Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Zusammenfassung

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Zusammenfassung

Seit mehr als 20 Jahren hat sich umgekehrter Pharmakologie war die herausragende Strategie, um die aktivierende Liganden von Orphan-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) zu entdecken. Das Einsetzen eines Reverse Pharmakologie Assay ist die Klonierung und anschließende Transfektion eines GPCR von Interesse in einem zellulären Expressionssystem. Das heterologe exprimierten Rezeptor wird dann mit einer Verbindungsbibliothek von Kandidaten-Liganden in Frage, um die Rezeptor-aktivierende Ligand (en) zu identifizieren. Rezeptoraktivierung durch Messung der Veränderungen in der Konzentration des zweiten Botenreportermoleküle, wie Calcium-oder cAMP geprüft. Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein häufig verwendetes Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Test. Der Orphan-GPCR wird vorübergehend in humanen embryonalen Nieren 293T (HEK293T-Zellen) exprimiert und ein Promiscuous _{Ga-16-Konstrukt} kotransfiziert. Nach Ligandenbindung, die Aktivierung der G &agr;-Untereinheit ₁₆ induziert die Freisetzung von Calcium-fROM Die endoplasmatischen Retikulum. Vor der Liganden-Screening werden die Rezeptor-exprimierenden Zellen mit einem fluoreszierenden Calciumindikator Fluo-4 Acetoxymethyl geladen. Das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 vernachlässigbar ist in Zellen, die unter Ruhebedingungen, kann aber mehr als eine 100-fache bei der Wechselwirkung mit Calciumionen, die nach Rezeptoraktivierung freigesetzt werden, verstärkt werden. Das beschriebene Verfahren erfordert nicht die zeitaufwendige Errichtung von stabil transfizierten Zelllinien, in denen die transfizierte genetische Material in das Wirtszellgenom integriert. Stattdessen wird eine transiente Transfektion, Erzeugen temporärer Expression des Zielgens, ist ausreichend, um die Screening-Assay durchzuführen. Der Aufbau ermöglicht Mitteldurchsatz-Screening von Hunderten von Verbindungen. Co-Transfektion der Promiscuous G &agr; _16, die Paare zu den meisten GPCRs ermöglicht die intrazellulären Signalweges in Richtung der Freisetzung von Calcium umgeleitet werden, unabhängig von der nativen Signalweges der endogenen Pflastergen. Die HEK293T-Zellen sind leicht zu handhaben und haben ihre Wirksamkeit im Laufe der Jahre in deorphanization Rezeptor-Assays nachgewiesen. Jedoch kann die Optimierung des Assays für spezifische Rezeptoren notwendig bleiben.

Einleitung

G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bilden eine der größten und vielfältigsten Familien unter allen Zelloberflächenproteine. Ihre Anwesenheit bei Wirbeltieren, Wirbellose, Pflanzen, Hefe und Schleimpilz, als auch in Protozoen und frühestens diploblastic Metazoa zeigt an, dass GPCRs gehören zu den ältesten Moleküle mit Signaltransduktion ¹ verbunden. Ihre natürliche aktivierenden Liganden umfassen eine große Vielfalt von äußeren Reizen einschließlich Peptide, biogene Amine, Geruchsstoffe, Glykoproteine, ² und Photonen. Als solche sind diese Rezeptor-Ligand-Signalsysteme in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Das breite Funktionsspektrum macht sie ideal für die Entwicklung von Therapeutika, die eine Vielzahl von Krankheiten des Menschen zu decken. Über 50-60% der aktuellen Drogenziele werden durch GPCRs ^3,4 vertreten. Neben ihrer großen Bedeutung in der pharmazeutischen Industrie sind GPCRs auch im Rampenlicht für die Entwicklung einerneue Generation von Spezies-spezifische Insektizide und Pestizide ^5,6 im Allgemeinen. Da die natürlichen Liganden von vielen GPCRs sind noch nicht identifiziert, werden sie als Waise GPCRs eingestuft. Die deorphanization dieser Rezeptoren wird das Verständnis der physiologischen Funktionen in Organismen zu verbessern und kann vermeintlichen Ziele für neue Arzneimittelanwendungen ⁷ aufzudecken.

Da die genomische Zeit wird die Rückwärts pharmakologischen Strategie häufig für die deorphanization von GPCRs ⁸ angelegt. Der Ansatz impliziert, dass ein Orphan-Rezeptor wird als "Haken" zu "Fisch aus" seiner aktivierenden Liganden aus einem biologischen Extrakt oder aus einer Bibliothek von synthetischen Verbindungen verwendet. Die GPCR von Interesse ist daher kloniert und anschließend in einem zellulären Expressionssystem transfiziert. In den am häufigsten verwendeten Verfahren wird die Rezeptoraktivierung durch Messung der Veränderungen in der Konzentration des zweiten Botenmoleküle bestimmt ⁹ ​​(zB Aequorin) ¹⁰ oder fluoreszierenden Calcium-Indikatoren (z. B. Fluo-4) ^11. Die Fluoreszenz-basierten Assays, in dem Rezeptor-exprimierenden Zellen mit einem Fluoreszenz-Calciumindikator vor der Liganden-Screening geladen wird, haben den Vorteil, dass sie ermöglichen Hochdurchsatz-Screening durch ihre einfache Bedienung, kurze Lesezeit und die Flexibilität des Screening mehrere Orphan-Rezeptoren auf einer einzigen Platte ^12.

Hier wird die Fluoreszenz basierenden Assay Calciummobilisierung gründlich beschrieben und durch die deorphanization Verfahren der Drosophila melanogaster kurzen Neuropeptid F (sNPF)-Rezeptor dargestellt. Diese neuropeptidergic Signalsystem wurde ursprünglich von Mertens et al aus. 2002 ¹³ mit einem Calcium-Biolumineszenz-Assays in chinesischen Hamstereierstock-(CHO)-Zellen durchgeführt,¹⁴ und von Feng et al. Im Jahr 2003 mit einer elektrophysiologischen Test unter Verwendung von Xenopus Oozyten ^15. Die Anwesenheit des sNPF Signalisierungssystem scheint der zu dem Stamm der Arthropoda, wo es in einer Vielzahl von Verfahren, einschließlich der Regulierung der Zufuhr, des Wachstums, Stressreaktionen, Fortbewegung, und zirkadiane Rhythmen beteiligt ¹⁶ begrenzt.

Forschung an neuropeptidergic Signalsysteme bei Insekten nicht nur auf neue Ziele für die Entwicklung von Insektiziden führen, aber das Wissen um ihre Funktion kann auch auf andere Organismen wie viele Signalsysteme sind in der Regel gut im Laufe der Evolution konserviert ¹⁷ hochgerechnet werden. In den letzten zehn Jahren große Fortschritte in der deorphanization Prozess der Insektenneuropeptid GPCRs gemacht worden. Trotz dieser Bemühungen haben nur eine geringe Anzahl von Rezeptoren auf ihrer zugehörigen Liganden abgestimmt und Lasten der Sequenzinformation fürneuen Orphan-GPCRs hat sich aufgrund der boomenden Genomik ¹⁸ zur Verfügung. Die Verfügbarkeit der Mittel / Hochdurchsatz-Screening-Methoden, wie die Fluoreszenz-basierten Assays Calcium-Mobilisierung, die sich als ein weithin angewandte Technik ^9,18 zu können, ist daher von unschätzbarem Wert.

Die Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay, wie hier beschrieben wird in der menschlichen embryonalen Nieren 293T (HEK293T-Zelllinie) durchgeführt und verwendet eine fluoreszierende Sonde, um Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration auf die Rezeptoraktivierung zu bestimmen. Um hohe Expressionsniveaus und Translation der Rezeptor zu garantieren, wird eine Kozak-Consensus-Sequenz ¹⁹ an das 5'-Ende des Rezeptor-kodierende Sequenz, die anschließend in einen Expressionsvektor (z. B. pcDNA Vektorreihe für Säugerzelllinien) kloniert zugegeben. Da es schwierig ist, die endogenen G-Protein-Kopplung eines verwaisten GPCR basierend auf Sequenzinformation vorherAllein die Second-Messenger-Moleküle (z. B. Calcium-oder cAMP), die nach Rezeptoraktivierung moduliert werden, bleiben oft unbekannt vor Ligand Identifikation. Um dieses Problem zu umgehen, Promiskuität G-Proteine ​​der G _q-Familie (zB _{Maus-Ga-Ga-15} oder Menschen ₁₆ verwendet [hier]) oder chimäre G-Proteine ​​(zB _Ga-qi5), die mit den meisten GPCRs interagieren und induzieren die Freisetzung von Kalzium kann coexprimiert ^20,21,22 werden. Bei Bindung des Liganden an seinen Rezeptor, der GPCR eine Konformationsänderung, die die Aktivierung von spezifischen intrazellulären Signalwege führt. Die Guanosindiphosphat (BIP)-Molekül, unter Ruhebedingungen zu dem _{Ga-16-Untereinheit} gebunden ist, wird von einem Guanosin-Triphosphat (GTP)-Molekül ersetzt werden. Dies provoziert die Dissoziation des heterotrimeren G-Proteins in einer G &agr; ₁₆ und Gβγ-Untereinheit. Die _{Ga-16-Untereinheit} aktiviert Phospholipase C &# 946; (PLC &bgr;), die wiederum hydrolysiert das membrangebundene Phosphatidylinositol-bisphosphat (PIP _2), was zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol-Triphosphat (IP _3). IP ₃ wird während der gesamten Cytoplasma verteilt und aktiviert IP _{3-abhängigen} Calcium in der Membran des endoplasmatischen Retikulums, die die Freisetzung von Calcium in das Zytoplasma induziert vorhandenen Kanäle.

Die Calcium-Freisetzung auf Rezeptor-Aktivierung erfolgt innerhalb von Sekunden und kann durch Laden von Zellen vor der Screening-Test mit einem Calcium-sensitiven Farbstoff, wie Fluo-4 acetoxymethyl (AM) ¹¹ erfasst werden. Die AM-Ester-Gruppe ermöglicht die Fluorophore, die Zellmembran zu durchqueren und wird durch zytoplasmatische Esterasen einmal im Inneren der Zelle gespalten. Folglich werden die negativen Ladungen der Fluoreszenzfarbstoff demaskiert, diffundiert aus der Zelle und ermöglicht es, mit Calciumionen in Wechselwirkung verhindert. Das Fluoreszenzsignal of Fluo-4 ist unter Ruhebedingungen nur Calciumkonzentrationen enthalten, im nanomolaren Bereich vernachlässigbar in den Zellen. Wenn jedoch Calcium auf die Rezeptoraktivierung freigesetzt wird, kann das Signal konzentrationsabhängig auf mehr als das 100fache zu erhöhen, hierdurch gewährleistet ein großes Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Fluo-4 zeigt auch einen großen Dynamikbereich für die Meldung [Kalzium] um einen K _d (Calcium) von 345 nM, so dass es geeignet, physiologisch relevanten Kalzium Änderungen in einer Vielzahl von Zellen zu messen. Die Anregung von Fluo-4 tritt bei 488 nm und die Emissionsfluoreszenz bei 525 nm ¹¹ gemessen. Fluorimetern wie die Fluoreszenz-Imaging-Plattenlesegerät (FLIPR) ^23, der Novostar oder der Flexstation (Station-Gerät) ¹² Medium / High-Throughput-Systeme, die gleichzeitige Verbindung Addition und die Erfassung der Fluo-4-Rezeptor-Signal bei Aktivierung für jeden gut zu ermöglichen in einer Testplatte. Die hier beschriebene Calcium-Mobilisierung Assay beruht auf der StationGerät 96-Well-Mikroplatten-System.

Die SoftMax Pro-Software (Software) wird verwendet, um die Station Einrichtung sowie für die Datenanalyse zu betreiben. Das Programm zeigt sofort die Ergebnisse als Grafiken in 96-Well-Format. Mehrere Vertiefungen gleichzeitig ausgewählt, um das Ergebnis dieser Vertiefungen auf derselben Grafik zu vergleichen. Die relative Fluoreszenzeinheit (RFU) Werte von Vertiefungen in jeder Spalte gleichzeitig für einen Zeitraum von zwei Minuten gemessen, beginnend vor der Zugabe der Verbindungen zu den Vertiefungen und weiterhin nach der Messung des Fluoreszenzsignals nach Rezeptoraktivierung. Typischerweise ist die Tendenz eines Agonisten Kurve ausgerichtet ist, bis die Grundlinie eine aktivierende Verbindung zu den Zellen zugegeben, was zu einem raschen Anstieg des Fluoreszenzsignals. Die Peakhöhe wird mit der endgültigen Konzentration des Agonisten in der gut korreliert. Nach dem Höhepunkt, fällt das Fluoreszenzsignal langsam in Richtung der Grundlinie Niveau. Die RFU Messungen ca.n in Konzentrations-Wirkungs-Kurven umgewandelt, um den EC _50-Wert (halbmaximale effektive Konzentration) eines Liganden zu bestimmen. Im Allgemeinen mindestens drei unabhängigen Bildschirmen, die jeweils drei Replikate einer Konzentrationsreihe, durchgeführt werden sollte, um eine zuverlässige Konzentrationsantwortkurve zu komponieren.

Es wird empfohlen, mehrere positive und negative Kontrollen in der Versuchsanordnung umfassen. Erstens, eine Transfektion Steuerung, dh die Umsetzung eines Rezeptors mit einem bekannten Liganden getestet werden. Dies ermöglicht die Überprüfung, ob das Transfektionsmittel Betrieb war. Einbau von einem Kontrollexperiment mit einem Agonisten für einen endogenen Rezeptor der Zelllinie und einer Negativkontrolle (z. B. Waschpuffer) werden ebenfalls empfohlen, um die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen und die Möglichkeit, dass der Waschpuffer wurde mit kontaminierten auszuschließen ein Faktor, der eine Auto-fluore entlocken konnteDuft Antwort. Häufigsten verwendeten Agonisten sind ein Peptid, das von der Protease-aktivierte Rezeptor 1 _(PAR-1), die als eine PAR _1-selektiven Agonisten oder Carbachol, die die Acetylcholin-Rezeptor aktiviert wirkt abgeleitet. Zellen, die mit einem leeren Expressionsvektor transfiziert sollten auch getestet werden, um auszuschließen, dass Wirkstoffe interagieren mit endogenen Rezeptoren der Zelle. Optimierung von mehreren in der unten beschriebenen Protokoll-Parameter für unterschiedliche Signalsysteme erforderlich. Eine schematische Abbildung der gesamten Fluoreszenz basierenden Calciummobilisierungsassay ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1. Insgesamt Schema der Fluoreszenz-basierten Assays Calcium-Mobilisierung. Automatisierte Liquid Handling und gleichzeitigen Fluoreszenzmessungen werden mit der Station durchgeführtMikroplatten-Lesegerät, von der Software angesteuert. Die Station Gerät enthält drei Schubladen: eine für die Zellplatte, Verbundplatte und Spitze Rack. Die build-in-Pipette Transfers Verbindungen, die aus einer Spalte der Verbindung Platte an die entsprechende Spalte der Zelle Platte (Schritt 1). Jede Vertiefung der Zellplatte enthält eine Monolage von HEK293T-Zellen, die mit dem GPCR von Interesse und den Promiscuous _{Ga-16-Untereinheit} co-transfiziert wurden. Wenn eine Verbindung, die den Rezeptor aktiviert, wird die _Ga-16-BIP gebunden durch GTP ersetzt. Die G &agr;-Untereinheit ₁₆ anschließend dissoziiert von der Gβγ-Komplex und aktiviert Phospholipase C &bgr; (PLC &bgr;), die wiederum hydrolysiert Phosphatidylinositol bisphosphat (PIP _2), was zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol-Triphosphat (IP _3). IP ₃ aktiviert IP _{3-abhängigen} Calcium in der Membran des endoplasmatischen Reticulums Kanälen induzieren die Freisetzung von Calcium into das Zytoplasma. Die Wechselwirkung von Kalzium mit Fluo-4 (bei dem die Zellen vor der Zugabe Verbindung geladen ist) führt zu einem Fluoreszenzsignal (Schritt 2). Die Software stellt die Ergebnisse als relative Fluoreszenzeinheit-Werte (RFU) in Abhängigkeit von der Zeit, und die Peakhöhen korreliert mit der Ligandenkonzentration in einer konzentrationsabhängigen Weise. Diese Daten können dann in einer Konzentration-Antwort-Kurve umgewandelt, um den EC _50-Wert eines Ligand-Rezeptor-Paares (Schritt 3) zu bestimmen.

Protokoll

Hinweis: Alle Aktionen, bei denen Zellen beteiligt sind, sollten in einer sterilen Umgebung durch Arbeiten in einer laminaren Strömung durchgeführt werden.

1. Wartung der Zelllinie HEK293T

1. Wachsen die HEK293T-Zellen in einem T-75-Kolben bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator.
2. Durchgang, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80% erreicht ist. Hinweis: Diese dauert in der Regel 3 bis 4 Tage. Zellen in kontinuierlicher Kultur erlauben 20-25 nutzbare Kanäle für Screening.
   1. Platzieren Sie die Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, PBS-Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (500 ml PBS, ergänzt mit 10 ml Trypsin-EDTA-Lösung und 4,5 ml 4% EDTA) und Wachstumsmedium (500 ml Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium - hohe Glukose [DMEM] mit 10% fetales Rinderserum [FBS] und 1 mM Penicillin-Streptomycin [PS]) bei Raumtemperatur eine halbe Stunde im Voraus ergänzt.
   2. Entfernender alte Wachstumsmedium von den Zellen. Spülen Sie tote Zellen mit 3 ml PBS und entfernen Sie das PBS wieder.
   3. 3 ml PBS-Trypsin-EDTA, nach 1 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie die Lösung Hinweis: Die Morphologie der Zellen ändert sich von sternförmig zu Sphäre förmig.
   4. Lösen Sie die Zellen aus dem Boden des Kolbens durch leichtes Klopfen und sammeln die Zellen durch Spülen der Boden mehrmals mit 10 ml frischem Wachstumsmedium.
   5. 1 ml der Zellkultur in einen neuen T-75-Kolben mit 14 ml frischem Wachstumsmedium, und Inkubation bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator.

2. Transiente Transfektion von HEK293T-Zellen

1. Wachsen die HEK293T-Zellen in einem T-75-Kolben 3 Tage vor dem eigentlichen Test Calcium-Mobilisierung stattfindet. Achten Sie darauf, drei T-75-Flaschen, eine für die Transfektion mit dem Rezeptor-Konstrukt, eine für die Transfektion mit einem leeren Expressionsvektor, als negative Kontrolle und o verwendenne für die Transfektion Kontrolle. Hinweis: Die Passage der Zellen durchgeführt wird, wie in Schritt 1.2 beschrieben. Wenn mehrere 96-Well-Platten müssen untersucht werden, können T-150-Kolben verwendet werden, um eine höhere Ausbeute an Zellen (dies zu tun, Doppel alle aufgeführten Mengen in den Schritten 1.2.5, 2.3, 3.1.3 und 3.1.4) erhalten .
2. Die Kolben werden bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator für 20-24 Stunden, bis die Zellkulturen nähern 50-70% Konfluenz.
3. Co-Transfektion von einer Population von Zellen mit dem Expressionsvektor, der GPCR von Interesse und der _{Ga-16-Konstrukt,} den zweiten Kolben, der mit dem leeren Vektor und dem _{Ga-16-Konstrukt,} und die dritte mit der Transfektion Steuerung und der _{Ga-16-Konstrukt} kodiert. Anmerkung: In diesem Protokoll wurde das Drosophila sNPF Rezeptors in einem Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3.1 ¹³ kloniert. JetPRIME wurde verwendet, um die Transfektion durchzuführen, aber andere Transfektionsreagenzien können ebenso verwendet werden.
   1. Hinzufügen beiotal von 7,8 pg DNA (3,9 ug Rezeptor-Konstrukt oder leeren Vektor und 3,9 ug _{Ga-16-Expressionskonstrukt)} in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 500 ul der jetPRIME Puffer. Durch Vortexen mischen die Röhre, und Spin-Down kurz.
   2. In 37,5 ul der jetPRIME Reagenz, Vortex-und Spin-down für 1 min bei 14.000 x g. Inkubieren Transfektionsgemisch 10 min bei Raumtemperatur.
   3. Füge das Transfektionsgemisch tropfenweise zu dem Zellkulturmedium und sicherstellen, um direkt in das Medium Vermeidung von Kontakt mit den Wänden der Kulturflasche pipettiert. Die Kolben werden bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator für 20-24 Stunden.

3. Calcium Mobilisierung Assay

1. Sammeln Sie die transfizierten Zellen und Saatgut sie in 96-Well-schwarz-walled, klare Bodenplatten.
   1. Platzieren des PBS, PBS-Trypsin-EDTA und DMEM Übertragungsmedium (500 ml DMEM mit 10% dialysiertem FBSund 1% PS) bei Raumtemperatur eine halbe Stunde im Voraus.
   2. Bestreichen Sie die 96-Loch-schwarz-walled, klare Bodenplatten mit 60 ul PBS mit Fibronektin (0,0025%) pro Well (5,85 ml PBS und 150 ul Fibronektin [0,1%] pro Platte). Die Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit dem Deckel auf. Entfernen der Lösung aus den Vertiefungen und Inkubieren der Platten erneut 1 h ohne Deckel bei Raumtemperatur. Alternativ ist es möglich, vorbeschichteten Platten für erhöhte Zellbindung zu verwenden.
   3. Nehmen Sie den alten Wachstumsmedium von den Zellen und spülen toten Zellen mit 3 ml PBS und entfernen Sie das PBS.
   4. 3 ml PBS-Trypsin-EDTA, nach 1 min, dann entfernen Sie die Lösung. Hinweis: Die Morphologie der Zellen ändert sich von sternförmig um kugelförmig.
   5. Lösen der Zellen vom Boden des Kolbens durch leichtes Klopfen und sammeln sie durch Abspülen mehrmals mit 10 ml DMEM Übertragungsmedium. Übertragen der Zellen in ein 50 ml-Falcon-Röhrchen.
   6. Graf dieAnzahl der Zellen pro ml (mit einer NucleoCounter hier durchgeführt, aber ein Burker Kammer ist zulässig). 100 ul der Zellkultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l Lysepuffer zugeben und durch Antippen der Röhre. 100 l Stabilisierungspuffer und mischen durch Antippen.
   7. Füllen Sie eine NucleoCassette mit der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mit dem Zähler. Multiplizieren die Anzahl der Zellen, die durch drei, als die Zellen um einen Faktor drei bei der Zugabe der Lyse und Stabilisierungspuffer in Schritt 3.1.6 verdünnt.
   8. Verdünne die Zellen auf eine Endkonzentration von 600.000 Zellen / ml und Saatgut 150 ul der Zellen pro Vertiefung in den beschichteten Platten um eine Zelldichte von etwa 90.000 Zellen pro / Vertiefung zu erhalten. Vermeiden Sie Luftblasen und tippen Sie auf die Platte, um die Zellen gleichmäßig verteilt, um eine zusammenhängende Zellschicht zu erhalten. Die Inkubation bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator für 16-24 Stunden.
2. Laden der Zellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff und Vorbereitung des Zusammenmpound Platte.
   1. Bereiten Hank-Salzlösung (HBSS) / HEPES / Ca ^{2 +} / Rinderserumalbumin (BSA) Puffer: in 165 ul CaCl ₂ Stammlösung (1 M CaCl ₂ in destilliertem Wasser [dH ₂ O] - Öffnungs bei Raumtemperatur), 500 ul HEPES-Stammlösung (1 M HEPES in dH ₂ O, pH 7,4 - bei Zimmertemperatur), und 0,05 g BSA auf 50 ml HBSS. Beachten Sie, dass fettsäurefreies BSA für Calcium-Assays verwendet werden, wie Fettsäuren können spezifische Rezeptoren aktivieren, die Calcium-Signal des interessierenden Rezeptor beeinträchtigen.
   2. Bereiten Probenecid-Lösung (100x 250 mm): 0,71 g Probenecid aufzulösen in 5 ml NaOH (1 M) und 50 ul HEPES-Stammlösung und 5 ml HBSS / HEPES / Ca ^{2 +} / BSA-Puffer - immer eine neue Lösung. Hinweis: Probenecid hemmt anorganischen Anionen-Transporter, die Fluo-4 aus dem Zytoplasma zu verdrängen können, wodurch das Fluoreszenzsignal zu reduzieren. Es wird empfohlen, die Farbstoffbeladung in durchdie Anwesenheit und Abwesenheit von Probenecid zu bestimmen, ob anorganisches Anion-Transporter ein potenzielles Problem in bestimmten Zelllinien untersuchten Probenecid sogar die Agonist-vermittelten Signals zu verringern.
   3. Vorbereitung Waschpuffer: in 500 ul Probenecid Lösung auf 50 ml HBSS / HEPES / Ca ^{2 +} / BSA-Puffer, der pH-Wert auf 7,4 und der Pufferlösung zu filtrieren. Immer frisch zubereiten Puffer und 50 ml Puffer pro Platte erforderlich ist.
   4. Bereiten Sie 10% Pluronsäure Lösung: mix 50 ul Pluronsäure (20% w / v in Dimethylsulfoxid [DMSO]) mit 50 ul DMSO - wenn Kristallisation auftritt, Hitze bis 37 ° C und immer eine neue Lösung.
   5. Bereiten Fluo-04.00-Lösung (1 mM): add 44 ul 10% Pluronsäure Lösung in eine Ampulle, die 50 ug Fluo-4 AM-und Wirbel enthält, bis es vollständig gelöst ist. Vermeiden Sie Licht, um ein Ausbleichen der Fluorophore zu verhindern.
   6. Bereiten Ladepuffer: in 8,8 ml DMEM Supplemented mit 10 mM HEPES und 2,5 mM Probenecid (pH 7,4) zu der Fluo-4.00-Lösung (44 ul) und Wirbel. Immer frische Puffer.
   7. Entsorgen Sie das Medium aus den Zellen, waschen Sie die Zellen mit 200 ul PBS pro Vertiefung und entfernen PBS.
   8. In 55 ul Ladepuffer pro Vertiefung und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. Wickeln Sie die Platte in Alufolie, um die Exposition der Platte mit Licht zu verhindern.
   9. Achten Sie darauf, die Verbindungen vor dem Bildschirm zu trocknen, wenn sie in Lösungsmitteln, die schädlich (zB Acetonitril) sind für die zelluläre Expressionssystem gelöst sind.
   10. Solubilisierung die Peptide in Waschpuffer in silikonisierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe, um eine Konzentrations-Wirkungs-Analyse durchzuführen und die EC _50-Wert eines Liganden zu bestimmen. In 70 ul des Liganden in der entsprechenden Vertiefung der Verbindung Platte (V-96-Well-Platten) und sind positive (endogene Agonist) und Negativkontrollen (Waschpuffer) auf jeder Platte. Nicht E: Wenn eine Verbindung nicht löslich in der Waschpuffer kann man andere Lösungsmittel, die für die untersuchten Zellen schädlich sind, wie Wasser oder Lösungen, emulgieren und Solubilisierung von Ölen und anderen wasserunlöslichen Substanzen (zB Kolliphor EL) versuchen .
   11. Messen Sie alle Proben in dreifacher Ausfertigung. Beachten Sie, dass 50 ul eines Liganden aus der Verbindung Platte wird mit 100 ul Waschpuffer von der Zellplatte während des Tests in eine gut übertragen werden, so bereiten die Verbindungen bei 3x ihre gewünschte endgültige Konzentration.
   12. Entsorgen Sie die Ladepuffer aus der Zellplatte und 100 ul Waschpuffer in jede Vertiefung. Die Platte 15 min Inkubation bei Raumtemperatur und vermeiden Belichtung.
   13. Entsorgen Sie den Waschpuffer aus der Zellplatte und 100 ul neue Waschpuffer in jede Vertiefung.
   14. Inkubation des Zellplatte, die die Verbindung Platte und eine Spitzengestell (96-well, Stationseinrichtung Pipettenspitzen) für 15 min bei 37 ° C

Titel "> 4. Assay auf der Station Geräte

1. Erstellen und laden Sie die gewünschte Protokoll-Datei mit der Software und den Temperaturregler aktivieren für den Leseraum. Hier messen Kalzium Reaktionen bei 37 ° C für 2 min eine Zeile in einer Zeit mit 1,52 Sekunden Intervall zwischen aufeinanderfolgenden Messungen (Mess eine komplette 96-Well-Platte dauert ca. 25 min) bei 525 nm auf. Stellen Sie die Anregung der Fluo-4 488 nm und übertragen ein Gesamtvolumen von 50 ul-Verbindung zu der Zellplatte, 18 Sekunden nach dem Lesestart, mit dem Spendegeschwindigkeit bei 26 ul / s eingestellt und einer Pipette Höhe von 135 ul.
2. Positionieren Sie die Verbindung und Zellplatte, und die Spitze Rack in die entsprechenden Schubladen des Stationseinrichtung.
3. Führen Sie einen einzelnen Lese der Zellplatte in der gleichen Anregungs-und Emissionswellenlänge in der Endpunkt-Modus, bevor mit dem eigentlichen Bildschirm in FLEX-Modus. Hinweis: Dieses Maß gibt die relative Fluoreszenzeinheitswerte (RFU) und erlaubt Variabilität zwischen Erkennen wirlls der Platte. Werte zwischen 20.000 und 40.000 als akzeptabel betrachtet.
4. Sollte die Probe und die Daten mit der Software zu analysieren.

Ergebnisse

Konzentrationsreihe von 50 uM bis 0.001 nM wurden für alle vier Drosophila sNPF Peptide (: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide Drome-sNPF-1) getestet auf HEK293T-Zellen, die transient exprimieren das Drosophila sNPF Rezeptor und den Promiscuous _{Ga-16-Untereinheit.} Die GPCR wurde von allen vier Peptiden in Endkonzentrationen bis zu 0,1 nM aktiviert, und die Rezeptoraktivierung war konzentrationsabhängig. Fig. 2 zeigt die Kurven entsprechend einer der drei Kopien der Drome sNPF-1-Konzentrationsreihe. Die Negativkontrolle (Waschpuffer) nicht ein Fluoreszenzsignal zu induzieren, während die positive Kontrolle (PAR ₁ - ₁ uM) ausgelöste starke Aktivierung der endogenen Protease-aktivierten Rezeptor-1, was zu einer hohen Fluoreszenzsignal (± 30.000 RFU). Es sollte angemerkt werden, dass eine Abweichung vondie typische Kurve kann Anomalien zeigen. Zum Beispiel könnte ein kontinuierlicher Anstieg der Kurve ohne Rückkehr auf die Grundlinie von nicht-rezeptorvermittelte Signale, wie die Anwesenheit von Calcium-Ionophore oder einem gestörten Lipiddoppelschicht verursacht Calcium Lecks verwandt.

Die Software ermöglicht die Eingabe von Formeln, den Prozentsatz der Aktivierung oder die Standardfehler der verschiedenen Konzentrationen unter anderem bestimmen. Die resultierenden Daten werden verwendet, um vorläufige Konzentrationsantwortkurven zu komponieren, um die EC _50-Werte zu ermitteln, da für die vier Drome-sNPF Peptide in Abbildung 3 dargestellt. Die Kurven der Fig. 3 sind auch die Daten für die Negativkontrolle, wo die Konzentrationsreihe die Drome-sNPF Peptide wurden HEK293T-Zellen mit einem leeren pcDNA3.1 Vektor transfiziert getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe der Peptide an diese Zellen keine Wirkung auf die endogene Rezeptoren, aber in der Tat aktivaß den Rezeptor von Interesse. Die Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay wurde dann dreimal unabhängig wiederholt. Auf Basis der vorläufigen Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Anfangsbildschirm wurden die getesteten Konzentrationen angepasst, um den Dynamikbereich der Kurve (Abbildung 4) zu decken. Die EC50-Werte von Drome-sNPF-1 (2,04 ± 1,48 nM [95% Konfidenzintervall]), Drome-sNPF-2 (5,89 ± 3,74 nM), Drome-sNPF-3 (5,55 ± 3,95 nM) und Drome-sNPF- 4 (0,50 ± 1,01 nM) sind ähnlich, was darauf hinweist, dass sie gleichermaßen wirksam, um den Rezeptor zu aktivieren sind.

2. Grafische Ausgabe der Software für einen Rezeptor-vermittelten Fluoreszenzantwort von einer Konzentrationsreihe. Zwölf endgültigen Konzentrationen (im Bereich von 50 &mgr; M bis 0,001 nM) of die Drome-sNPF-1-Peptid wurden auf der Drome-sNPF Rezeptor getestet. Die Aktivierung erfolgt in relativen Fluoreszenzeinheitswerte (RFU) ausgedrückt. Der obere Graph zeigt die Ergebnisse der sechs höchsten Konzentrationen und die untere Kurve der sechs niedrigsten Konzentrationen. Die positive Kontrolle (+) ist, _PAR-1 (1 &mgr; M) und der Negativkontrolle (-) wird Waschpuffer.

3. Vorläufige Konzentrations-Wirkungs-Kurven von Drosophila sNPF Peptiden durch einen einzigen Fluoreszenzbasis Calciummobilisierungsassay bestimmt. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Drosophila sNPF Rezeptor transient in HEK293T-Zellen für die vier Drosophila sNPF Peptide exprimiert werden blau angezeigt. Für die Negativkontrollen (in rot) wurden die Peptide auf HEK293T getestetZellen, die mit einem leeren Vektor pcDNA3.1 transfiziert. Die fluoreszierenden Reaktionen sind als relative (%) auf den höchsten Wert (100%-Aktivierung) gezeigt. Die Kurven sind das Ergebnis eines Experiments, in dem jede Konzentrationsreihe wurde dreifach gemessen. Die vertikalen Balken stellen die Standardfehler des Mittelwerts (SEM), die teilweise kleiner sind als die verwendeten Symbole (in diesem Fall nur die Symbole dargestellt).

4. Konzentration-Antwort-Kurven und die entsprechenden EC _50-Werte von Drosophila sNPF Peptide von drei unabhängigen Fluoreszenz basierenden Calciummobilisierungsassays bestimmt. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Drosopihla sNPF Rezeptor transient in HEK293T-Zellen für die vier Drosophila sNPF Peptide ausgedrückt sind das Ergebnis von drei unabhängigen michasurements jeweils dreifach durchgeführt (n ≥ 9). Die fluoreszierenden Reaktionen sind als relative (%) auf den höchsten Wert (100%-Aktivierung) gezeigt. Sternchen zeigen Konzentrationen für die n ≤ 9. Fehlerbalken zeigen SEM, die manchmal kleiner sind als die verwendeten Symbole (in diesem Fall nur die Symbole dargestellt). EC _50-Werte werden mit 95%-Konfidenzintervalle angegeben.

Diskussion

Die Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay wurde erfolgreich angewendet, um die funktionelle Charakterisierung des Drosophila sNPF peptidergen Signalisierungssystem, das bereits von Mertens et al wurde bestätigt. mit einem Biolumineszenz-Assay und von Feng et al. mit einer elektrophysiologischen Assay ^13,15. Die EC _50-Werte mit der Fluoreszenz-Assay in HEK293T-Zellen erhalten werden, sind etwa 10-mal weniger als die mit dem Biolumineszenz-Assay in CHO-Zellen (Drome-sNPF-1 durchgeführt, erhalten: fluo = 2.04 nM, Leuchten = 51 nM; Drome-sNPF- 2: Fluo = 5,89 nM, Leuchten = 42 nM; Drome-sNPF-3: fluo = 5,55 nM, Leuchten = 31 nM; Drome-sNPF-4: fluo = 0,50 nM, Leuchten = 75 nM). Diese Variationen können durch verschiedene Faktoren, einschließlich der Tatsache, daß eine der verwendeten Expressionssysteme können für die funktionelle Expression eines bestimmten Rezeptors besser geeignet sein, oder die Faltung des bestimmten Rezeptoren in c weniger effizient erklärtertain Zelltypen. Die EC _50-Werte von allen vier Drome sNPF-Peptide sind im nanomolaren Bereich, wenn auf ihren Rezeptor getestet sowohl mit dem Fluoreszenz-und Biolumineszenz-Assay, im allgemeinen die Unterstützung der physiologischen Relevanz der Peptid-Rezeptor-Interaktion in vivo.

Beachten Sie, dass keine Kontrolle der Transfektion mit einem Rezeptor, für die die aktivierende Liganden ist bekannt, wurde in der hier vorgestellten Bildschirm enthalten, da die Drosophila sNPF Signalsystem ist in der Regel der Steuer Transfektion in Versuchsaufbauten. Die positive Kontrolle mit einem endogenen Liganden der HEK293T-Zellen _(PAR-1) und die Negativkontrolle (Waschpuffer) wurden in dem Bildschirm enthalten. Die Ergebnisse der PAR ₁ zeigte, dass die Zellen in einem guten Zustand. Die Negativkontrolle (Waschpuffer) nicht ein Fluoreszenzsignal zu entlocken, was darauf hindeutet, dass das Medium, in dem die Peptide gelöst sind, war frei von Verunreinigungen, die inf könnteluence die Ergebnisse.

Die zuvor gekennzeichnet Drosophila sNPF Signalsystem wurde hier verwendet, um die Fluoreszenz-basierten Assays Kalziummobilisierung zu erklären. Zu diesem Zweck wurden Konzentrationsreihen der aktivierenden Liganden sofort getestet. Wenn jedoch ein Orphan-Rezeptor ist mit Überexpression in einem Screening-Test, um eine Bibliothek mit Hunderten von Verbindungen zu testen gebracht, es zum ersten Bildschirm mit einer relativ hohen Endkonzentrationen der Liganden (z. B.., 10 oder 1 &mgr; M) empfohlen wird. Nach der Detektion eines Aktivierungsverbindung kann eine Verdünnungsreihe dieser Verbindung, um eine Konzentrationsantwortkurve zusammenzustellen und um den EC _50-Wert zu bestimmen, untersucht werden.

Sobald die Aktivierungsliganden eines Rezeptors bestimmt wird, kann die intrazelluläre Signalwegs durch die Anpassung des Protokolls untersucht werden. Der Assay kann wie oben beschrieben, aber ohne Co-Transfektion des G ^5, _{16-Untereinheit.} Wenn ein Calcium-Reaktion gemessen wird, bedeutet dies, dass die Rezeptor-Paare mit einem endogenen G &agr; _{q-Untereinheit} des zellulären Expressionssystem. Wenn kein Fluoreszenzsignal beobachtet wird, kann Protokolle Änderungen der Konzentration anderer sekundärer Botenstoffe (z. B.., CAMP) Messung angewendet werden.

Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR)-Studien können durchgeführt werden, um Kernsequenz des Peptids für die Rezeptoraktivierung notwendig zu definieren. Zunächst werden trunkierte Sequenzen bewertet, um die minimale Aminosäuresequenz des Peptids, die noch in der Lage ist, den Rezeptor zu aktivieren, zu definieren. Weiter können Peptide getestet werden, bei dem systematisch jede Aminosäure für einen Alanin-Rest ersetzt wurde. Testen synthetischen Alanin-Substitutionsreihe auf dem Rezeptor ermöglicht, die Bedeutung von jeder der Aminosäuren für die Rezeptoraktivierung ^24,25 bestimmen.

Trotz der häufigen Verwendung und bewährte Effizienzsamkeit, ist zu betonen, dass die hier beschriebene Assay müssen einige Anpassungen, um optimale Ergebnisse für spezifische Rezeptoren von Interesse zu gewinnen. Die _{Ga-16-Untereinheit} hat den Vorteil, dass es für die meisten GPCRs bindet, kann aber auch eine dominant-negative Wirkung auf Rezeptoren haben, die endogen Paar über ^Ga-22 _q. In diesem Fall kann es nützlich sein, verschiedene Kombinationen von G-Proteinen während der Optimierung eines neuartigen Calcium-Assay getestet und die Ergebnisse für G &agr; _{q-gekoppelten} Rezeptoren in Abwesenheit oder Anwesenheit von G &agr; ₁₆ zu vergleichen. Alternative Assays, die unabhängig von der G-Protein interagieren, um die Rezeptoraktivierung zu detektieren sind, können ebenfalls durchgeführt werden, wie die Translokation von GFP-markiertem Arrestin oder den Nachweis von Änderungen des Membranpotentials (z. B.. Durch FLIPR Membrane Potential Assay Kit). Neben der Fluo-04.00 hier verwendet wird, eine breite Palette von anderen Calcium-sensitiven Fluorophoren, jede mit ihrer eigenen spektralen und chemical Eigenschaften zur Verfügung. Die am besten geeigneten Fluorophor auf der Basis des GPCR, Zelltyp und der zur Verfügung stehenden Plattenlesegerät ausgewählt werden, aber experimentelle Verifikation erforderlich ist. Die Mengen der transfizierten DNA und der DNA / Transfektionsreagenz Verhältnis Notwendigkeit, für jeden Rezeptor-Transfektionsreagenz-Zelllinie Kombination bestimmt werden. Schließlich sollte beachtet werden, dass die Zellen in einer kontinuierlichen Kultur erlauben nur 20-25 verwendbar Passagen, die Screening-Assays durchzuführen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HEK293T Zellen
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA-Lösung (0,25%)	Sigma-Aldrich	T4049
Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat (EDTA)	MP Biomedicals	195173
Dulbecco's Modifizierte Eagle's Medium - hohe Glukose  (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Penicillin-Streptomycin (P-S)	Sigma-Aldrich	P4333
jetPRIME	Polyplus Transfektion	114-01	FuGENE HD Transfektionsreagenz (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagenz (Life Technologies)
Dialysiertes fötales Kälberserum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Fibronektin aus menschlichem Plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Reagenz A100, Lysepuffer	Chemometec	910-0003
Reagenz B, Stabilisierender	Puffer Chemometec	910-0002
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
HBSS-Puffer: Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H8264
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
NaOH (1 m)	Vel	2781
Pluronsäure	Invitrogen	P-3000MP
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calciumgrün-1, ... (Invitrogen)
TPP-Gewebekulturflaschen (T-75 und T-150)	Sigma-Aldrich	Z707503 und Z707554 FlexStation-Gerät
Molecular	Devices		NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Schwarzwandige Polystyrolplatten (96 Wells) mit klarem Boden	Greiner Bio-One	655090	Corning 96 Well flacher Boden mit klarem Boden, schwarzer Polystyrol-Poly-D-Lysin-beschichteter
Boden NucleoCassette	Chemometec	941-0001
NucleoCounter NC-100	Chemometec
Mikrozentrifugenröhrchen, silikonisiert	BioCision	BCS-2470
V-förmige 96-Well-Platten aus Polystyrol	Greiner Bio-One	651101
96-Well, FlexStation Pipettenspitzen	Molecular Devices	9000-0912
Soft Max Pro Software	Molecular Devices