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Methodenartikel

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen

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DOI:

10.3791/51506

⸱

31. August 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Pathogenese von HIV-1 wird sowohl durch virale Eigenschaften als auch durch genetische Faktoren des Wirts definiert. Hier beschreiben wir eine robuste Methode, die reproduzierbare Messungen ermöglicht, um den Einfluss der Variation der Gag-Gensequenz auf die in vitro Replikationskapazität des Virus zu bewerten.

Zusammenfassung

Die schützende Wirkung vieler HLA-Klasse-I-Allele auf die Pathogenese und das Fortschreiten der Krankheit von HIV-1 wird zum Teil auf ihre Fähigkeit zurückgeführt, konservierte Teile des HIV-1-Genoms anzugreifen, die nur schwer entkommen können. Sequenzänderungen, die auf den zellulären Immundruck zurückzuführen sind, treten während der Infektion im gesamten Genom auf und können, wenn sie in konservierten Regionen des Genoms wie Gag gefunden werden, die Fähigkeit des Virus beeinträchtigen, sich in vitro zu vermehren. Die Übertragung von HLA-verknüpften Polymorphismen in Gag auf HLA-nicht übereinstimmende Empfänger wurde mit einer reduzierten Sollwert-Viruslast in Verbindung gebracht. Wir stellten die Hypothese auf, dass dies auf eine verminderte Replikationskapazität des Virus zurückzuführen sein könnte. Hier stellen wir eine neuartige Methode zur Bewertung der in vitro Replikation von HIV-1 vor, die durch das Gag-Gen beeinflusst wird, das aus akuten Zeitpunkten von Subtyp-C-infizierten Sambiern isoliert wurde. Bei dieser Methode wird die auf Restriktionsenzymen basierende Klonierung verwendet, um das Gag-Gen in ein gemeinsames provirales Rückgrat des Subtyps C HIV-1, MJ4, einzufügen. Damit ist sie für die Untersuchung von Subtyp-C-Sequenzen besser geeignet als bisherige rekombinationsbasierte Methoden, die die In-vitro-Replikation chronisch abgeleiteter gag-pro-Sequenzen untersucht haben. Nichtsdestotrotz könnte das Protokoll für Studien mit Viren anderer Subtypen leicht modifiziert werden. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine robuste und reproduzierbare Methode zur Bewertung der Replikationskapazität der chimären Gag-MJ4-Viren auf einer CEM-basierten T-Zelllinie. Diese Methode wurde für die Untersuchung von chimären Gag-MJ4-Viren verwendet, die von 149 akut infizierten Sambiern des Subtyps C abstammen, und ermöglichte die Identifizierung von Rückständen in Gag, die die Replikation beeinflussen. Noch wichtiger ist, dass die Implementierung dieser Technik ein tieferes Verständnis dafür ermöglicht hat, wie die virale Replikation Parameter der frühen HIV-1-Pathogenese definiert, wie z. B. die Soll-Viruslast und den longitudinalen Rückgang der CD4+ T-Zellen.

Einleitung

Bestimmung sowohl der Host und viralen Eigenschaften, die Einfluss auf HIV-1-Pathogenese und Progression der Erkrankung ist von größter Bedeutung für eine rationelle Impfstoff-Design. Die zelluläre Immunantwort ist eine Schlüsselkomponente der menschlichen Immunantwort auf HIV-1-Infektion. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) sind für die erste Kontrolle der akuten Virämie notwendig und erlauben dem Host, einen stabilen Zustand (Sollwert) die Viruslast 1,2 etablieren. Experimentelle Erschöpfung dieser Effektor-Zellen führt zu einem Verlust der viralen Steuer 3,4. Trotzdem entkommen Mutationen entstehen innerhalb des viralen Genoms, die CTL-Erkennung von virusinfizierten Zellen 5-9 zu untergraben.

Bestimmte HLA-Allele wurden mit niedriger Viruslast und langsamer Fortschreiten der Krankheit, einschließlich B * 57, B * 27 und B * 81 10-15 in Verbindung gebracht. Teil der Schutzwirkung von HLA Klasse I-Allele können, daß sie funktional eingeschränkten Regionen des Genoms, wie Gag Ziel zurückzuführenund wählen Flucht Mutationen, die die Fähigkeit des Virus zur Replikation in vitro 16-21 abnehmen. Obwohl Flucht aus dem zellulären Immunsystems ist vorteilhaft gegenüber dem Virus in Zusammenhang mit dem Auswahl HLA-Klasse-I-Allel kann die Wirkung dieser Mutationen Differenzfolgen für den Host bei der Übertragung zu einem HLA-übereinstimmende Einzel 22,23 aufweisen. Daher, das Verständnis der Auswirkungen von übertragenen HLA-assoziierten Mutationen Flucht auf die virale Replikation Kapazität wird wichtig sein, um unser Verständnis der frühen HIV-1-Pathogenese zu fördern.

Während viele Fortschritte gemacht worden, Identifizierung und Charakterisierung der Fitness der einzelnen Defekte mit bestimmten HLA-Klasse-I-Allele 24-29 verbunden Mutationen, natürlich vorkommende HIV-1-Isolate einzigartige und komplexe Spuren der HLA-assoziierten Polymorphismen, wahrscheinlich aus der HLA vermittelte Immun Druck von verschiedenen immungeneHinter 30. In aprevious Analyse, Goepfert et al. zeigten, dass eine Ansammlung von HLA-assoziierte Mutationen in den übertragenen Gag-Sequenzen von 88 akut infizierten Zambians abgeleitet wurde, mit einer Verringerung der Sollviruslast 31 verbunden. Dies legte nahe, dass die Übertragung von schädlichen Mutationen, insbesondere in Gag, an HLA-übereinstimmende Empfänger einen klinischen Nutzen und können durch virale Replikation gedämpft werden. Moving forward, ist es zwingend notwendig, zu untersuchen, wie komplexe Kombinationen von Gag-Polymorphismen in natürlich vorkommenden Isolate im Konzert arbeiten, um Eigenschaften des Virus übertragen wie Replikation Kapazität und wie früh Replikation kann wiederum HIV-1-klinischen Parametern und Spätstadium beeinflussen definieren Pathogenese.

Brockman et al. Eine Verbindung zwischen den Replikationskapazität von gag-pro-Sequenzen während der chronischen Phase der Infektion und Viruslast in beiden Subtyp C und B-Infektionen isoliert erstmals gezeigt32-35. Der experimentelle Ansatz in diesen Studien vorgestellt, obwohl geeignete für die Prüfung der in vitro Replikation Kapazität von Sequenzen aus chronisch infizierten Personen stammen, hat mehrere technische Vorbehalte und Einschränkungen, die das Studium machen HIV-1-Replikationskapazität in Subtyp C akut infizierten Personen schwierig. Dieses Verfahren beruht auf der Rekombination von Bevölkerungs basierten PCR-amplifizierten Sequenzen in den Subtyp B NL4-3 Provirus, die teilweise von LAV, abgeleitet wurde, angepasst, ein Laborvirusvorrat 36. Viruserzeugung wurde durch Co-Transfektion einer CEM-basierte T-Zelllinie mit 37 PCR-Produkte durchgeführt und aufgeschlossen Delta-gag-pro NL4-3 DNA. Dieses Verfahren erfordert das Auswachsen von Virus über einen Zeitraum von Wochen bis Monate, möglicherweise Neigen der Art des gewonnenen Virus Lager in Bezug auf die virale Quasi-Spezies in vivo und somit zur Änderung der Messung der Replikationsfähigkeit in vitro. Diese Methode, die ichist mehr für die Untersuchung chronisch infizierten Individuen, wenn sie tatsächlich selektiert Virus mit der höchsten Replikationsfähigkeit, und wo die Klonierung zahlreichen verschiedenen Virusvarianten aus einer großen Anzahl von chronisch infizierten Personen angemessen ist sehr arbeitsintensiv und daher nicht durchführbar ist. Jedoch in einer akut infizierten Individuum gibt es im allgemeinen ein zwei Varianten vor, und wodurch das Risiko einer Schrägstellung der Art des gewonnenen Virus-Stock, durch in vitro Selektionsdruck erlaubt eine bessere Beurteilung der in vitro-Replikationskapazität. Zweitens erfordert dieses Verfahren Rekombination Subtyp C-Gag-pro-Sequenzen in einem Subtyp B abgeleitet Rückgrat und könnte Rückgrat Inkompatibilität Vorurteile in die Analyse einzuführen. Aufgrund dieser Einschränkungen ist eine große Anzahl von Sequenzen, um mögliche Verzerrungen eingeführt überwinden analysiert werden.

Hier beschreiben wir eine alternative Versuchs approach für das Studium Sequenzen aus Subtyp C akut infizierten Individuen abgeleitet angemessen. Wir verwenden eine Restriktionsenzym-basierte Klonen Strategie, um die gag-Gen von einer akuten Infektion Zeitpunkte der HIV-1 Subtyp C infizierten Personen in den Subtyp C proviraler Rückgrat, MJ4 abgeleitet einzuführen. Die Verwendung von MJ4 als gemeinsames Grundgerüst, in dem gag-Gene zu klonieren ist für die Analyse von Subtyp C abgeleitete Sequenzen. MJ4 ist aus einem primären Isolat 38 abgeleitet, und somit wäre weniger wahrscheinlich, Verzerrung durch Subtyp Inkompatibilität zwischen dem Backbone und gag-Gen einzuführen. Darüber hinaus ist die Ansatz der Verwendung von Enzym-basierte Klonen Einschränkung erlaubt die proviralen Konstrukte direkt in 293T-Zellen transfiziert werden, und für die Wiederherstellung eines klonalen Virus-Stamm identisch mit dem geklonten gag-Sequenz.

Die nachstehenden Verfahren ein Hochdurchsatzverfahren zur Bewertung der Replikationsfähigkeit des Subtyps C abgeleitet Gag-MJ4chimären Viren. Transfektion in 293T-Zellen ist einfach und Virusgewinnung erfolgt nur drei Tage. In vitro Replikationskapazität auf demselben CEM-CCR5 basierend T-Zell-Linie, die durch Brockman et al untersucht. 37, aber unter Verwendung von für die erfolgreiche Replikation notwendig wichtiges Protokoll Modifikationen des Subtyps C MJ4 chimären Viren. Die Verwendung einer geeigneten T-Zell-Linie anstatt PBMCs ermöglicht eine große Anzahl von Subtyp C MJ4-chimären Viren mit hoher Reproduzierbarkeit Assay getestet werden. Schließlich, unter Verwendung einer radioaktiv markierten Reverse-Transkriptase-Assay zur Quantifizierung von Virus im Überstand ist kostengünstiger als die Verwendung von kommerziell erhältlichen p24-ELISA-Kits. Es gibt auch einen höheren Dynamikumfang, die wichtig zur Erkennung beide schlecht und sehr replizierende Viren innerhalb der gleichen Assay zum Nachweis und feine Unterschiede in der Replikation zwischen Isolaten war.

Im Ergebnis hat das hier vorgestellte Verfahren zur gestattetDie eingehende Untersuchung der Replikationskapazität von gag-Sequenzen von HIV-1 Subtyp C abgeleitet akut infizierten Personen aus Sambia und wie geschrieben, könnte auch erweitert werden, um andere Subtyp C infiziert Populationen zu untersuchen. Ein hohes Maß an Variation in der Replikation zwischen verschiedenen Kapazitäten Gag Isolate beobachtet. Darüber hinaus waren wir in der Lage, eine statistische Assoziation zwischen der Kapazität der Replikation übertragen Gag und Sollwert der Viruslast als auch mit CD4 + Rückgang über einen Zeitraum von drei Jahren 39 zeigen. Solche Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Untersuchung, wie tragene Viruseigenschaften, wie Replikationskapazität, die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts zu Pathogenese während der frühen Infektion beeinflussen und Integral für die Entwicklung wirksamer Impfstoff Interventionen als auch die Behandlung sein.

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Protokoll

1. Verstärkung der HIV-1-gag-Gens von infizierten, Frozen Plasma

  1. Extrahieren viraler RNA aus 140 ul aufgetaut HIV-1 infizierten Plasma unter Verwendung eines Extraktions-Kits.
    1. Wenn möglich, sofort nach RNA-Extraktion als nicht gefrorenen virale RNA liefert die besten Ergebnisse Verstärkung der cDNA-Synthese stattfindet. Wenn möglich, einzurichten PCR Master Mix für die erste Runde der DNA-Amplifikation und bei 4 ° C vor der viralen RNA-Extraktion.
  2. Reverse Transkription und cDNA aus RNA und verstärken ersten Runde DNA-Produkte mit Reverse-Transkriptase und eine thermostabile DNA-Polymerase in einer Ein-Schritt-RT-PCR.
    1. Nehmen RNA von -80 ° C Gefrierschrank (wenn Gefrierpunkt notwendig war) und kurz bei Raumtemperatur auftauen, dann in kaltem Block. Übertragungs 5 ​​ul RNA zu jedem PCR-Röhrchen mit 45 ul der Stammmischung, um ein Endvolumen von 50 ul zu ergeben. Sofort platzieren verbleibenden RNA-Proben in -80 ° C Gefrierschrank.
    2. Nach Enzym einedded zu der ersten Runde PCR Master Mix (Tabelle 1A), aliquote 45 ul in jedes dünnwandigen PCR-Amplifikation Rohr für die Anzahl der gewünschten Reaktionen. Achten Sie darauf, PCR-Röhrchen mit Einzeldeckeln verwenden und nicht abstreifen Kappen auf minimale Kreuzkontamination zwischen den Proben zu gewährleisten. Zeigen PCR-Röhrchen in einem kalten Block, um die temperaturempfindlichen RT-Enzym RNA-Matrize und zu schützen. Hinweis: Proben sollten in dreifacher Ausfertigung, um die viralen Quasispezies ausreichend Probe durchgeführt werden. Es ist auch wichtig, um ein Produkt mit einer High Fidelity DNA-Polymerase-Enzym, um die PCR-Fehleinbau eingeführt minimieren nutzen. Bitte beachten Sie die Reagenzien Liste für die empfohlene Produkt.
    3. Nach RNA-Matrize wurde bei allen Reaktionsröhrchen zugesetzt, übertragen PCR-Röhrchen mit einem Thermocycler zur Amplifikation unter Verwendung der in Tabelle 1b beschrieben Cyclerprogramm. Anmerkung: Das Produkt dieser Amplifikation werden in einer zweiten Runde nested PCR verwendet werden.
  3. Führen Sie eine verschachtelte second-Runde der PCR-Amplifikation unter Verwendung von 1 ul der ersten Runde der PCR-Amplifikation (1.2) als DNA-Matrize.
    1. Aliquot 49 ul zweiten Runde PCR Master Mix (Tabelle 2A) zu jeder dünnwandigen PCR-Röhrchen für die Anzahl der gewünschten Reaktionen. Übertragungs 1 ul aus der ersten Runde der PCR-Amplifikation zu jedem Reaktionsgefäß, um ein Endvolumen von 50 ul zu ergeben. Hinweis: Dies wird als Template-DNA für die zweite Runde Verstärkung dienen. Es ist auch wichtig, um eine DNA-Polymerase mit sehr hoher Genauigkeit und Korrekturmöglichkeiten, um die PCR-Fehleinbau eingeführt minimieren nutzen. Bitte beachten Sie die Reagenzien Liste für die empfohlene Produkt.
    2. Übertragen zweiten Runde PCR-Reaktionsmischung zu Thermocycler und in Tabelle 2B beschrieben Lauf-Programm. Anmerkung: Nach Abschluss des Programms werden die Produkte dieser Reaktion wurden auf einem Agarose-Gel laufen gelassen, um die Produktion des Produktes zu bestätigen.
  4. Hinzufügen 3 ul 5x Ladepuffer bis 5 & #181; l der 50 ul der zweiten Runde Reaktionsvolumen und bei 120 V auf einem 1% Agarose-TAE-Gel mit einem UV-fluoreszierenden DNA-Farbstoff ausgeführt, bis Banden aufgelöst werden. Visualisieren 1,6 kb Banden auf einem blauen Lichtbeleuchtung (siehe Abbildung 1a).
  5. Führen Sie die restlichen 45 ul Reaktionsvolumen auf einem 1% igen TAE-Gel, die eine DNA-Färbung, und der Verbrauch die entsprechenden Banden mit einem sauberen Rasierklinge.
    1. Extrahieren DNA aus dem Gel Scheibe mit einem Gel Purification Kit, eluieren in Nuklease-freies Wasser, kombinieren drei positive Reaktionen pro Einzel und gefrier Produkt bei -20 ° C für die spätere Verwendung.

2. Vorbereitung Gag Amplikons für Klonen von Einführung der notwendigen Beschränkung Seiten

  1. Verstärken die Long Terminal Repeat (LTR) / 5 'UTR Teil des MJ4 Plasmid (siehe Tabelle 3).
  2. Visualisieren 1,3 kb PCR-Produkte auf Illuminator, Verbrauch positive Amplikons, Gel reinigen und einfrieren, wie vorherbeschrieben (1.4,1.5, siehe Abbildung 1B).
  3. Verschmolzen MJ4 LTR- Gag Amplikons über "splice-Overlap-Extension" Create PCR (siehe Tabelle 4).
  4. Visualisieren, Verbrauchssteuern, zu reinigen, und frieren die 3,2 kb Amplikons wie in 1.4,1.5 (siehe Abbildung 1c).

3. Klonierung Amplified gag-Gene in die MJ4, Subtyp C, Infektions Molekulare Klon

  1. Verdauen 1,5 ug MJ4 Plasmid und 1,5 ug gereinigt LTR- Gag-PCR-Produkt mit dem BclI (Methylierung empfindlich) Restriktionsendonuklease für 1,5 h bei 50 ° C (siehe Tabelle 5a).
  2. 1 ul NgoMIV auf die Aufschlussreaktion und bei 37 ° C für 1 Stunde.
  3. Hinzufügen 5x Lade Farbstoff Restriktionsverdau Reaktionen und langsam Elektrophorese das Gesamtvolumen auf einem 1% igen TAE-Gel mit einem DNA-Gel-Färbung für 1-2 h bei 100 V. visualisieren, Verbrauch und reinigen angegebenen Bänder für das Klonen, wie vorher absteigendribed (siehe Abbildung 2).
  4. Bereiten Ligationsreaktionen unter Verwendung von gereinigtem LTR- Gag Einsatz und MJ4 Vektor-DNA in einem 3: 1-Einsatz auf Vektorverhältnis. Ligationsreaktionen über Nacht bei 4 ° C inkubieren (siehe Tabelle 5B).
  5. Verwandeln JM109 chemisch kompetente Bakterien mit Ligationsprodukte und auf LB-Agar-Platten mit 100 ug / ml Ampicillin und wachsen bei 30 ° C für 22 + Stunden.
    1. Auftauen JM109 kompetente Zellen auf Eis für 15 min. Beschriften Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Chill auf Eis.
    2. Aliquoten 50-100 ul JM109-Zellen vor, gekühlt 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen 2,5-5 ul Ligationsreaktion zu JM109-Zellen und schnippte Rohr leicht zu mischen und sofort wieder in Eis. Kompetenten Zellen mit Ligationsprodukt zu inkubieren auf Eis für 30 min.
    3. Hitzeschock 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit JM109 kompetente Zellen und Ligationsreaktion in einem 42 ° C Wärmeblock für 45 sec und zum Eis für mindestens 3 min.
    4. Fügen Sie 50 ul SOC-Medium zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen und Platte die gesamte Transformationsansatz auf Raumtemperatur LB-Agar-Platten mit 100 ug / ml Ampicillin.
    5. Übertragungsplatten zu einer 30 ° C-Inkubator und lassen für 20 Stunden oder bis Kolonien sind deutlich ausgebildet.
  6. Pick isolierte Kolonien wachsen und in 4 ml LB mit 100 ug / ml Ampicillin bei 30 ° C für 22 + h.
  7. Spin-Down-Kulturen bei 3.200 g für 15 min, abgießen Brühe, und Plasmid-DNA zu extrahieren.
  8. Um zu bestätigen, Klonen Treue, schneiden Miniprep-DNA mit NgoMIV und HpaI Restriktionsenzyme im Doppel verdauen bei 37 ° C für 2 Stunden. Analysieren auf 1% Agarose-TAE-Gel (siehe Tabelle 5C).
  9. Reihenfolge der LTR-gag Einsatz Bereich jedes Plasmid unter Verwendung der folgenden Primer: GagInnerF1, GagF2, Rev1, Rev3 und GagR6 (Tabelle 6), um Sequenzidentität zu bestätigen.
  10. Vergleichen Sie die mit der Bevölkerung Sequenzen der klonierten Sequenzen erhaltenvon der ersten gereinigten Amplikon von 1.5.1 Ived. Hinweis: Es ist wichtig, letztlich beurteilt die Replikationskapazität von zwei unabhängigen Klonen, um sicherzustellen, daß die in vitro-Replikation Phänotypen aufgrund Rückgrat Fehler während des Kopiervorgangs eingebracht.

4. Erzeugung und Titrierung von Replikations-kompetenten Gag-MJ4 chimären Viren

  1. Erzeugen Replikation zuständigen Virus durch Transfektion von 1,5 ug des chimären Plasmid Miniprep MJ4 DNA in 293T-Zellen mit einem 4: 1-Verhältnis von Fugene HD wie von Prince et al 39 beschrieben.
  2. Titer geerntete Virus Aktien auf TZM-bl-Zellen wie unten und in Prince et al 39 beschrieben.
    1. Platte TZM-bl-Zellen 24 h vor der Infektion mit dem Virus um eine 30-40% konfluenten Zellmonoschicht auf den folgenden Tag haben. Dies kann in der Regel durch Zugabe von 5 × 10 4 Zellen in einem Gesamtvolumen von 800 ul pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte erreicht werden.
    2. Nach der Zugabe von Zellen, um den Brunnen, sanft bewegen Sie den 24-Well-Platte vor und zurück, dann Seite, um effizient zu verteilen Zellen Seite. Nie wirbeln - das wird in den Zellen, der sich in der Mitte der Platte führen.
    3. Am folgenden Tag vorzubereiten 1% FBS in DMEM; Dies wird verwendet, um DEAE-Dextran zu verdünnen und Virusstämme zu verdünnen. Lager DEAE-Dextran ist 10 mg / ml oder 125x und eine Endkonzentration von 80 ug / ml oder 1 x erwünscht ist.
    4. Nehmen Sie Virus-Stock, von -80 ° C Gefrierschrank und auf Schüttler getestet werden, um bei Raumtemperatur auftauen.
    5. Mit einer Mehrkanalpipette, seriell verdünnte Virusstämme in einem Rundgewebekultur behandelt 96-Well-Platte mit Deckel. Dies ist ein 3-facher Verdünnung Protokoll. Siehe Tabelle 7 für die Verdünnungsschema.
    6. Entfernen Sie das Medium aus ausgesät TZM-bl 24-Well-Platten mit einer Vakuumsauger dafür, dass nicht auf Zellschicht stören. Entfernen Sie die Medien aus einem 24-Well-Platte in einer Zeit, so dass die Zellen zu tunnicht austrocknen.
    7. Fügen Sie 150 ul der 1x DEAE-Dextran + 1% FBS in DMEM-Mischung in jede Vertiefung mit einem 1000 ul Pipette. Verwenden Sie nicht wiederholen Pipette, da dies stört die Monoschicht.
    8. Jeweils 150 ul jeder Virusverdünnung in die entsprechende Vertiefung. Fügen Virus auf der Mitte der gut und vorsichtig schwenken gleichmäßig zu verteilen Virus über die Zellschicht. Inkubieren infizierten Zellen für 2 h in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2.
    9. Nach der 2-stündigen Inkubation mit 0,5 ml 10% FBS in DMEM in jede Vertiefung und Rückplatten Inkubator für weitere 48 Stunden.
    10. Nach 48 Stunden sollten die Zellen 100% konfluent sein. Da MJ4 ist ein kompetenter Replikation Virus, wird es einige Zelltod zu sein, aber das ist zu erwarten.
    11. Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 400 ul / Vertiefung Fixierungslösung (siehe Tabelle 8A für Rezept). Fix nur eine Platte zu einer Zeit. Fügen Befestigungslösung unter Verwendung eines 1000 ul Pipette, und lassen Sie sich für 5 min beiRaumtemperatur.
    12. Fixierungslösung entfernen und waschen 3x mit PBS mit Ca 2 + / Mg 2 +. Verwenden Sie eine Spritzflasche vorsichtig auf die Seite der PBS auch hinzufügen, um nicht zu stören die Monoschicht. Nach dem dritten Waschen, trocknen Platte auf saugfähigem Papier trocken.
    13. Geben Sie 400 ul / Färbelösung (siehe Tabelle 8B für Rezept) zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platte, und bei 37 ° C für mindestens 2 Stunden. Längere Inkubationszeiten sind akzeptabel, aber Inkubationszeiten sollte konsistent Titrierung Experimente aufbewahrt.
    14. Wasch 2x mit PBS mit Ca 2 + / Mg 2 + und Tor für eine Infektion, oder fügen PBS und bei 4 ° C für die Wertung später. Platten können bei 4 ° C für bis zu vier Tage gehalten werden, solange die Monoschicht hydratisiert gehalten.
    15. Um Infektionen zählen, verwenden Sie eine dauerhafte Markierung, um Vertiefungen der 24-Well-Platte in Quadranten aufteilen. Zählen Sie alle blauen Zellen in einem Sichtfeld, mit einer Gesamtvergrößerung von 200X, einmal injeder der vier Quadranten eines gut.
    16. Berechnen Sie infektiösen Einheiten pro ul wie folgt: [(# blauen Zellen / 4) x 67] / (ul-Virus hinzugefügt) = IE / ul. Siehe Tabelle 8C Volumen ul Virus zu jeder Vertiefung gegeben. Durchschnittliche mehrere Brunnen zusammen; die Zahlen sollten für eine genaue Titration relativ ähnlich sein.

5. Herstellung von Kultur, Medien und Ausbreitung von GXR25 Zellen für in-vitro-Assay-Replikation

  1. Bereiten komplettem RPMI (cRPMI) für die Vermehrung von Zellen GXR25. HINWEIS: Es ist sehr zu Kultur GXR25 Zellen mindestens 4 Monate vor der geplanten Experimente Replikation wichtig (siehe Tabelle 9).
  2. Geteilte Zellen 1.10 zweimal pro Woche aufrechterhalten Zelldichte von 1 × 10 5 bis 2 × 10 6 Zellen / ml.

6. In-vitro-Replikation von Gag-Chimären in MJ4 GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Zellen

  1. Am Tag vor dem infection auf eine Konzentration aufgeteilt Zellen zwischen 2-3 × 10 5 Zellen / ml, so dass sie in der logarithmischen Wachstums am Tag der Infektion.
  2. Am Tag der Infektion, Virus entfernen Aktien von -80 ° C Gefrierschrank und Tauwetter. Berechnen des Volumens des Virus von jedem Lager benötigt auf der Grundlage der IE / ul Titer von TZM-bl-Zell-Assay, um auf 5 × 10 5 Zellen zu infizieren GXR25 bei einer Multiplizität der Infektion von 0,05 nach der Formel:
    Volumen der Virus für die Infektion (ul) = 1 ul / X IU x 0,05 x 500.000
    HINWEIS: Wir haben eine MOI von 0,05 gewählt, da dies zu einer logarithmischen Wachstumsphase für alle Viren, die wir getestet haben. Es ist wichtig, erste Versuche, um die optimale MOI bestimmen logarithmischen Wachstums erfassen für das Virus getestet befragen.
  3. Verdünnen Virus in cRPMI auf ein Volumen von 100 ul (um eine 0,05 MOI zu erreichen), und fügen Sie in eine Vertiefung einer Gewebekultur, V-Boden behandelt 96-Well-Platte. Hinweis: Fügen Sie sowohl eine positiVE (MJ4 WT infizierten) und eine negative (mock-infizierten Zellen) Kontrolle in jedem Satz von Replikationsexperimenten. Einrichten der Platte, so dass jede andere Spalte leer, um Kreuzkontaminationen zwischen Brunnen begrenzen. Die positive Kontrolle ist zwingend erforderlich, wie es später als ein Standard verwendet, um die Replikation Pisten, die ein Maß für die Replikationsrate von Experimentwiederholungen sind normalisiert werden.
  4. Graf GXR25 Zellen mit Hilfe eines automatisierten Zellzähler. Berechnen der Anzahl der Zellen in Summe für alle Infektionen (5 x 10 5 x # Infektionen) benötigt. Aliquots des erforderlichen Volumens in einen 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Zellen zu pelletieren. Immer für 25% mehr Infektionen berechnen als nötig.
  5. Aspirat Medien vorsichtig resuspendieren in cRPMI in einer Konzentration von 5 x 10 5 Zellen / 100 ul.
  6. Pipette Zellen in ein steriles Trog und gründlich mischen. Verwendung einer Mehrkanalpipette je 100 ul der Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit der verdünnten Virus. Mix gründlich.
  7. Add 2 ul 5 mg / ml (100x) Lösung von Polybren in jede Vertiefung und mischen Zellen gründlich.
  8. Bei 37 ° C in Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO 2 für 3 Stunden.
  9. Um infizierte Zellen zu waschen, Zentrifuge 96-Loch-V-Bodenplatte Zellen zu pelletieren. Dann entfernen Sie vorsichtig 150 ul des Mediums und ersetzen mit frischen 150 ul cRPMI ohne das Zellpellet zu stören. 2 weitere Male wiederholen (einschließlich Zentrifugation) zu den Zellen ausreichend zu waschen.
  10. Nach der letzten Zentrifugation und Zugabe von 150 ul cRPMI, Zellpellet mit einer Mehrkanalpipette und fügen die gesamte Zell / Virus-Gemisch (etwa 200 ul) aus jeder Vertiefung unabhängig zu 800 ul cRPMI in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebe Kulturplatte.
  11. Ort Platte in 5% CO 2-Gewebekulturbrutschrank bei 37 ° C aufweist.
  12. Alle zwei Tage entfernt 100 ul des Überstandes von der Oberfläche des Kulturvertiefung und in ein 96-Loch-U-bottom Platte und bei -80 ° C eingefroren, bis die Quantifizierung läuft Virus-Assay. ANMERKUNG: Eine sorgfältige Anordnung der Überstände in 96-Well-Platten für Mehrkanalpipette Übertragung von Kulturüberständen im Virion Quantifizierung mittels eines radioaktiv markierten Reverse-Transkriptase (RT)-Assay zu ermöglichen. Jede Platte sollten die Proben von einer Infektion Standard, um inter-Platte Variation in der RT-Test Anzeige normalisieren enthalten.
  13. Nach dem Entfernen jeweils 100 ul Probe, geteilte Zellen 1: 2 durch gründlich resuspendiert Zellen und Entfernen der Hälfte des verbleibenden Volumens (450 ul). Wiederherstellen der ursprünglichen Volumen (1 ml) durch Zugabe von 550 ml frisches cRPMI in jede Vertiefung.

7. Analyse der Reverse Transcriptase (RT) in Zellkulturüberständen

Protokoll angepasst von Ostrowski et al 40.

  1. Einrichten biologischer Schutzhaube in einer Anlage BSL-3 für den Einsatz mit radioaktiven Stoffen.
    1. Zeigen saugfähigem Papier in hood und ersetzen Absauger für Absauger für radioaktive Verwendung bezeichnet. Hinweis: Alle radioaktiven Abfälle müssen ordnungsgemäß mit entsprechend der Sicherheitsbestimmungen entsorgt werden.
  2. Hinzufügen 1-2 ul 10 mCi / ml [33 P α-] dTTP und 4 ul 1 M Dithiothreitol (DTT) zu je 1 ml-Aliquot der RT-Mastermischung (siehe Tabelle 10 und Ostrowski et al. 40).
  3. Je 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen von RT Master Mix, DTT und [α- 33 P] dTTP sorgfältig mischen mit einem 1000 ul Pipette und in ein steriles Trog.
  4. Verzichten 25 ul der markierten RT in jede Vertiefung der 96-Well-dünnwandigen PCR-Platte zu mischen. Hinweis: Fügen Sie Platz für eine positive Kontrolle (MJ4 WT-Infektion) und Negativkontrolle (Mock-Infektion).
  5. Geben Sie 5 ul jeder Überstand auf der PCR-Platte, die die RT Master Mix.
  6. Siegel PCR Platte mit Haftklebefolienabdeckung und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C in einem Thermocycler. Aus Sicherheitsgründen rinse Pipettenspitzen mit Amphyl und entsorgen Tipps in kleine Behälter, Amphyl Abfälle, die später von in radioaktiver Abfall entsorgt werden.
  7. Nach der Inkubation machen kleine Löcher in der Deckfolie mit einer 200 ul Mehrkanalpipette. Hinweis: Wenn Pipettenspitzen berühren Flüssigkeit in gut ersetzen Tipps, bevor Sie zur nächsten Spalte oder Zeile.
  8. Mischungsproben 5x und Transfer 5 ul jeder Probe auf die DE-81-Papier. Luft trocknen 10 min.
  9. Wasch Blots 5x mit 1x SSC (Natriumchlorid, Natriumcitrat) und anschließend 2x mit 90% Ethanol bei 5 min pro Waschung. An der Luft trocknen.
    1. Setzen Sie jeden Fleck in einem separaten Waschbehälter, wie ein Sandwich Aufbewahrungsbox, fügen Sie genug Waschpuffer (1x SSC oder 90% EtOH) zu decken Blot, und schütteln für 5 min.
    2. Abgießen Waschpuffer in separate Behälter und wiederholen. Hinweis: Die ersten 3 Wäschen werden als radioaktiv und müssen ordnungsgemäß entsorgt werden. Die letzten 2 Wäschen kann regelmäßig entsorgt werden.
  10. Einmal trocken, Autoefully wickeln Blot in Frischhaltefolie und setzen auf eine phosphoscreen in einem dicht verschlossenen Kassette über Nacht bei Raumtemperatur.
  11. Analysieren phosphoscreens mit einem Phosphor und Quantifizierung radioaktiver Transkripte.
  12. Zeichnen Sie einen Kreis um jeden radioaktives Signal mit OptiQuant Software. Die Werte grafisch darstellen Digital Light Unit (DLU), um die Replikation Kurven zu generieren.
  13. Um Replikationskapazität Partituren zu erzeugen, waren DLU Werte log 10 -transformierten und Pisten wurden mit dem Tag 2, 4, und 6 Zeitpunkten. Replikation Pisten werden dann durch die Steigung der WT MJ4, um zu generieren Replikationskapazität Noten unterteilt. Es ist wichtig, auf der Grundlage der Werte MJ4 WT aus der gleichen RT Platte erhalten, um Intra-Assay-Variabilität zu reduzieren normalisieren.

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Ergebnisse

Um dieses Protokoll, das einen proviralen Plasmid in der Lage, voll funktions Montage, Infektions Gag-Chimären erzeugt MJ4 richtig auszuführen, muss sorgfältig darauf geachtet, die entsprechenden PCR-Produkte erzeugen. Ermitteln, ob die PCR hat den entsprechend großen Gag Amplikon erzeugt wird, ist von entscheidender Bedeutung. Produkte sollten innerhalb von 100 Basenpaaren (bp) von der in 1A dargestellt ca. 1.700 bp Amplikon sein. Die genaue Länge dieses Fragments wird in Abhängigkeit von der ...

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Diskussion

Aufgrund der Länge und die Art der diesem Protokoll gibt es mehrere Schritte, die für die sowohl die erfolgreiche Konstruktion von chimären Gag-MJ4 Plasmide als auch für die Quantifizierung der viralen Replikationskapazität sind. Obwohl das Restriktionsenzym basierte Klonen Strategie für die Einführung von Fremdgenen in MJ4 Gag in diesem Protokoll beschriebenen hat zahlreiche Vorteile gegenüber bisher verwendeten Rekombination basierte Methoden, kann das Protokoll technisch eine Herausforderung sein, wenn kriti...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Forscher danken allen Freiwilligen in Sambia, die an dieser Studie teilgenommen haben, und allen Mitarbeitern des Zambia Emory HIV Research Project in Lusaka, die diese Studie möglich gemacht haben. Die Ermittler danken Jon Allen, Smita Chavan und Mackenzie Hurlston für die technische Unterstützung und das Probenmanagement. Wir möchten uns auch bei Dr. Mark Brockman für seine Gespräche und die großzügige Spende der GXR25-Zellen bedanken.

Diese Studie wurde von R01 AI64060 und R37 AI51231 (EH) und der International AIDS Vaccine Initiative finanziert. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die großzügige Unterstützung der amerikanischen Bevölkerung durch die United States Agency for International Development (USAID) ermöglicht. Der Inhalt liegt in der Verantwortung der Studienautoren und spiegelt nicht unbedingt die Ansichten von USAID oder der Regierung der Vereinigten Staaten wider. Diese Arbeit wurde auch teilweise durch den Virology Core am Emory Center for AIDS Research unterstützt (Grant P30 AI050409). DC und JP wurden zum Teil von Action Cycling Fellowships unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Yerkes National Primate Research Center Base Grant (2P51RR000165-51) unterstützt. Dieses Projekt wurde ebenfalls teilweise vom National Center for Research Resources P51RR165 finanziert und wird derzeit vom Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132 unterstützt.

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Materialien

Zellkulturreagenzien
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PCR Reagenzien
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, Standard Entsalzung
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Nuklease freies WasserFisherSH30538FSHergestellt von Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 Strip Tubes, Blau (Schieberverschluss)DaiggerEF3647BX
SuperScript III einstufiges RT-PCR-SystemLife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II DNA-PolymeraseFisherF-549L
PCR Nukleotid MixRoche4638956001
Agarose, hohe GelstärkeFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb DNA-LeiterFisherPRG5711Hergestellt von Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10.000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV Gel und PCR-ReinigungssystemPromegaA9282
Rasierklingen, einschneidigFisher12-640Hergestellt von Surgical Design
Thermocycler, PTC-200MJ Research
Mikrobiologie & Klonierungsreagenzien
LB Agar, MillerFisherBP1425-2
LB Brühe, LennoxFisherBP1427-2
Sterile Petrischalen aus Polystyrol 100 x 15 mmFisher08-757-12
Ampicillin-NatriumsalzSigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml Polypropylen-RundbodenröhrchenBD Biosciences
NgoMIV-RestriktionsendonukleaseNew England BioLabsR0564L
BclI-RestriktionsendonukleaseNew England BioLabsR0160L
HpaI-RestriktionsendonukleaseNew England BioLabsR0105L
T4 DNA-Ligase, 5 U/μ lRoche10799009001
JM109 kompetente Zellen, >108 KBE/μ gPromegaL2001
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1222
Safe Imager 2.0 Blaulicht-TransilluminatorInvitrogenG6600
Microfuge 18 ZentrifugeBeckman Coulter367160<
Amphyl Reinigungs-/DesinfektionsmittelFisher22-030-394
Fugene HD, 1 mlVWRPAE2311Hergestellt von Promega
Hexadimethrinbromid (Polybrene)Sigma-AldrichH9268-5G
Costar Plates, 6-Well, flachFisher07-200-83Hergestellt von Corning
Life Costar Plates, 24-Well, flachFisher07-200-84Hergestellt von Corning Life
Costar Plates, 96-Well, rundFisher07-200-95Hergestellt von Corning Life
Flasks, Corning Filter Top/Schräghals, 75 cm2Fisher10-126-37
Kolben, Corning Filter Top/Schräghals, 150 cm2Fisher10-126-34Hergestellt von Corning Life
Conical Tubes, 50 ml, blaue KappeFisher14-432-22Hergestellt von BD Biosciences
Conical Tubes, 15 ml, blaue KappeFisher14-959-70CHergestellt von BD Biosciences
Trypsin-EDTAFisherMT25052CIHergestellt von Mediatech
RPMI, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
Penicillin/ Streptomycin/Glutamin, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS mit Magnesium und Calcium, 500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS ohne Magnesium und CalciumLife Technologies/Invitrogen20012-050
Sarstedt Tuben, farblich sortiertSarstedt72.694.996
Reservoirwannen für Mehrkanal, 55 mlFisher13-681-501
DEAE-DextranFisherNC9691007
Corning 96 Well Clear V Bottom Tissue Culture behandelte MikrotiterplatteFisher07-200-96Hergestellt von Corning Life
HEPES, 1 M Buffer SolutionLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, definiert, 500 mlFisherSH30070 03
X-GalVWRPAV3941Hergestellt von Promega
Glutaraldehyd, Grade II, 25% in H2O Sigma-AldrichG6257-100ML
1 M MagnesiumchloridlösungSigma-AldrichM1028-100ML
Formaldehydlösung, für die Molekularbiologie, 36,5%Sigma-AldrichF8775-500ML
Kalium Hexacyanoferrat(II)-TrihydratSigma-AldrichP9387-100G
Kaliumhexacyanoferrat(III)Sigma-AldrichP8131-100G
Allegra X15-R ZentrifugeBeckman Coulter392932
TC10 automatisierter ZellzählerBio-Rad1450001
VistaVision inverses MikroskopVWR
Reverse-Transcriptase Quantification Assay Reagenzien
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8,0Life Technologies/Invitrogen15568025auf pH 7,8 eingestellt
werdenLife Technologies/InvitrogenAM9640GAdjust bis 1 M Lösung
0,5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
Polyadenylsäure (Poly rA) Kaliumsalz Midland Reagenz Co.P-3001
Oligo d(T) PrimerLife Technologies/Invitrogen18418-012
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, Super Resolution Phosphor Screen, SmallPerkin-Elmer7001485
Corning Costar Schutzhülse 96-Well-Platte Modell (M) PolycarbonatFisher07-200-245Hergestellt von Corning Life
Corning 96-Well-Mikroplatten-Aluminium-Dichtungsband, unsterilFisher07-200-684Hergestellt von Corning Life
DE-81 AnionenaustauschpapierWhatman3658-915
Trinatriumcitrat-DihydratSigma-AldrichS1804-1KG
NatriumchloridFisherS671-3
Autoradiographie-KassetteFisherFB-CA-810
Zyklon-Lager-Phoshpor-SiebPackard
352059td colspan="4"> Muss mit KOH 2 M Kaliumchlorid (KCl)

Referenzen

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