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Methodenartikel

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

12.2K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/51519

⸱

24. Juli 2014

 ,  ,  , 
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Kulturprotokolle für humane pluripotente Stammzellen (hPSC), die auf dem Wachstum von dissoziierten Einzelzellen basieren. Diese neue Methode, bei der Rho-assoziierte Kinase-Inhibitoren oder die Laminin-Isoform 521 (LN-521) verwendet werden, eignet sich für die Herstellung großer Mengen homogener hPSCs, die genetische Manipulation und die Wirkstoffforschung.

Zusammenfassung

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) sind vielversprechend für regenerative Medizin und biopharmazeutische Anwendungen. Derzeit sind die optimale Kultivierung und die effiziente Expansion großer Mengen von hPS-basierten Therapien kritische Themen bei hPS-basierten Therapien. Herkömmlicherweise werden hPSCs als Kolonien sowohl auf Feeder- als auch auf Feeder-freien Kultursystemen vermehrt. Diese Methoden weisen jedoch mehrere große Einschränkungen auf, darunter geringe Zellausbeuten und die Erzeugung heterogen differenzierter Zellen. Um die derzeitigen hPSC-Kulturmethoden zu verbessern, haben wir kürzlich eine neue Methode entwickelt, die auf der Nicht-Kolonie-Monolayer-Kultur (NCM) von dissoziierten Einzelzellen basiert. Im Folgenden stellen wir Ihnen detaillierte NCM-Protokolle vor, die auf dem Rho-assoziierten Kinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632 basieren. Wir liefern auch neue Informationen zur NCM-Kultur mit verschiedenen kleinen Molekülen wie Y-39983 (ROCK I-Inhibitor), Phenylbenzodioxan (ROCK II-Inhibitor) und Thiazovivin (ein neuartiger ROCK-Inhibitor). Wir erweitern unser Basisprotokoll weiter, um hPSCs auf definierten extrazellulären Proteinen wie der Laminin-Isoform 521 (LN-521) ohne den Einsatz von ROCK-Inhibitoren zu kultivieren. Darüber hinaus haben wir auf der Grundlage von NCM eine effiziente Transfektion oder Transduktion von Plasmid-DNAs, lentiviralen Partikeln und Oligonukleotid-basierten microRNAs in hPSCs demonstriert, um diese Zellen genetisch für molekulare Analysen und Wirkstoffforschung zu modifizieren. Die NCM-basierten Methoden überwinden die großen Mängel der Koloniekultur und könnten daher geeignet sein, große Mengen homogener hPSCs für zukünftige klinische Therapien, die Stammzellforschung und die Wirkstoffforschung herzustellen.

Einleitung

Die Kapazität der hPSCs in Richtung multilineage adulten Geweben differenzieren hat neue Wege zur Behandlung von Patienten, die an schweren Krankheiten, Herz-Kreislauf-, Leber-, Pankreas-und neurologischen Systeme beinhalten leiden 1-4 eröffnet. Verschiedene Zelltypen aus hPSCs abgeleitet würde auch robust Mobilfunk-Plattformen für Krankheit Modellierung, Gentechnik, Arzneimittel-Screening, und toxikologische Prüfungen 1,4. Die zentrale Frage, die ihre zukünftigen klinischen und pharmakologischen Anwendungen gewährleistet, ist die Erzeugung einer großen Zahl von klinischem hPSCs durch in-vitro-Zellkultur. Allerdings sind die aktuellen Kultur-Systeme entweder unzureichend oder von Natur aus variabel, die verschiedene Feeder und Feeder-freien Kulturen hPSCs als Kolonien 5,6.

Colony-Typ-Wachstum von hPSCs teilt viele Strukturmerkmale der inneren Zellmasse (ICM) der frühen Säugetierembryos. Das ICM ist anfällig für in die drei Keimblätter zu differenzierenin einem multizellulären Umgebung, weil die Existenz von heterogenen Signalverläufe. So wird die Übernahme von Heterogenität in der frühen embryonalen Entwicklung als eine erforderliche Verfahren zur Differenzierung betrachtet, aber eine unerwünschte Eigenschaft hpSC Kultur. Die Heterogenität in hpSC Kultur wird oft durch übermäßige apoptotische Signale und spontane Differenzierung aufgrund suboptimaler Wachstumsbedingungen induziert. Somit wird in Kolonie-Typ-Kultur, die heterogenen Zellen werden oft in der Peripherie der Kolonien 7,8 beobachtet. Es hat sich auch gezeigt, dass die Zellen in menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) Kolonien zeigen Differential Antworten auf Signalmoleküle wie BMP-4-9. Darüber hinaus Kolonie Kulturmethoden produzieren geringe Zellausbeuten als auch sehr niedrige Zellgewinnungsraten von Kryokonservierung aufgrund unkontrollierbarer Wachstumsraten und apoptotische Signalwege 6,9. In den letzten Jahren sind verschiedene Suspensionskulturen zur Züchtung hPSCs entwickelt, particulArly für die Expansion von großen Mengen von hPSCs in Feeder-und Matrix-freien Bedingungen 6,10-13. Offensichtlich haben unterschiedliche Kultursysteme ihre eigenen Vorteile und Nachteile. Im Allgemeinen ist die Heterogenität der hPSCs stellt eine der wichtigsten Nachteile in Kolonie-Typ und aggregierte Kulturverfahren, die optimal für die Bereitstellung von DNA-und RNA-Materialien in hPSCs Gentechnik 6 sind.

Klar, es ist eine zwingende Notwendigkeit, neue Systeme, die einige Mängel der derzeitigen Kulturmethoden zu umgehen, zu entwickeln. Die Entdeckungen der niedermolekularen Inhibitoren (wie der ROCK-Inhibitor Y-27632 und JAK-Inhibitor 1), die Einzelzellüberleben verbessern ebnen den Weg für dissoziiert-hpSC Kultur 14,15. Mit der Verwendung dieser kleinen Moleküle, haben wir vor kurzem ein Kulturverfahren auf der Basis nicht-Kolonietyp (NCM) Wachstum von dissoziierten hPSCs 9. Diese neue Kulturverfahren kombiniert die beiden Single-Cell-Passage und High-Density-Plating Verfahren, so dass wir große Mengen von homogenen hPSCs unter konsistenten Wachstumszyklen ohne große Chromosomenanomalien 9 zu produzieren. Alternativ könnte NCM Kultur mit verschiedenen kleinen Molekülen und definierten Matrizen (wie Laminin), um das Kulturverfahren für breite Anwendungen zu optimieren implementiert werden. Hier auf der Basis NCM Kultur, präsentieren wir mehrere detaillierte Protokolle und abzugrenzen detaillierte Verfahren für die Gentechnik. Um die Vielseitigkeit der NCM-Protokolle zeigen, testeten wir auch NCM Kultur mit vielfältigen ROCK-Hemmer und mit der Single Laminin-Isoform 521 (dh, LN-521).

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Protokoll

Einzelzell-basierte nicht-Kolonie Typ Monoschicht (NCM) Kultur der hPSCs.

1. Vorbereitungen

  1. Machen 500 ml Medium für die Kultur von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF): DMEM-Medium mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin und 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) ergänzt.
  2. Isolieren embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF-Zellen) aus dem CF1-Stamm nach einer Routine-Protokoll 16 und Kultur MEFs auf 0,1% Gelatine beschichtete 6-Well-Zellkulturplatte in DMEM-Medium abgeleitet. Alternativ kaufen MEF Aktien bei Passage 3 von kommerziellen Ressourcen.
  3. Bereiten Matrigel Platten.
    1. Verdünnen Sie 5 ml hESC qualifizierte Matrigel Lager mit 5 ml DMEM/F12-Medium (bei ~ 4 ° C gekühlt) und speichern 50% Aliquots in einem -20 ° C Gefrierschrank. Tauen Sie das gefrorene Matrigel Lager im Kühlschrank (ca. 4 ° C) O / N und weiter zu verdünnen das Matrigel in kaltem DMEM/F12-Medium (bis zu einer Arbeitskonzentration von 2,5% zu geben).
    2. Mantel 6-well-Zellkulturplatten mit 1,5 ml 2,5% Matrigel pro Well, speichern Sie die beschichteten Platten im Kühlschrank O / N (Hinweis: Verwenden Sie die Matrigel-beschichtete Platte innerhalb von 2 Wochen).
    3. Entfernen Sie die Matrigel Platte aus dem Kühlschrank, damit die Platte bei RT in der Zellkultur Haube für 10 bis 30 min (Anmerkung: nicht die Platte in einem Zellkulturbrutschrank nicht warm) zu wärmen, und saugen DMEM Medium vor hPSCs Beschichtung.
  4. Machen 500 ml HES-Medium: 80% DMEM/F12 Medium, 20% KSR, 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1 mM β-Mercaptoethanol und 4 ng / ml FGF-2.
  5. Bereiten Sie 10 ml 2X hpSC Gefriermedium: 60% FBS, 20% DMSO und 20 uM Y-27632 in mTeSR1 Medium, durch Filtration sterilisieren und nutzen das Medium innerhalb 1 Woche.

. 2 Protokoll Nr. 1 (Basic): Wachsen hpSC Kolonien auf Feeders

  1. Verwenden MEF Passage Zahlen bei 5 oder 6 (als P5 und P6 bezeichnet) für hpSC Kultur, um eine einheitliche Resul bekomments. Mitotisch inaktiviert MEFs durch Behandlung der Zellen mit 10 ug / ml Mitomycin C für 3 h bei 37 ° C, wäscht die Zellen 3x mit 1X Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) und dann dissoziieren MEFs mit 0,05% Trypsin in 0,53 mM EDTA. Alternativ bestrahlen MEFs in einer Dosis von 8000 rad mit einer Röntgenbestrahlungsvorrichtung.
  2. Graf Zellzahlen mit Hilfe der Trypanblau-Ausschlussverfahrens Fleck unter dem Mikroskop. Alternativ können Sie eine automatische Zellzähler.
  3. Platte bestrahlten MEFs auf 6-Well-Polystyrol-Platten mit 0,1% Gelatine in einer Dichte von 1,88 x 10 5 Zellen pro Vertiefung (dh 1,96 × 10 4 Zellen / cm 2) beschichtet. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Stunden.
  4. Entfernen Sie die MEF Kulturmedium durch Aspiration mit einer Pasteur-Pipette (Hinweis: keine Waschschritte in dieser Zeit nötig).
  5. Man reibt hpSC Kolonien aus früheren Kultur in kleine Klumpen, untersuchen Sie die Klumpen unter dem Mikroskop auf ihre Größen, die fr gewährleistenom 50 bis 100 &mgr; m Durchmesser, und die Platte hpSC Klumpen auf der Oberseite der MEF-Feeder-Schichten in einem Well mit 2 ml hpSC Medium.
  6. Ändern hESC Medium täglich für 3 bis 5 Tage, Koloniewachstumsrekord von Fotografie, markieren Sie alle morphologisch veränderten oder differenzierte Kolonien (~ 5%), und von Hand mit einer Pasteurpipette entfernen Sie die markierten Kolonien durch vorsichtiges Absaugen.
  7. Spülen der verbleibenden Kolonien auf MEFs zweimal (jeweils mit D-PBS 2 min), und Inkubieren der Kolonien mit 2 ml 1 mg / ml Collagenase IV in hpSC Medium für 10 bis 30 min), und prüft die Ablösung hpSC Kolonien aus der MEF-beschichteten Oberfläche (Hinweis: Verwenden Sie einen Schaber, um die Ablöseprozess helfen nur dann, wenn die Kolonien dicht an der Platte befestigt).
  8. 5 ml hpSC Medium zu jeder Vertiefung zur enzymatischen Reaktionen Übertragungs Kolonien auf 15 ml-Röhrchen zu minimieren, damit hpSC Kolonien für 3 bis 5 min bei RT sedimentiert und stellen die Sedimentation von Kolonien durch direkte Visualisierung des cEllen an der Unterseite des Rohres (Anmerkung: nicht die Rohrzentrifuge bei diesem Schritt).
  9. Entfernen Sie die Überstände, Rest MEFs und Einzelzellen dissoziiert, suspendieren die Kolonien mit 5 ml Medium hESC und zweimal wiederholen Sie den Schritt Sedimentation.
  10. Entfernen Sie die mittlere, verreiben hpSC Kolonien in kleine Klumpen, lagern in 1X hpSC Gefriermedium (oder CryoStore CS10 Einfrieren mittel) für die Kryokonservierung (1 konfluenten gut gefroren pro Flasche) oder Platte auf einem 6-Well-Platte für Zell Passagieren.

3 Protokoll Nr. 2:. Konvertieren hpSC Kolonien von Futtertröge zu NCM

  1. Spülen hpSC Pellets in D-PBS einmal brüten die Pellets mit 1 ml 1X Accutase für 10 min, und untersuchen die enzymatische Reaktion unter einem Mikroskop auf Einzelzell Dissoziation zu gewährleisten.
  2. Enden die enzymatischen Reaktionen durch vorsichtiges Resuspendieren der Zellen in 5 ml Medium mit 10 mTeSR1 uM Y-27632, gefolgt von Zentrifugation bei 200 · g bei RT für 5 min(Beachten Sie, verwenden Sie keine übermäßige Zentrifugation Kräfte, die Zellschäden verursachen.)
  3. 5 ml mTeSR1 Medium zu dem Pellet, das Pellet als Einzelzellen und Filter dissoziierten Zellen durch ein 40 &mgr; m Zellsieb (um restliche Zellaggregate zu entfernen).
  4. Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs in ein gut (1,4 bis 2,1 x 10 5 Zellen / cm 2) einer 6-well-Platte mit 2,5% hESC qualifizierte Matrigel beschichtet, fügen mTeSR1 Medium bis zu 2,5 ml, und beinhalten 10 uM Y-27632 im Medium (die ersten 24 h Einzelzell-Beschichtung zu erleichtern). Alternativ nutzen Sie die folgenden kleinen Molekülen bis 10 uM Y-27632 für die Verbesserung Single-Cell-Beschichtung ersetzen: 1 uM Y-39983 (ROCK I-Inhibitor), 1 uM phenylbenzodioxane (ROCK II-Inhibitor), 1 uM thiazovivin (ein Roman ROCK-Inhibitor) und 2 uM JAK-Inhibitor ein.
  5. Ersetzen Sie das Medium mit drogenfreie mTeSR1 Medium am nächsten Tag (innerhalb von 24 Stunden), distanzieren Zellen von einem zusätzlichengut, und zählen die Zellzahl auf Einzelzell Plattierungseffizienz bestimmen (Anmerkung: etwa 50 bis 90% der Single-Cell-Beschichtung Effizienz, die in dieser Phase erzielt werden kann).
  6. Lassen Sie die Zellen als Einzelzellen-Monoschicht gebildet wird für ein paar Tage mit 3 ml mTeSR1 Medium wachsen. Ändern Medium täglich.
  7. Empirisch bestimmen den Zeitpunkt einer Passage angepasst NCM in Abhängigkeit von der Zelldichte. Passage, wenn das Zellwachstum erreicht Zusammenfluss am Tag 3 oder Tag 4 oder im 4 h Zeitpunkt nach dem Verschwinden der Zell-zu-Zell-Grenzen. Distanzieren, die Zellen in 1 ml Accutase, verwenden Sie einen 1 bis 3 Teilungsverhältnis (dh 1 konfluenten gut von Zellen in drei Vertiefungen der 6-Well-Platte plattiert) für Passagieren von Zellen und stabilisieren angepasst NCM von 5 Passagen.
  8. Handy Einfrieren
    1. Nutzen Sie ein gut zusammenfließenden (~ 6.5 x10 6 Zellen) für einen Tiefkühlflasche: distanzieren Zellen von einem konfluenten gut mit 1 ml Accutase für 10 min.
    2. Verdünnen Sie with 5 ml Medium und mTeSR1 Zentrifuge Zellen wie oben beschrieben.
    3. Resuspendieren des Pellets in 500 ul Medium mTeSR1 und dann langsam in einem Kryokonservierungsfläschchen fügen 500 ul 2X hpSC Gefriermedium (enthaltend 20 &mgr; M Y-27632). Alternativ Resuspendieren der Zellen in 1X hpSC Gefriermedium, das 2 &mgr; M JAK-Inhibitor 1 oder 1X CryoStor CS10 Medium in Gegenwart von entweder 10 &mgr; M oder Y-27632 2 uM JAK-Inhibitor 1.
    4. Zeigen Fläschchen eingefroren in einem Eis-gekühltes Kryobehälter (mit isopranol Bottom-gefüllt) und übertragen die Kryobehälter zu einer -80 ° C-Gefrierschrank sofort.
    5. Übertragungszellen von dem -80 ° C Gefrierschrank in einem Flüssigstickstofftank (am nächsten Tag) für die Langzeit Kryokonservierung.
  9. Handy Auftauen
    1. Nutzen Sie ein Kryokonservierungsfläschchen für die Beschichtung ein Well einer 6-Well-Platte.
    2. Vorwärmen mTeSR1 Medium in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten auftauen Zellen in der gleichen Wasserbad für 2 min,tropfenweise in den Zellen 5 ml vorgewärmten mTeSR1 Medium mit 10 uM Y-27632 und Zentrifuge wie oben beschrieben.
    3. Vorsichtig resuspendieren Zellpellets mit 2 ml mTeSR1 Medium mit 10 uM Y-27632 und langsam Zellen übertragen, um mit einem gut vorge Matrigel-beschichtete (Hinweis: die Herstellung von Luftblasen zu vermeiden).
    4. Ändern Medium täglich und erwarten hpSC Wachstum Zusammenfluss am Tag 3 oder 4 erreichen.

4 des Protokolls Nr. 3:. Konvertieren hpSC Kolonien auf Matrigel zu NCM Kultur

  1. Entfernen einer Matrigel-beschichtete Platte aus dem Kühlschrank wird die Platte in der Gewebekultur Haube für 10 bis 30 Minuten, entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung der Platte, und 2 ml vorgewärmten Medium mTeSR1 in jede Vertiefung.
  2. Über verrieben hpSC Klumpen aus dem Einzug Kultur (Schritt 2.10 der Grund-Protokoll) zu dem oben Matrigel Platte. In mTeSR1 Medium bis zu 2,5 ml Endvolumen in jeder Vertiefung.
  3. Medium täglich ändern TAG 3 BIS 4s bis Kolonien erreichen 80 bis 90% Konfluenz.
  4. Für Passagieren von Zellen: zweimal spülen Sie die Kolonien mit D-PBS, Behandlung der Zellen mit 1 ml 2 mg / ml Dispase bei 37 ° C für 15 bis 20 min und Sediment-und Durchgangszellen als Klumpen.
  5. Für NCM Kultur: wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,9 in Protokoll Nr. 2 beschrieben.

5 Protokoll Nr. 4:. NCM Kultur hPSCs auf LN-521

  1. Auftauen des rekombinanten LN-521-Lösung bei 4 ° C vor dem Tag der Anwendung und machen die Laminin-Beschichtungslösung (LCS) durch Verdünnen der aufgetauten Laminin mit 1X D-PBS (das Ca 2 + / Mg 2 +), um eine Endkonzentration von 10 ug / ml.
  2. 1 ml der LCS einer Mulde in 6-Well-Platte (Anmerkung: ein Austrocknen während der Beschichtung zu vermeiden).
  3. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm überzogen, um Verdunstung zu vermeiden, und die Platte im Kühlschrank (4 ° C) O / N (Anmerkung: Verwenden Sie die Platte innerhalb von 1 Woche).
  4. Die LCS mit einer Pasteur-Pipette vorsichtig entfernen, ohne zuuching der beschichteten Oberfläche und 2 ml mTeSR1 mittel-bis gut ein.
  5. Warm alle Kulturlösungen (einschließlich D-PBS) in einem 37 ° C Wasserbad für 25 min.
  6. Konvertieren hpSC Kolonien NCM
    1. Distanzieren Zellaggregate auf einzelne Zellen mit Accutase in Protokoll 2 beschrieben.
    2. Samen 1.3-2 x 10 6 hPSCs in einem gut LN-521 beschichtete (1,4-2,1 × 10 5 Zellen / cm 2) ohne die Anwesenheit von ROCK-Inhibitoren.
    3. Änderungsmedium täglich für 3 bis 4 Tage.
    4. Dissoziation der Zellen in 1 ml Accutase am Tag 3 oder 4 für die nächste Zelle Passagierung mit einem 1 bis 3 Teilungsverhältnis.

. 6 Protokoll 5: NCM Kultur für Plasmid-DNA Transfektion

  1. Passen hpSC Kolonien NCM Kultur als in den Protokollen 2 bis 4 beschrieben.
  2. Platte dissoziiert hPSCs in 12-Well-Platte mit einer Zelldichte von 7,5 x 10 5 Zellen / Vertiefung in mTeSR1 Medium in Gegenwart von 10 &mgr; M Y-27632.
  3. Ersetzen mTeSR1 Medium mit drogenfreie mTeSR1 Medium zwischen 4-8 Stunden nach dem Ausstreichen der Zellen.
  4. Für jede Transfektion verdünnen 2,5 ug Expressionsplasmide (zB pmaxGFP) und 5 ul Lipofectamine 2000 in getrennten Eppendorf-Röhrchen in jedem Opti-MEM 125 ul Reduzierte Serum Medium.
  5. Nach 5 min, mischen Sie die Reagenzien verdünnt und Inkubation für 20 min bei RT (der Transfektion Komplexe zu bilden).
  6. Fügen 250 ul Transfektion Komplexe jede Vertiefung hPSCs in 1 ml mTeSR1 Medium und Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator für 24 Stunden.
  7. Prüft die Transfektionseffizienz unter einem Fluoreszenzmikroskop und fotografieren zufällig für die Berechnung der tatsächlichen Transfektionseffizienz.

. 7 des Protokolls Nr. 6: NCM für Kultur Transfektion von MicroRNAs

  1. Distanzieren halbkonfluente hPSCs am Tag 2 unter NCM Bedingungen durch Zugabe von 1 ml pro Vertiefung in Accutase 6 -Well-Platte.
  2. 10 ml mTeSR1 mittel-bis enzymatischen Reaktionen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min zu verdünnen.
  3. Zellpellet mit mTeSR1 Medium, Samen, die Zellen in einer Dichte von 7,5 x 10 5 Zellen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte in mTeSR1 Medium mit 10 uM Y-27632, und lassen die Zellen legen für 4 Stunden.
  4. Ersetzen Sie das Medium mit Y27632 frei mTeSR1 Medium.
  5. Verwenden Sie handelsübliche Micro-RNAs (zB eine nicht-Targeting miRIDIAN miRNA-Transfektion Control mit Dy547 beschriftet). Titriert Konzentrationen im Bereich von 0 bis 160 nM mit den mitgelieferten Reagenzien und folgen Sie den Anweisungen der Hersteller.
  6. Optimieren Transfektionseffizienz für jede Konzentration in hpSC Linien durch Abbildung der Dy547 Fluoreszenz der lebenden Zellen unter dem Mikroskop bei 24 Stunden nach der Transfektion.
  7. Berechnen Sie die Transfektionseffizienzen basiert auf dem Prozentsatz der positiven Zellen Dy547 über alle Zellen abgebildet.
. tle "> 8 Protokolls Nr. 7: Kultur NCM für Transduktion von Lentivirusvektor

  1. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.4 des Protokolls Nr. 6.
  2. Berechnen Sie die Mengen an Viruspartikeln für Übertragung verwendet werden: Verwenden Sie die folgende Formel ein: = TU (MOI x CN) / VT, während TU bezeichnet die Gesamtzahl der Umwandlung Einheiten entspricht MOI die gewünschte Vielfalt der Infektion in der gut (MOI oder TU / Zelle), CN gibt die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung und VT-Lager zeigt virale Titer (TU / ml). Zum Beispiel gegeben, dass die Aktien virale Titer für SMART-shRNA Vektors gleich 1 x 10 9 TU / ml (Umwandlung Einheiten pro ml), 7,5 x 10 5 Zellen pro Vertiefung bei der Transduktion, und einer erwarteten MOI von 20: 15 zu verwenden ul der Aktienviruspartikel für jeden gut (Anmerkung: Diese Bedingung ist für transiente lentiviralen Induktion empfohlen).
  3. Vorwärmen mTeSR1 300 ul Medium mit 10 mg / ml Polybrene für 30 min.
  4. In 15 ul Lager Viruspartikel indie vorgewärmten Medium mit mTeSR1 Polybren und vorsichtig die Lösung.
  5. Ersetzen des Zellkulturmedium mit 300 &mgr; l vorgewärmtem Medium, das die Viruspartikel enthält.
  6. Nach 4 Stunden Inkubation untersuchen turboGFP Fluoreszenz (ein Hersteller für shRNA-Expression) um die Übertragungseffizienz zu bestimmen.
  7. In 300 ul zusätzlicher mTeSR1 Medium auf die Wandler gut, wenn die Zellen beginnen, turboGFP auszudrücken.
  8. Nach 12-16 h Inkubation denken Turbo-GFP-Expression.
  9. Führen gewünschten Follow-up-Experimente mit diesen transduzierten Zellen innerhalb von 72 Stunden.

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Ergebnisse

Ein allgemeines Schema der NCM Kultur

Abbildung 1 zeigt eine typische NCM Kultur-Schema, das die dynamischen Änderungen der hPSCs nach der High-Density-Single-Cell-Beschichtung in der Gegenwart des ROCK-Inhibitor Y-27632. Diese morphologischen Änderungen sind interzellulären Verbindungen nach der Plattierung, Zellcluster Bildung und exponentiellen Zellwachstums, gefolgt von Kondensation Zelle (1A). Ein repräsentatives Experiment zeigt WA01 (...

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Diskussion

Es gibt zwei große Möglichkeiten, um in vitro Kultur hPSCs: konventionelle Kolonie-Art-Kultur (von Zellen auf Feeder oder extrazelluläre Matrix) und Suspensionskultur von hPSCs als Aggregate ohne Zubringer 6. Die Grenzen der beiden Kolonie-Typ-und Suspensionskultur Methoden gehören sammelt Heterogenität und vererbbaren epigenetischen Veränderungen. NCM Kultur, basierend sowohl auf Einzelzell Passagieren und High-Density-Zelle Überzug, stellt eine neue Methode zur Kultur hpSC Wachstum 6,18....

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Intramural Research Program der National Institutes of Health (NIH) am National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Wir danken Dr. Ronald D. McKay für seine Diskussion und Kommentare zu diesem Projekt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gräfin automatisierter ZellzählerInvitrogen Inc.C10227Automatische Zellzählung
Faxitron Cabinet RöntgensystemFaxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL Modell RX-650Röntgenbestrahlung von MEFs,
MULTIWELL 6-Well-PlattenBecton Dickinson, Labware353046Polystyrolplatten
DMEMInvitrogen Inc.11965– 092Für MEF-Medium
Mitomycin CRoche107409Mitotic
Inhibitor TrypsinInvitrogen Inc.25300-054Für MEF-Dissoziation
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330– 032Für hPSC-Medium
Opti-MEM I Reduziertes SerummediumInvitrogen Inc.31985-062Für die hPSC-Transfektion
Hitzeinaktiviertes FBSInvitrogen Inc.16000– 044Bestandteil des MEF-Mediums
Knockout Serum ErsatzInvitrogen Inc.10828– 028KSR, Bestandteil des hPSC-Mediums
Dulbecco' s Phosphatgepufferte KochsalzlösungInvitrogen Inc.14190-144D-PBS, frei von Ca2+/Mg2+
Nicht-essentielle AminosäurenInvitrogen 11140– 050NEAA, Bestandteil des hPSC-Mediums
L-GlutaminInvitrogen 25030– 081Bestandteil des hPSC-Mediums
mTeSR1 & NahrungsergänzungsmittelStemCell Technologies5850Tierisches proteinfreies
TeSR2 & NahrungsergänzungsmittelStemCell Technologies5860Xeno-freies Medium
β-MercaptoethanolSigma M7522Komponente aus hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC		American Type Culture Collection (ATCC) SCRC-1040Für die Feeder-Kultur von hPSCs
hESC-qualifiziert MatrigelBD Bioscience354277Für die Feeder-freie Kultur von hPSCs
Laminin-521BioLaminaLN521-02Humanes rekombinantes Protein
FGF-2 (rekombinantes FGF, basisch)R& D Systems, MN223-FBWachstumsfaktor im hPSC-Medium
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X gemischte enzymatische Lösung
JAK-Inhibitor IEMD4 Biosciences420099Ein Inhibitor der Januskinase
Y-27632EMD4 Biosciences688000ROCK-Inhibitor
Y-27632Stemgent04-0012ROCK-Inhibitor
Y-39983Stemgent04-0029ROCK I-Inhibitor
PhenylbenzodioxanStemgent04-0030ROCK II-Inhibitor
ThiazovivinStemgent04-0017Ein neuartiger ROCK-Inhibitor
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 µ m Zell-Sieb
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 ° CThermo Wissenschaftlich C6516F-1"Herr Frosty" Gefrierbehälter
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027Transfektionsreagenzien
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02Transfektionsreagenz
Non-targeting miRIDIAN miRNA TransfektionskontrolleThermo ScientificIP-004500-01-05Markiert mit Dy547, zur Überwachung der Verabreichung von microRNAs 
SMART-shRNAThermo Wissenschaftlich Noch zu bestimmenLentiviraler Vektor
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)In jedem Transfektionskit enthaltenExpressionsplasmid für die Transfektionskontrolle
Okt-4Santa Cruz Biotechnologiesc-5279Maus IgG2b, pluripotenter Marker
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologiesc-21702Maus IgM, Differenzierungsmarker
SSEA-4Santa Cruz Biotechnologiesc-21704Maus IgG3, pluripotenter Marker
Tra-1-60Santa Cruz Biotechnologiesc-21705 Maus IgM, pluripotenter Marker
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706Maus IgM, pluripotenter Marker
CK8 (C51)Santa Cruz Biotechnologysc-8020Maus IgG1, gegen Cytokeratin 8
α-FetoproteinSanta Cruz Biotechnologysc-8399AFP, Maus IgG2a
HNF-3β (P-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2, polyklonaler Antikörper
Troponin T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0Maus IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1Kaninchen-IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc, JapanRCAB0004P-FPolyklonaler Antikörper
Ratten-Anti-GFAPZymed13-0300Saures Gliafibrillenprotein
Albumin (Klon HSA1/25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513AMaus IgG1
Aktin der glatten Muskulatur (Klon 1A4)DakoCytomation IncIR611/IS611Maus IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326Kaninchen polyklonaler Antikörper
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, Maus IgG2a
HNF4α (C11F12)Cell Signaling Technologies3113Monoklonaler Kaninchen-Antikörper
Paraformaldehyd (Lösung)Elektronenmikroskopie Sciences15710PFA, Fixiermittel, verdünnt in D-PBS
, , : ,

Referenzen

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