Eine modifizierte<em&gt; In-vitro-</em&gt; Invasion Assay, um die mögliche Rolle von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Invasion von Krebszellen fest,

Zusammenfassung

Dieser Videoartikel beschreibt eine modifizierte in vitro Methode, um die Rolle von Hormonen, Zytokinen und/oder Wachstumsfaktoren bei der Invasion von Krebszellen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Blutserum dient als chemoattraktive, auf das Krebszellen wandern und dringen, die Erleichterung ihrer Intravasation in Mikrogefäßen. Jedoch sind die tatsächlichen Moleküle zu dem die Zellen wandern bleiben ungeklärt. Diese modifizierte Invasion Assay wurde entwickelt, um Ziele, die Zellmigration und Invasion fahren zu identifizieren. Dieses Verfahren vergleicht die Invasion Index unter drei Bedingungen, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Hormon, Wachstumsfaktor oder Zytokin spielt eine Rolle bei der Vermittlung des invasiven Potentials einer Krebszelle. Zu diesen Bedingungen gehören i) normale fetale Rinderserum (FBS), ii) Holzkohle-beraubt FBS (CS-FBS), die Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine und iii) CS-FBS + Molekül entfernt (bezeichnet "X"). Eine wesentliche Änderung der Zellinvasion mit CS-FBS im Vergleich zu FBS, zeigt die Beteiligung von Hormonen, Cytokinen oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Veränderung. Einzelne Moleküle können dann zurück zu CS-FBS zugegeben, um ihre Fähigkeit zur Wieder AssayVers oder retten die Invasion Phänotyp. Ferner können zwei oder mehr Faktoren kombiniert werden, um die additive oder synergistische Effekte mehrerer Moleküle in Fahrt oder Hemmen Invasion bewerten. Insgesamt ermöglicht dieses Verfahren den Prüfer, um festzustellen, ob Hormone, Cytokine und / oder Wachstumsfaktoren spielen eine Rolle bei der Zellinvasion durch als Chemoattraktantien oder Inhibitoren Invasion für einen bestimmten Typ von Krebszelle oder einer bestimmten Mutante dient. Durch die Identifizierung von spezifischen Lockstoffe und Inhibitoren, kann dies geändert Invasionstest helfen, aufzuklären Signalwege, die Invasion von Krebszellen zu lenken.

Einleitung

Eine neuartige Invasionstest wurde mit dem Ziel der Identifizierung der Einbeziehung spezifischer Hormone, Cytokine und / oder Wachstumsfaktoren als Chemoattraktantien in Invasion von Krebszellen entwickelt. Die Fähigkeit der Tumorzellen durch die extrazelluläre Matrix (ECM) einzudringen ist ein Markenzeichen der metastatischen Phänotyp ^1-3. Invasionskammern wurden intensiv als in vitro-Werkzeuge zur Invasion von Krebszellen und die Migration zu untersuchen und möglicherweise Kenntnis über die Mechanismen der in vivo Tumorinvasion und Metastasenbildung bereitzustellen. Die Kammern bestehen aus zylindrischen Zellkultureinsätze in die Vertiefungen von Zellkulturplatten verschachtelt sind. Die Unterseiten der Einsätze semipermeablen Polycarbonat- oder Polystyrolmembranen definierte Porengrößen.

In der Standard-Invasion Assay werden die Zellen auf den Einsatz Membran mit serumfreiem Medium ausgesät und in Zellkulturschalen, die mit Serum oder Serumähnlichen Lockstoffe gefüllt werden aufgestellt, um set up a chemoattractive Kraft. Diese Kraftantriebe Zellen durch die halbdurchlässige Membran (Migration) bewegen, oder alternativ, durch eine Beschichtung aus extrazellulären Matrix (Invasion), die dann unter Verwendung herkömmlicher Farbstoffe zum Nachweis und zur Quantifizierung der Anzahl von Zellen angefärbt werden können. Die Zellzahl wird dann entsprechend dem Ausmaß der Migration und Invasion in einer nichtinvasiven Zelllinie normalisiert. Dieses Verfahren ermöglicht ein Ermittler die invasive Potential von verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen, einschließlich genetische Manipulationen zu bewerten.

Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren sind kritische Komponenten von Serum und werden zunehmend gezeigt, dass mit einem Antrieb des invasiven Phänotyps ⁴ zugeordnet werden. Allerdings ist die Art, Aufgaben und Spezifität dieser chemoattractive Serum-Moleküle bei der Vermittlung Invasion nach wie vor schwer. Die Herausforderung bleibt, zu bestimmen, welche spezifischen Faktoren in Serum oder Serumähnlichen Lockstoffe für den Antrieb zuständig sindInvasion von Krebszellen als auch, was Moleküle können die Invasion Prozess hemmen. In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode, um die mögliche Beteiligung von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren im Serum zu bewerten, wie Moleküle Antrieb der Chemoattraktion und Invasion von Krebszellen.

Bei diesem vorgeschlagenen modifizierten Protokoll wird verwendet, um Holzkohle Strippen Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren von 2% fötalem Rinderserum (FBS) zu entfernen, um 2% Aktivkohle gereinigt FBS (CS-FBS) zu erzeugen. Sowohl 2% FBS und 2% CS-FBS als Mittel verwendet zum Einrichten der chemoattractive Kraft Invasion von Krebszellen zu fahren. Verwendung von 2% CS-FBS als chemoattractive Mittel im Vergleich zu normalen 2% FBS bietet mehrere Vorteile, einschließlich erster und am deutlichsten, die Möglichkeit, das Krebsinvasion Phänotyp in dem reduzierten / relative Abwesenheit von Hormonen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren zu untersuchen. Er ermöglicht auch die Prüfer, ob gemeinsamen Entfernung von Hormonen, Wachstumsfaktoren zu beurteilen und cytokines bewirkt eine Zunahme oder Abnahme der invasive Index. Der Assay wird dann entwickelt, um zu bestimmen, ob die Zugabe einer einzelnen Komponente, die als "X" bezeichnet hemmen, Senkung, Erhöhung oder Wiederherstellung der invasive Index auf den ursprünglichen Wert (siehe 2 und 3). Obwohl diese Methode ist spezifisch für das Erreichen der physiologischen Konzentrationen der Komponente, die aus dem Serum während Kohledestillation entfernt wird, sollte auch beachtet werden, dass Kohle Abstreifen kann auch Auswirkungen auf Signaltransduktionswege werden. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Kohle Strippen kann die alkalische Phosphatase-Aktivität der Knochenvorläuferzellen zu verringern und induzieren Adipogenese durch Reduktion von MAPK Aktiva ^5. Aktivkohle gereinigt Medien sind im Handel erhältlich und auf dem Protokoll basiert umrissen, damit kombiniert Kohle mit Dextran und mit fötalem Rinderserum O / N ⁶ inkubiert.

Dieser Test wurde in respo entwickeltnse zu einem Ergebnis von Zucker et al. ⁷ berichteten die Autoren gezeigt, dass eine mutierte Phänotyp beeinflussen gap junction Kommunikations zeigten eine Zunahme bei der Invasion Index bei der Migration in Richtung Medien normales 2% FBS. Dieser Anstieg wurde mit dem Ersatz von Holzkohle-gestrippt Serum eliminiert. Aus diesem Ergebnis schlossen die Autoren, dass diese Mutante betroffen Migration in Richtung eines lipophilen Moleküls (genauer gesagt, ein Hormon, Wachstumsfaktor oder Zytokin) ^7. Es ist bekannt, daß Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine vermitteln Signalwege in Tumorpromotion und Invasion ⁴ beteiligt. Daher ist es wichtig, für wissenschaftliche Forscher, um festzustellen, was Faktor (en) treiben die Tumorinvasion ihrer besonderen Krebszellen oder Mutanten untersucht. Der Test wurde entwickelt, um die Rolle der einzelnen Komponenten auf den physiologischen Konzentration ansprechen als entsprechend der Differenz zwischen der Konzentration der Komponente bestimmt und# 8220; X "in normalen FBS und der CS-FBS. Durch die Entwicklung dieses Assays können Forscher mehr Einblick in die spezifische invasiven Weg zur Regelung ihrer System zu erlangen.

Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine sind oft als Tumorpromotoren ⁸ klassifiziert. Einige dieser Faktoren wie EGF als direkte Quellen für chemische Lockstoffe in Invasionskammern ⁹ verwendet. So scheint es wahrscheinlich, dass diese stellen die Hauptkomponenten des Serums, dass direkte Tumorinvasion. Dieses Protokoll schlägt eine einfache, aber bedeutenden, Modifikation der herkömmlichen in vitro-Invasionstest, der ein Ermittler die Beteiligung von Hormonen, Wachstumsfaktoren und Cytokine bei der Vermittlung der invasive Potential von Tumorzellen zu bewerten gestattet. Jedoch wird der Assay entwickelt, um dem Prüfer eine Antwort auf die Frage, ob das Verfahren wird in einem frühen Schritt in der Analyse wirksam für ihre Studie liefern, um nicht wertvolle Zeit und r verwendenESSOURCEN wenn nicht notwendig erachtet. Bei dieser Methode wird CS-FBS und stützt sich auf die Ermittler Ermessen, die als Lead-Kandidaten, die möglicherweise vermitteln Invasion von Krebszellen zu verfolgen Moleküle. Die Ergebnisse aus diesen Analysen erweisen sollte, bei der Identifizierung, welche Serumkomponenten dienen als Chemoattraktantien oder Inhibitoren für die bestimmte Zelllinie oder Mutante untersucht werden. Darüber hinaus kann dieser Ansatz hilft der Forscher identifizieren Schlüsselsignalwege entweder fördern oder zu hemmen Invasion von Krebszellen; damit die Leitung zukünftige Entwicklung von Arzneimitteln.

Protokoll

1. Bereiten Sie die verschiedenen Medien und Zusatzkomponenten

1. Vor experimentieren, bereiten Medien aus DMEM oder andere spezifizierte Medien mit der Zugabe von entweder normalen FBS, Aktivkohle gereinigt FBS oder Aktivkohle gereinigt FBS sowie die Komponente zu testen. Man beachte, dass mehrere Komponenten können in jedem Experiment getestet werden.
2. Abzuwiegen und verdünnt die Hormone, Wachstumsfaktoren oder Cytokine in geeigneter Weise in der Aktivkohle gereinigt Serum bei der physiologischen Konzentration gelöst werden.

2. Bereiten Sie die Kollagenmatrix on Ice

1. Planen 2 ml Kollagen I Matrix bei 2,2 mg / ml durch Zugabe der folgenden sterilfiltriert Komponenten auf Eis: 200 ul 10x PBS (pH 7,4), 5,4 ul 1 N NaOH, 600 ul bidestilliertes H ₂ O und 1,2 ml Kollagen I (bei 3,63 mg / ml).
2. Halten Kollagen I-Lösung auf Eis, bis bereit, zu plattieren.

3. Bereiten Sie die Migration / Invasion Platten für Assay

1. Für jede zu testende Zelllinie, verwenden Sie eine 24-Well-Kammerplatte, in der 12-Mulden enthalten Einsätze. Mit den zusätzlichen 12 Brunnen, die Einsätze nicht enthalten, zum Addieren der chemoattractant Medien und die Übertragung der Einsätze für den Versuchsaufbau.
   HINWEIS: Ein Kollagenmatrix auf Platten mit einem Polyethylenterephthalat (PET) Membran und 8 & mgr; m Porengröße ist optimal für die Zelllinien verwenden hier. Jedoch kann eine Matrigel-Matrix in vorbeschichteten Platten auch mit der Porengrße verringert entsprechend die Zelllinie untersucht, ausgewechselt werden.
2. Eindeutig zu kennzeichnen die Platte, mit 3 Vertiefungen pro Zustand analysiert (FBS Migration, CS-FBS Migration, FBS Invasion und CS-FBS Invasion sowie FBS-Migration für eine Kontrolle, nicht-invasive Zelllinie). Assay Migration durch Bewegung durch Poren in einem PET-Membran und Assay Invasion durch Bewegung durch eine Collagen oder Matrigel-Matrix und dann durch die Poren in der Membran. Verwenden Sie unterschiedliche Farbmarkierungen für jede Zelle Zustand einID im Beschichtungsprozess.

4. Pipettieren Sie die Invasion Matrix

1. Beim Pipettieren der 75 ul der Kollagenmatrixlösung in die Einsätze für Invasionsassays verwendet werden. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden. Disperse Blasen durch Anlegen eines invertierten Pipettenspitze auf die Oberfläche.
2. Übertragen die Platte mit den Kollagen-beschichteten Einsätze zu einem 37 ° C und 5% CO ₂ Inkubator für 30 min, um das Gel zu ermöglichen, sich zu verfestigen.

5. Platte die Zellen auf der Membran oder Matrix-Invasion

1. Inzwischen trypsinieren Zellen und fügen Sie Medien mit 10% FBS. Spin-Zellen bei 200 xg für 5 min auf einer Tischzentrifuge und spülen 3x in serumfreiem Medium.
2. Resuspendieren in serumfreiem Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder automatisierte Diaschau-Zähler. Hinzufügen serumfreiem Medium auf eine Endkonzentration von 5 x 10 ⁴ Zellen / ml.
3. Wenn die Kollagenmatrix (nach 30 min) verfestigt wird, fügen 700 ul Medium mit entweder2% definiert FBS oder Holzkohle-beraubt FBS in jede Vertiefung. Von den 12 Einsätzen pro Platte:
   • 3 Einsätze Kollagen und Vertiefungen mit Medium + 2% FBS
   • 3 Einsätze Kollagen und Vertiefungen mit Medium + 2% FBS CS-
   • 3 Einsätze haben keine Kollagen und Vertiefungen, die mit Medien + 2% FBS
   • 3 Einsätze haben keine Kollagen und Vertiefungen, die mit Medien + 2% FBS CS-
   1. Verwendung zusätzlicher Platten in Abhängigkeit von der Zahl der Faktoren, die getestet und mit einem nicht Kollagen Steuerung entsprechend jedem Zustand.
4. In Zellsuspension auf die Einsätze bei 5 × 10 ⁴ Zellen / ml, Überzug 500 ul Zellen pro Einsatz in allen Migration und Invasion Einsätze.
5. Die Zellen für 22 Stunden bei 37 ° C.

6. Quantifizierung der Anzahl der Migration und eindringenden Zellen

1. Richten Färbung von Brunnen mit Methanol Fixiermittel, Eosin und Hämotoxylin, in getrennten Vertiefungen.
2. Verwenden Sie Wattestäbchen, um Zellen und Matrix aus jeder Vertiefung entfernen.Rrepeat mit zweiten Tupfer Anwendung für jede Vertiefung.
3. Mit einer Pinzette, tauchen jedes Einsatzes 5 Mal für 1 Sekunde in jeder der 3-Lösungen in Folge.
4. Lassen Einsätze trocknen O / N.
5. Entweder i) Filter entfernen mit einem Skalpell, Schneiden sorgfältig an den Rändern und montieren auf einem Objektträger mit Deckglas und Immersionsöl, oder ii) erlauben die Einsätze trocknen O / N invertiert und verwenden Sie die Einsätze direkt für die Mikroskopie.
6. Am nächsten Tag sehen können Dias oder Einsätze unter dem Mikroskop mit einem 20x-Objektiv und nehmen Sie sich 5 Bildern aus verschiedenen Regionen des Filters. Um die Konsistenz zu verbessern, nehmen 4 äußeren Feldern und einem Zentrum.
7. Zählen von Zellen für alle Bedingungen mit der ImageJ Software und beziehen sich auf die nachstehenden Formeln.
8. Bestimmen Sie die Prozent-Invasion, wie folgt:
   Die mittlere Anzahl der Zellen eindringende durch Kollagen I einfügen = a
   Die mittlere Anzahl der Zellen, die Migration durch Steuerung Einsatz = b
   % Invasion = (a / b) · 100
9. Bestimmen Sie die Invasion Index in 2% FBS, wie folgt:
   % Invasion von Zellen (in 2% FBS) getestet = c
   % Invasion Steuernichtinvasiven Zellen (2% FBS) = d
   Invasion Index (FBS) = (c / d)
10. Bestimmen Sie die Invasion Index in 2% CS-FBS wie folgt:
    % Invasion von Zellen (in 2% CS-FBS) = e getestet
    % Invasion Steuernichtinvasiven Zellen (2% CS-FBS) = f
    Invasion Index (CS-FBS) = (e / f)

7. Wiederholen Sie die Versuchsprotokoll Vergleichen von Holzkohle-beraubt FBS auf Holzkohle-beraubt FBS + X _n mit mehreren Faktoren zusammen

1. Wiederholen Sie diese Prozedur mehrmals bei Bedarf mit verschiedenen Komponenten für "X" oder einer Kombination von Komponenten.
2. Übernehmen Sie die Berechnungen, um den Beitrag der einzelnen Faktoren "X", um die Migration und Invasion Auswirkungen zu bestimmen.

Ergebnisse

Die Invasion Index wird für jede Bedingung nach Normalisierung auf eine nicht-invasive Zelllinie berechnet. Für unsere Experimente verwenden wir den 1205Lu Melanomzelllinie und etablierte Variante stabile Zelllinien wie unsere invasive Leitungen sowie die Vorstufen noninvasive Variante WM793, aus dem die Zellen stammen 1205Lu ^10, die als eine logische Steuerung dient. Wir verwenden auch Kollagen I nach der Invasion Matrix, denn das ist die primäre Komponente der Dermis. Dies ist in Übereinstimmung mit einer v...

Diskussion

Tumormetastasen ist ein mehrstufiger Prozess. Die Zellen müssen über die Basalmembran zu brechen, intravasate entweder in das Lymphsystem oder Blutmikrogefäße, in denen sie an entfernten Stellen transportiert werden. Die Tumorzellen dann extravasieren und zu kolonisieren in eine macrometastasis ^12. Progression durch die Epithelzellen zu mesenchymale Transition (EMT), Tumorinvasion und Metastasierung wurde von Steroidhormonen ^13,14 erweitert, Wachstumsfaktoren ^{von 15 bis 18, 19 bis 21} und...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BioCoat Control Inserts mit 8.0 & micro; m PET-Membran	Corning	354578	12 in jeweils zwei 24-Well-Platten. PET = Polyethylenteraphthalat
Kollagen I, Rattenschwanz	Corning	354236	Quelle = Rattenschwanzsehne, Reinheit = 90%
Fixiermittel; Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	Fixiermittel auf Methanolbasis, Hämatoxylin/Eosin
Fötales Rinderserum	Life Technologies	16000	Bezeichnung als FBS
Holzkohlegestreiftes fötales Rinderserum	Life Technologies	12676	Bezeichnung als CS-FBS
Fötales Kälberserum	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	bezeichnet als FBS
Aktivkohle gestreiftes fötales Rinderserum	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	bezeichnet als CS-FBS