die auf die Gewöhnung und fähig Implantation sein.

2. Implantation des Aufnahmekammer und Kopfstützenmechanismus

  1. Machen Sie eine WiederKonferenz Draht durch Löten blanken Edelstahldraht mit einem Pin-Anschluss. Schneiden Sie den Draht, so dass 3-5 mm verbleibt durch den Stift aufgedeckt. Autoklavieren den Referenzdraht, zusammen mit allen chirurgischen Instrumenten.
  2. Verwalten Ketamin / Xylazin Anästhesie. Verabreichen 95 mg / kg Ketamin mit 5 mg / kg Xylazin intraperitoneal gemischt. Die Anfangsdosis dauert 1 ½ bis 2 Stunden. Ergänzen Sie die Betäubung jedes 30-45 Minuten danach, je nach Bedarf. Augen des Tieres Schmieren mit einer Augensalbe.
  3. Überprüfen Sie die Zehen Rückzug Reflex auf die Ebene der Anästhesie zu bestimmen und Aufrechterhaltung einer Narkose wie nötig.
  4. Legen Sie die Ratte in einem stereotaktischen Halterahmen mit Ohr Bars (3A). Rasieren Sie die Haare auf dem Kopf und desinfizieren Sie die Wunde mit PVP-Jod (10% ige Lösung). Darauf achten, dass die Ohr Bars angemessen einzusetzen, so dass sie nicht das Trommelfell beschädigen. Ear-Bars mit stumpfen Spitzen sind zu bevorzugen.
  5. Einen Einschnitt mit einem Skalpell Angleirungsweise entlang der Mittellinie des Schädels vom rostro-kaudale Ebene der Augen nach hinten von den Ohren. Mit einer Schere zu schneiden und entfernen Sie eine 2-3 mm Hautstreifen auf beiden Seiten des Einschnitts.
  6. Kratzen Sie die Knochenhaut, um die Oberfläche des Schädels aus, um den seitlichen Rillen schützen. Decken Sie die freiliegende Schädel mit dünnen Sekundenkleber.
  7. Bohren Sie ein kleines Loch, mit einem etwas kleineren Durchmesser als 0-80 Schrauben, mit einem Bohrer Grat ½ mm Durchmesser (siehe Materialien Abschnitt). Bohren Sie das Loch unmittelbar posterior, wo der Bregma Naht trifft die seitliche Kante, und in einem 30-45 ° -Winkel in den Schädel, so dass die Schraube mit dem oberen Seiten mehr als den Grund zu gehen in.
  8. Schrauben Sie in einem 0-80 Flachboden-Maschinenschraube in das Loch (ca. 3 Umdrehungen), bei 30 bis 45 ° -Winkel. Darauf achten, dass Schrauben in zu tief, um eine Beschädigung der darunter liegenden Hirngewebe.
  9. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 6 zusätzliche Schrauben in der Konfiguration gezeigt (3B). Sekundenkleber auf der Basis aller Schrauben.
  10. Legen Sie eine Spritzennadel in der stereotax Manipulator. Messen Sie von der Bregma Naht und eine Delle in den Schädel mit der Nadel in der Nähe, aber außerhalb des gewünschten Kraniotomie Lage als Referenzmarke.
    HINWEIS: In dieser Demonstration, die stereotaktischen Koordinaten der Marke sind 3 mm posterior und 1 mm lateral zum Bregma Naht.
  11. Markieren Sie die Delle mit einem wasserfesten Stift. Beachten Sie die stereotaktischen Koordinaten der Marke, da sie als stereotaktischen Referenzpunkt dienen (3B).
  12. Einen Kraniotomie auf den gewünschten Koordinaten (3 mm posterior und 3 mm lateral zum Bregma in diesem Beispiel) zentriert ist. Verlassen Sie die Dura mater intakt. Decken die Kraniotomie mit modifizierten künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (125 mM NaCl, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl 2, 1,3 mM MgCl 2, pH 7,4), 13 (3C).
  13. Schneiden Sie ein 0,2 ml-Zentrifugenröhrchen, um 4 - 5 mm in der Länge, und schneiden Sie die Kappe. Das Röhrchen wird auf dem Schädel und zentrieren es über die Kraniotomie.
  14. Anwenden Zahnzement auf der Unterseite des Rohres, um den Boden des Rohres zum Schädel abzudichten. Achten Sie darauf, Zement in die freigelegte Schädel (3D) auslaufen.
  15. Bohren Sie ein anderes kleines Loch (ca. ½ mm Durchmesser) in der Gegenschädelplatte und sorgfältig legen Sie die Referenzdraht. Konstruieren Sie die Referenzdraht durch Löten einen Stift, der mit dem Aufzeichnungsverstärker bis zum Ende des Drahtschnittstellen (siehe Ausstattung Abschnitt). Den Referenzdraht nicht bewegen, sobald es im Gehirn, da dies zu Schäden.
  16. Sekundenkleber auf das Loch, in dem der Draht eingeführt wird. Dadurch wird der Bolzen und Draht anstelle vorübergehend zu versiegeln.
  17. Man vermischt die beiden Teile des Silikongels Kit (siehe Materialien Abschnitt) in etwa gleichen Teilen. Warten Sie zwei Minuten Mischen und fill die Zentrifugenröhrchen etwa ⅓ voll mit Gel.
  18. Befestigen Sie einen rechten Winkel Stützenklemme (siehe Materialien Abschnitt) an der Kopfstütze bar. Befestigen der Kopfplatte (2A) auf die Halteleiste (2B) in einem 45 ° Anstellwinkel so dass die Unterseite der Platte in Richtung auf die Nase des Tieres. Es ist hilfreich, einen Neigungsmesser zu verwenden, um den Neigungswinkel eingestellt, dass der Versuchsvorrichtung (Abbildung 4) entsprechen.
  19. Befestigen Sie die Haltestange an die stereotax Manipulatorarm so dass die Stange parallel zu den Ohr Bars ist. Senken Sie die Bar und Platte, so dass die Platte posterior der Lambdanaht und anterior der Schwanz äußersten Schraube.
  20. Ziehen Sie die vordere Kopfschraube (eine 8-32 Bolzen oder Schrauben, siehe Materialien Abschnitt) bei ca. 45 ° Winkel mit einer helfenden Hände Arm und Klemme, so dass der Kopf der Schraube nach unten zeigt und in Richtung der Schwanz des Tieres. Senken Sie die Schraube, so dass es die Ameise berührterior 0-80 Schrauben (3F, G).
  21. Sichern Sie die Schraube und Platte an Ort und Stelle mit Zahn Acryl. Anwenden Dentalacryl um die Knochenschraubenköpfe Referenzstift, und um die Seiten des Zentrifugenrohrs. Warten Sie ca. 10 Minuten für die Dentalacryl trocknen (3H).
  22. Eine Schicht Zahnzement an den Rändern des Zahn Acryl-, Zementieren der Haut an das Implantat. Warten Sie, bis der Zement trocknet.
  23. Poke mehrere Löcher in der Kappe des Zentrifugenröhrchens, und setzen Sie die Kappe auf dem Rohr.
  24. Entfernen Sie die helfenden Hände Klammer. Dann entfernen Sie vorsichtig den Kopf-Haltestange aus dem stereotax und entfernen Kopfplatte von der Bar (3I).
  25. Nehmen Sie das Tier von der stereotax und zu verwalten, postoperative Pflege und Überwachung im Einklang mit allen geltenden Vorschriften, Bestimmungen und Gesetze (zB Buprenorphin 0,02 mg / kg, jede 8-12 Stunden für mindestens 24h). Wenn Entzündung entwickelt sich um die Kanten des Implantats, eine dünne Schicht von antibiotischen Salbe auf die betroffene Stelle täglich bis gelöst.

3. Juxtacellular Überwachung der neuronalen Einheiten

  1. Ziehen Quarzkapillare Schlauch auf einem Kohlendioxid-Laser-Mikropipettenzieher (siehe Ausstattungsteil) mit Spitzendurchmessern von weniger als 1 um (5A).
    Hinweis: Die Heizungsparameter entsprechend der jeweiligen Instrument variieren, und dass die erforderliche Halsdurchmesser ist abhängig von der Struktur des Gehirns von Interesse variieren. Für Aufnahmen in Ratten Thalamus, haben Mikro Hälse von 5-7 mm.
  2. Sichern Sie die Pipette an Ort und Stelle unter einem Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskop mit großem Arbeitsabstand Ziele ausgestattet. Verwenden Knetmasse, um die Pipette an Ort und Stelle auf der Bühne des Mikroskops zu halten.
  3. Bewegen Sie einen Glasblock (0,5-1 cm stark; ein Stück Glas für mak verwendeting ultra Mikrotommessern ist praktisch) in das Sichtfeld mit der Pipettenspitze. Mit der Bühne Mikromanipulator, sanft berühren die Pipettenspitze auf das Glas, wodurch es zu brechen. Bei Bedarf wiederholen, bis die Pipettenspitze Außendurchmesser beträgt zwischen 1-3 um (5B, C). Stellen Sie sicher, dass diese Mikropipetten haben Impedanzen zwischen etwa 5 bis 15 MOhm.
  4. Bereiten extrazellulären Salzlösung (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2 mit NaOH) 8 und mit 2% (w / v) Chicago Sky Blue. Unter Verwendung einer Spritze mit einer 30 G-Nadel oder kleiner ist, füllen die Hinterende der Pipette mit der Lösung. Alternativ können für einzelne Zelle juxtacellular Kennzeichnung mit 2% (w / v) Neurobiotin oder biotinylierte Dextran Amin (BDA-3000 oder BDA-10000) mit der Kochsalzlösung anstelle von Chicago Sky Blue.
  5. Legen Sie die Ratte in der Tuch Socke innerhalb des starren Rohr auf einem geeigneten Versuchs jig ( Abbildung 4) .Wait ein Minimum von 72 Stunden nach der Operation, bevor das Tier auf der Kopfstütze Lehre. Ziehen der Zugschnur um den oberen Brustbeins, anstatt den Hals, um eine Behinderung der Luftwege zu vermeiden. Bei Atem scheint gearbeitet oder behindert werden, lösen Sie die Kordel oder verschieben Sie sie nach hinten. Führen Sie dieses Verfahren, während die Ratte ist wach.
  6. Befestigen Sie die Kopfhalteplatte an der Ratte mit dem entsprechenden Teil an der Vorrichtung. Dazu stecken Sie die erste Kopfstützenplatte an Ort und Stelle, und befestigen Sie es mit einem 4-40 Schraube dann. Achten Sie darauf, warten Sie, bis das Tier ruhig, um zu vermeiden übermäßigen Drehmoments auf den Kopf. Als nächstes legen eine 8-32 Mutter an der Kopfrückhaltebolzen, die an der Ratte implantiert wird. Schrauben Sie dann in einer Gewindeedelstahlstange auf den Kopf-Schraube. Das Anbringen der Stange mit dem experimentellen Einspannvorrichtung derart, dass sie an Ort und Stelle angezogen werden (Figur 4).
    HINWEIS: Die Sicherung der Tier mit Kopf-Schraube sowie der Kopfstütze Platte minimizes Biegen der Vorrichtung und verbessert die Aufzeichnungsstabilität. In den meisten Fällen kann die Aufnahme am ersten Tag beginnen das Tier Kopf-verhalten. Allerdings, wenn das Tier zappelt mäßig oder vokalisiert, liefern einen Tag Kopfstütze Gewöhnungstraining vor Beginn von Aufnahmen. In diesem Fall lassen Sie das Tier auf der Spannvorrichtung für 15 Minuten und setzen Sie ihn wieder in seinem Käfig dann. Wiederholen Sie diesen Schritt am nächsten Tag und mit dem Protokoll.
  7. Öffnen Sie die Aufnahmekammer und entfernen Sie das Silikon-Gel. Reinigen Sie die Kraniotomie mit feinen Pinzette, wenn Gewebe in der Kraniotomie erneut gewachsen.
  8. Befestigen Sie die Pipette auf die motorisierten Mikromanipulator, und stecken Sie den heads Vorverstärker.
    HINWEIS: In der vorliegenden Demonstration wird eine kleine Relaisschaltung auf der heads verwendet, um zwischen den Verstärkerleitungsdrähten und einer externen Stromquelle mit hoher Compliance (6A-C) zu wechseln. Beachten Sie, dass einige Verstärker eine entsprechende integrierte Hoch Einhaltung Quelle haben(Siehe Diskussion und Materialien Abschnitte).
  9. Verwenden Sie den motorisierten Mikromanipulator, um die Spitze der Pipette auf die stereotaktisch identifiziert Zeichen in der Aufnahmekammer zu bewegen. Beachten Sie die Koordinaten des Standortes. Achten Sie darauf, die Spitze der Pipette auf den Schädel zu brechen.
  10. Bewegen Sie die Pipette auf die gewünschte Aufzeichnungsstelle in der anterior-posterioren und medio-lateralen Achsen. Dann voran die Pipette ventral durch die Dura, bis es etwa 500 & mgr; m Rücken zu der vorgesehenen Aufzeichnungs Lage.
  11. Langsam voran die Pipette beim Hören zum Aufstocken Ereignisse auf einer Audio-Monitor der verstärkten Spannung zwischen der Pipettenspitze und der Referenzdraht erfasst. Sobald Spick Ereignisse festgestellt werden, weiterhin die Pipette 0-100 & mgr; m bis positive Spannung Biegungen von mehr als etwa 500 & mgr; V eingehalten werden zu bewegen.
    HINWEIS: Die Elektrodenwiderstand um einen Faktor von etwa 1,5-10 wh erhöhenen dies geschieht.
  12. Beginnen Sie die Aufnahme, sobald ein Gerät wie gemäß Schritt 3.11, zusammen mit allen anderen Verhaltens- und physiologische Messungen von Interesse isoliert. In der vorliegenden Demonstration werden selbst erzeugte vibrissa Bewegungen mit hoher Geschwindigkeit Videografie überwacht (siehe Materialien Abschnitt).
  13. Um die Aufnahme vor Ort zu kennzeichnen, schalten Sie die Elektrode führt zu einer mit der Stromquelle verbinden. Es gibt mehrere Möglichkeiten, dies zu tun, entweder mit einer Relaisschaltung (6A - C), eine eingebaute Stromquelle des Verstärkers, oder manuell (6D, siehe Schritt 3.8 und Diskussion). Geben -4 uA mit 2 sec Impulse bei 50% Einschaltdauer für 4 Minuten iontophoretisch injizieren Chicago Sky Blue durch die Pipette.
  14. Töte und versorgen die Tier nach mehreren Markierungsverfahren nach den üblichen Richtlinien. Abschnitt des Gehirns und Gegenfärbemittel wie nötig, um zu identifizieren die anatomische Lage des Aufzeichnungs sitzene. Gegenfärbung des Gewebes für Cytochromoxidase Reaktivität nach 14. Alternativ identifizieren die Chicago Sky Blue Ablagerungen mittels Fluoreszenzmikroskopie.
    HINWEIS: Um zwischen verschiedenen markierten Einheiten genau zu unterscheiden, ist es wichtig, dass alle Etiketten werden mit der gleichen Pipette am selben Tag gemacht, ohne Lösen der Pipette zwischen Etiketten. In diesem Fall können die Aufnahme-Websites durch ihre relativen Positionen in Post-hoc-Histologie mit der erwähnten Manipulator Koordinaten jeder Seite unterschieden werden (siehe Schritt 3.9). Zur eindeutigen Identifizierung, markieren die Etiketten mindestens 200 & mgr; m voneinander entfernt, und nicht mehr als 3-5 Etiketten pro Hirnregion.

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Ergebnisse

Neuronal Einheiten in ventralen posterioren medialen (VPM) Thalamus codieren die Phase vibrissa Bewegung während selbsterzeugten wischend 15,16. 7A zeigt Probe Spikeaktivität eines VPM thalamic Einheit eine Ratte aktiv wischend. 7B zeigt ein Histogramm der Spike Zeiten zur Momentanphase vibrissa Bewegung 17 ausgerichtet ist. Es gibt mehr Spitzen während der Rückzugsphase der wischend. Nach der Aufzeichnung wurde die Position der Einheit mittels Iontophorese v...

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Diskussion

Der Bau des experimentellen jig

Die Beschreibung der für die Versuchsvorrichtung (4) aufbauen mechanischen Teile von dem Protokoll weggelassen werden, da sie in einer Vielzahl von Arten aufgebaut werden. In dieser Demonstration Standard opto-mechanischen Teilen und Unterstützung Klammern werden verwendet, um die Kopfstütze Bar und die Körperhaltung Rohr (siehe Materialien Abschnitt) zu montieren. Ähnliche opto-mechanische Teile...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Wir danken den Canadian Institutes of Health Research (Zuschuss MT-5877), den National Institutes of Health (Zuschüsse NS058668 und NS066664) und der US-Israeli Binational Foundation (Zuschuss 2003222) für die Finanzierung dieser Studien.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ketaset (Ketamin HCl)Fort DodgeN/A
Anased (Xylazinlösung)Lloyd LaboratoriesN/A
Betadyne (Povidon-Jod)CVS Apotheke269281
Loctite 495Grainger Industrial Supply4KL8620 - 40 cp Cyanacrylat
Vetbond3M1469SB
Grip Zement PulverDentsply Intl675571Für den Boden der Aufnahmekammer
Grip ZementflüssigkeitDentsply Intl 675572Für den Boden der Aufnahmekammer
SilikongelDow Corning3-4680
Jet ProthesenreparaturAcrylpulver Lang Dental Manufacturing Co.N/AZur Befestigung der Kopfstütze am Schädel
Ortho-Jet Schnell aushärtende kieferorthopädische AcrylharzflüssigkeitLang Dental Manufacturing Co.N/AZur Befestigung der Kopfstütze am Schädel
Chicago skyblue SigmaC8679
ParaformaldehydSigma158127Zur Perfusion und Gewebefixierung
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigmaP3813Zur Perfusion und Gewebefixierung
Cytochrom CSigmaC2506Zur Cytochromoxidase-Färbung, Abbildung 7
DiaminobenzidinSigmaD5905Für die Cytochrom-Oxidase-Färbung, Abbildung 7
RattensockeSew Elegant (San Diego, CA)N/ASonderanfertigung, Figuren 1, 4PVC-Schlauch
2 & frac12; "U.S. Plastic Co.34108Abbildung 4
Subminiatur-D-Pins und -SockelTE Connectivity205089-1Abbildung 3
Musikdraht aus Edelstahl mit 0,010" DurchmesserPrecision Brand Products, Inc.21010Abbildung 3
Stereotaktischer HalterahmenKopf InstrumentsModell 900Abbildung 3
Stereotaktische OhrbügelKopf InstrumentsModell 957Abbildung 3
Stereotaktischer ManipulatorKopf InstrumentsModell 960Abbildung 3
½ mm BohrfräserHenry Schein100-3995
Quiet-Air DentalbohrerMidwest Dental393-1600
Edelstahl 0-80 ⅛ ” Schraubverschlusssuperstore247438Abbildung 3
0,2 ml ZentrifugenröhrchenFisher Scientific05-407-8AAbbildung 3
Custom KopfhaltestangeUCSD SIO Machine ShopN/ASonderanfertigung, Abbildungen 2 - 4
Custom KopfhalteplatteUCSD SIO Machine ShopN/ADie maßgefertigten Figuren 2 - 4
rechtwinklige PfostenklemmeNewportMCA-1Die Ziffern 3, 4; opto-mechanische Standardteile für die experimentelle Vorrichtung (Abbildung 4) stammen ebenfalls von Newport Corp.
8-32 ¾ ” SchraubverschlussSuperstore240181Für Kopfstützen, Bild 3
4-40 ¼ ” SchraubverschlussSuperstore239958Für Kopfstütze, 3, 4
Quarz-KapillarschlauchSutter InstrumentsQF-100-60-10Abbildung 5
Kohlendioxid-LaserabzieherSutterInstruments P-2000
Motorisierter MikromanipulatorSutter InstrumentsMP-285
MikroelektrodenverstärkerMolecular DevicesMulticlamp 700BAlternativteil: Molecular Devices Axoclamp 900A
Mikroelektrodenverstärker KopftischMolecular DevicesCV-7BAlternativteil: HS-9Ax10 mit Molecular Devices Axoclamp 900A
Isolierter ImpulsstimulatorA-M SystemsModell 2100Alternativteil: HS-9Ax10 mit Molecular Devices Axoclamp 900A
AudiomonitorRadio Shack32-2040
PipettenhalterWarner Instruments#MEW-F10TAlternativteile: siehe Diskussion, Abbildung 6A
Elektroden-ZuleitungsdrahtCooner-DrahtNEF34-1646(optional), Abbildung 6D
Relais für Verstärker-KopfstufeCOTO-Technologie#2342-05-000(fakultativ) Zur Verwendung mit einer speziell angefertigten Leiterplatte (UCSD Physics Electronics Shop), Abbildung 6A-C
Digital-VideokameraBaslerA602fm(optional) Zur Verhaltensüberwachung, Abbildung 7
Puralube TierarztsalbeAmazon.com, IncNC0138063

Referenzen

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Lokalisierung einzelner Neuronensubkortikale HirnstrukturenKopfstabilisierung bei RattenAufrechterhaltung der stereotaktischen EbeneAbleitung mittels Mikropipettenelektrodeiontophoretische FarbinjektionMarkierung mit Chicago Sky BluePost hoc Histologieanalyseverhaltenselektrophysiologische Experimente
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