Hot Biologische Katalyse: Isotherme Titrationskalorimetrie zu Enzymreaktionen Charakterisieren

Zusammenfassung

Isotherme Titrationskalorimetrie Maßnahmen Wärmestrom freigegeben oder in chemischen Reaktionen absorbiert. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Enzym-Katalyse zu quantifizieren. In diesem Papier, das Protokoll für die Instrumental Setup-Experiment läuft, und Datenanalyse wird allgemein beschrieben, und der Charakterisierung der enzymatischen Hydrolyse von Harnstoff Bohne Urease aufgebracht.

Zusammenfassung

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist eine gut beschriebene Technik, die die Wärme freigesetzt oder während einer chemischen Reaktion aufgenommen, sie als eine intrinsische Sonde zur Charakterisierung praktisch jeden chemischen Prozess misst. Heutzutage wird dieses Verfahren weitgehend angewendet, um thermodynamische Parameter des biomolekularen Bindungsgleichgewichte bestimmen. Zusätzlich ITC wurde gezeigt, können direkt zu messen Kinetik und thermodynamischen Parameter (k _cat, K _M, &Dgr; H) von enzymatischen Reaktionen, obwohl diese Anwendung noch unzureichend genutzt werden. Als Wärme Änderungen spontan während der enzymatischen Katalyse kommen, die jedoch ITC keine Änderung oder die Kennzeichnung des Systems unter Analyse bedürfen und kann in Lösung durchgeführt werden. Darüber hinaus muss das Verfahren wenig Materialmenge. Diese Eigenschaften machen ITC eine unschätzbare, leistungsstarke und einzigartige Werkzeug zur Enzymkinetik in mehreren Anwendungen, wie zum Beispiel, Arzneimittelforschung studieren.

k _cat und K _M der enzymatischen Hydrolyse von Harnstoff durch Canavalia ensiformis (jack bean) Urease. Berechnung der intrinsischen molare Enthalpie (&Dgr; H _int) der Reaktion durchgeführt. Die so erhaltenen Werte sind konsistent mit früheren Daten in der Literatur berichtet, was die Zuverlässigkeit der Methode.

Einleitung

Quantitative Bestimmung von biochemischen Reaktionen Einblicke in die biologischen Prozesse auf der Grundlage des Lebens. Kalorimetrie bietet eine markierungsfreie Methode zur quantitativen Charakterisierung praktisch jede chemische Reaktion in Lösung. Dieses Verfahren misst die Wärme freigegeben oder im Laufe der Zeit absorbiert wird, und ist daher eine universelle Erfassungssystem und eine sehr bequeme Methode, um die Menge der reagierenden Moleküle (dh Bindung Thermodynamik), als auch die Reaktionsgeschwindigkeit (dh Kinetik) messen zu quantifizieren. Insbesondere hat isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) als Methode der Wahl, um die Thermodyna....

Protokoll

1. Vorbereitung von Proben

1. Herstellung von 2 ml Enzymlösung und 0,5 ml der Substratlösung für jede Versuchsreihe. Konzentriertes Stammlösungen von Enzym und Substrat in Pufferlösungen mit identischer Zusammensetzung, um die Wärme der Verdünnung und Durchmischung während der Substratzugabe zu minimieren.
   1. Wählen Sie die Pufferbedingungen, die ausreichend sind, um pH-Änderung während Experiment zu verhindern. Zum Beispiel ist 20 mM HEPES pH 7 ausreichend für Messungen bei neutralem pH-Wert.
      HINWEIS: Wenn Protonenaustausch beteiligt ist, muss die Protonierung Enthalpien der verwendeten Puffer betrachtet werden, da sie die gemessene

Ergebnisse

Urease (EC 3.5.1.5; amidohydrolase Harnstoff) ist ein Multiunternickelhaltige Enzym in Archaea, Bakterien, einzelligen Eukaryoten und Pflanzen gefunden. Dieses Protein wirkt in der letzten Stufe von organischen Stickstoffmineralisierung und katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff zu Ammoniak und Carbamat, das spontan zerfällt, um ein zweites Molekül Ammoniak und Bicarbonat (Gleichung 6) ¹² zu ergeben.

Diskussion

Bedeutung der ITC, um die enzymatische Aktivität gegenüber bestehenden Methoden zu studieren

Zusätzlich zu den klassischen Anwendungen, verbindliche Gleichgewichte zu untersuchen, bietet isothermen Titrationskalorimetrie eine zuverlässige und schnelle Methode, um enzymatische Reaktionen in Lösung charakterisieren, mit der Reaktionswärme als Sonde, ohne Systemänderung oder die Kennzeichnung erfordern. Die kinetischen Parameter k _cat und K _M<.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HEPES	Sigma	H3375	löst sich in Wasser auf und stellt den pH-Wert mit NaOH
ein TRIZMA-Base	Sigma	T1503	sich in Wasser auf und stellt den pH-Wert mit HCl
ein Natriumdihydrogenphosphat	Riedel-de-Haen	4270	sich in Wasser
Natriumphosphat zweibasisch	Riedel-de-Haen	30427	in Wasser
auf Harnstoff	Sigma	U4128	löst sich in Wasser bei 40 & Grad; C
Canavalia ensiformis Urease (Typ C-3)	Sigma	U0251	löst sich in 20 mM HEPES pH 7 und lagert bei -80 &de; C
VP-ITC auf Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	Instrument
VPViewer2000 1.30.00 auf Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		Datenerfassungssoftware, die mit dem Gerät geliefert wird

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