Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Zusammenfassung

Der Xenopus laevis Embryo ist aufgrund seiner Größe und Leichtigkeit der Manipulation weiterhin außerordentlich nützlich bei der Erforschung der frühen Entwicklung. Es wird ein vereinfachtes Protokoll für das Whole Mount in situ Hybridisierungsprotokoll zur Verfügung gestellt, das bei der Identifizierung spezifischer Organe in diesem Modellsystem verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Organogenese ist die Untersuchung, wie Organe spezifiziert werden und dann während der Entwicklung ihre spezifische Form und Funktion erhalten. Der Xenopuslaevis-Embryo ist sehr nützlich für die Untersuchung der Organogenese, da er aufgrund seiner Größe sehr gut für die Identifizierung von Organen in den frühesten Schritten der Organogenese geeignet ist. Zu diesem Zeitpunkt ist die primäre Methode, die zur Identifizierung eines spezifischen Organs oder Primordiums verwendet wird, die Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung mit markierten Antisense-RNA-Sonden, die spezifisch für ein Gen sind, das in dem interessierenden Organ exprimiert wird. Darüber hinaus ist es relativ einfach, Gene oder Signalwege in Xenopus zu manipulieren, und die In-situ-Hybridisierung ermöglicht es dann, auf Veränderungen im Vorhandensein oder in der Morphologie eines Zielorgans zu testen. Die In-situ-Hybridisierung des gesamten Mount ist ein mehrtägiges Protokoll mit vielen Schritten. Hier bieten wir ein vereinfachtes Protokoll mit reduzierter Anzahl von Schritten und verwendeten Reagenzien, das sich gut für Routine-Assays eignet. In-situ-Hybridisierungsroboter haben den Prozess erheblich vereinfacht, und wir beschreiben, wie und wann wir diese Technologie in diesem Prozess einsetzen. Sobald eine In-situ-Hybridisierung abgeschlossen ist, kann es frustrierend sein, das beste Bild des Ergebnisses aufzunehmen. Wir beraten Sie, wie die Bildgebung von In-situ-Hybridisierungsergebnissen optimiert werden kann. Obwohl das Protokoll die Beurteilung der Organogenese bei Xenopus laevis beschreibt, kann das gleiche Basisprotokoll mit ziemlicher Sicherheit auf Xenopus tropicalis und andere Modellsysteme übertragen werden.

Einleitung

Das Expressionsmuster eines bestimmten Gens ist eine wichtige Information bei der Bestimmung der potenziellen Rolle dieses Gens bei der Entwicklung eines bestimmten Organs oder Zelltyps. Einfach ausgedrückt: Wenn sie nicht zur richtigen Zeit und am richtigen Ort geäußert wird, ist es unwahrscheinlich, dass sie eine Schlüsselrolle spielt. Bei Xenopus, wie bei den meisten frühen Embryonen, ist der am häufigsten verwendete Assay zum Nachweis der Expression eines Gens die In-situ-Hybridisierung mit markierten Antisense-RNA-Sonden. Die Verwendung von Antikörperfärbung zur Beurteilung der Expression eines Gens in Xenopus wird immer häufiger, da Forscher Antikörper entdecken, die normalerweise gegen Säugetierproteine gebildet werden, die mit dem Xenopus-Homolog kreuzreagieren oder ihre eigenen ^1-3 erzeugen. Die überwiegende Mehrheit der Studien zur Xenopus-Organogenese verwendet jedoch immer noch Antisense-RNA-Sonden. Bei der Verwendung von Antikörpern muss jeder einzelne Antikörper häufig für die Primärantikörperkonzentration oder die Fixierungsprotokolle optimiert werden. Im Gegensatz dazu ist das Protokoll für in situ Hybridisierungen für verschiedene Sonden im Wesentlichen invariant. Das Grundkonzept ist relativ einfach und ein hervorragendes Standardprotokoll hat sich gut etabliert ⁴. Unser Protokoll ist eine abgespeckte Version des ursprünglichen Protokolls ⁴, das immer noch einen hervorragenden Nachweis von Genexpressionsmustern im frühen Embryo bietet. Die Embryonen werden fixiert und dann für die Hybridisierung vorbereitet, indem Lösungen und Temperaturen so geändert werden, dass eine hohe Stringenz der markierten Antisense-RNA-Sonde an ihre Ziel-mRNA möglich ist. Die ungebundene Sonde wird weggewaschen und die Embryonen werden dann für die Bindung eines Antikörpers an die Markierung auf den RNA-Sonden vorbereitet. Überschüssiger Antikörper wird dann weggespült und eine enzymatische Farbreaktion wird verwendet, um zu lokalisieren, wo die RNA-Sonde im Embryo gebunden ist. Inzwischen gibt es eine Reihe von transgenen Xenopus-Linien, die die Expression fluoreszierender Proteine in bestimmten Geweben steuern, und diese sind in den Xenopus-Lagerzentren wie der National Xenopus Resource in Woods Hole erhältlich. Diese Option ist zwar sehr nützlich für viele Experimente, bei denen die Organogenese in lebenden Embryonen untersucht werden muss, erfordert jedoch eine separate Unterbringung der transgenen Linien.

Durch die In-situ-Hybridisierung kann klar abgegrenzt werden, wo sich bestimmte Organe oder Zelltypen im frühen Embryo bilden werden (Abbildung 1). Die Technik ist bemerkenswert empfindlich, da man die Genexpression in einer kleinen Anzahl von Zellen in einem einzigen Embryo nachweisen kann ⁵. Eine in situ Hybridisierung mit der Intensität der kolorimetrischen Färbung wird jedoch nicht als quantifizierbar angesehen, da die Farbreaktion nicht linear ist. Trotz der Schwierigkeiten bei der Quantifizierung der Färbeintensität sind die Veränderungen in der Expression oft recht auffällig; insbesondere dann, wenn die in situ Hybridisierung quantifizierbare Zu- oder Abnahmen in der Größe der Expressionsdomänen zeigt ^6,7.

Die klaren Vorteile der In-situ-Hybridisierung machen sie zu einem kritischen Assay für die Untersuchung der frühen Entwicklung. Es ist jedoch ein zeitaufwändiger Vorgang, der viele Schritte über mehrere Tage hinweg erfordert. Dieses Protokoll ist eine vereinfachte Version des Standardprotokolls, die mehrere Schritte eliminiert, ohne die Qualität des In-situ-Ergebnisses zu beeinträchtigen. Durch die Vereinfachung werden auch Variabilitätsquellen eliminiert, was die Fehlersuche erleichtert, wenn eine in situ Hybridisierung nicht optimal ist. Insbesondere haben wir die Verwendung von Proteinase-K- und RNAse-Behandlungen des Embryos eliminiert, zwei Schritte, die von der Qualität der Reagenzien abhängen können und auch die Signalintensität verringern können, wenn sie übertrieben werden. Das Protokoll bietet auch ein gewisses Maß an Kosteneinsparung, da nicht mehr mehrere Reagenzien verwendet werden müssen. Schließlich bietet dieses Protokoll auch einige einfache Richtlinien für eine verbesserte Erfassung von Bildern von in situ Hybridisierungsergebnissen. Obwohl dieses Protokoll für die Arbeit an Xenopus-Embryonen optimiert ist, ist es wahrscheinlich, dass zumindest einige der Vereinfachungen auf die In-situ-Hybridisierungsarbeit in anderen Embryosystemen anwendbar sein werden.

Protokoll

1. Embryo Vorbereitung

1. Wenn nicht routinemäßig als Teil des Embryokultur, de-Gelee Embryonen mit 2,5% Cystein, pH 8,0 vor der Fixierung ⁸ durchgeführt. Obwohl es nicht unbedingt notwendig ist, ist es sinnvoll, dann manuell die Befruchtung Umschlag vor der Fixierung zu entfernen unter Verwendung einer feinen Pinzette.
   1. Verwenden Sie Glas Pasteurpipetten, um die Embryonen zu übertragen. Die Pipette ist nicht breit genug, um zu übertragen Embryonen so verwenden Sie ein Diamant-Stift, um die Glaspipette in einem Punkt weit genug, um holen einen Embryo zu schneiden. Beseitigen Sie die scharfen Kanten der Pipetten nach dem Schneiden durch die schnelle Weitergabe der Schnittspitze durch die Flamme eines Bunsenbrenners, um die scharfen Kanten schmelzen.
      HINWEIS: Es muss dafür genommen werden, da das Glas noch heiß genug ist, um Verbrennungen zu verursachen, auch wenn sie durch eine Sichtprüfung abgekühlt haben wird.
2. Führen Sie den Embryo Fixierung in Etappen. Zuerst bereiten Glasflaschen für den Einsatz in Embryo-Fixierung. Verwenden Sie diese Fläschchen für alle Schritte einschließlich der endgültigenLagerung. Verwenden Fläschchen, die klar mit einer guten Teflon-Dichtung im Deckel gibt, so dass für die Überwachung der Embryonen in allen Phasen des Prozesses. Beschriften Sie die Röhrchen mit entsprechenden experimentellen Daten mit Permanentmarker und dann bedecken Sie das Etikett mit durchsichtigem Klebeband, als auch Permanentmarker werden im Laufe des Verfahrens durch die Verwendung von Alkoholen und anderen Lösungsmitteln verloren.
   1. Verwenden Mempfa, um die Embryonen zu beheben. Einen Vorrat von 8% Paraformaldehyd in Chargen von 50-100 ml auf einmal. Verwenden etwa 75% des erforderlichen H ₂ O und Erhitzen auf 50-60 ° C, die notwendig ist, um das Paraformaldehyd in Lösung zu bekommen.
      ANMERKUNG: Diese Lösung ist etwas anders als die Memfa bei älteren veröffentlichten Protokoll-Versionen verwendet, daß es verwendet Paraformaldehyd anstelle Formaldehyd.
   2. 2-3 Tropfen 10 N NaOH oder bis der pH-Wert ca. 7,5 (Verwendung von pH-Papier einen pH-Wert zu überprüfen). Para ist sehr giftig, daher erzeugen die Stammlösung in einem Abzug. Sobald der paraFormaldehyd liegt in der Lösung, filtriert die Lösung durch Whatman-Papier in einem frischen Gefäß gegeben und mit H ₂ O auf ein Endvolumen. Falls erforderlich, speichern Sie die Paraformaldehydlösung bei 4 ° C für 1-2 Wochen.
   3. Montieren der übrigen Bestandteile des Mempfa Fixierungslösung (Tabelle 1). Dass in der endgültigen Arbeitskonzentration von Paraformaldehyd 4%. Bewahren Sie alle Komponenten der Fixierungslösung bei 4 ° C als Aktien.
   4. Mit einem Schnitt Glaspipette, fixieren die Embryonen aus der Addition der Embryonen an die markierten Glasfläschchen, die mit den etwa 3-4 ml Mempfa Lösung (Tabelle 1) gefüllt wurden. Vermeiden Befestigungs mehr als 20 bis 30 Embryonen pro Fläschchen. Hinzufügen der Embryos mit einem Minimum an Flüssigkeitstransfer vom Embryo Medium. Fix Embryonen Mempfa Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
   5. Bei verspäteter Endoderm Strukturen führen die in Situs manuell isoliert gut und Endoderm-Derivate ^9,10, Die für ein gutes Eindringen der Sonde ermöglicht und vermeidet auch Höhle Färbung.
   6. Speichern eine Lösung von 100% Methanol bei -20 ° C. Nach der Para Fixierung, ersetzen Sie die Mempfa Lösung mit etwa 4 ml der -20 ° C, 100% Methanol für die Lagerung der Embryonen.
   7. Verwirbeln die Fläschchen nach Zusatz des Methanols, um die Embryonen Kleben an der Glas oder anderen Embryos zu verhindern. Stellen Sie außerdem sicher die Fläschchen dicht geschlossen, weil das Methanol kann in den Gefrierschrank im Laufe der Zeit, wenn lose verdampfen.
      HINWEIS: Embryonen für mindestens ein Jahr gelagert werden, und wahrscheinlich länger, in dem Methanol vor ohne Verlust der in-situ-Hybridisierung Qualität der Färbung.

2. Sondenvorbereitung

1. Verwenden 1-2 ug der Ziel-DNA, die mit Digoxigenin markierten Sonden zu machen. Cut Plasmid, das das geeignete DNA-Sequenz am 5'-Ende des Gens von Interesse mit einem Restriktionsenzym für That-Vektor, um Antisense-Sonden erzeugen.
   ANMERKUNG: Das Plasmid sollte einen geeigneten RNA-Polymerase-Bindungsstelle (zB T7, T3 oder SP6) haben.
2. Lassen Sie die DNA, Wasser, NTP mischen und Polymerase-Puffer auf Raumtemperatur erwärmen, sie vor der Montage der Sonde Synthesereaktion. Die Komponenten des RNA-Synthesereaktion in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in der Reihenfolge, wie in Tabelle 2 aufgeführt. Einstellen der Lautstärke der Wasser zugegeben, um das Gesamtvolumen des Sondensynthesereaktion auf 20 ul zu bringen. Bauen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur, weil Komponenten des Polymerase-Puffer können die Matrizen-DNA, wenn sie in hohen Konzentrationen und Kalt auszufällen.
3. Die Transkription über 2 h bei 37 ° C.
   HINWEIS: Die Inkubation von etwas mehr als zwei Stunden, führt zu keinen negativen Auswirkungen, sondern auch zeigen, etwas erhöhte Ausbeute. Wenn für eine Stunde inkubiert, wird die Ausbeute reduziert, aber immer noch ausreichend, um eine gute Probe zu machen.
   1. Während des Wartens auf die Transkriptionsreaktion zu beenden, geben Sie ein Agarose-Gel, die verwendet werden, um die Qualität der Sonde zu testen wird. Schmelze 1 ug Agarose in 100 ml 1x TAE-Puffer (siehe Tabelle 1) durch Erhitzen der Lösung bis zum Siedepunkt. Entfernen Sie die Lösung von der Hitze, wenn die Agarosepulver vollständig gelöst hat.
   2. Add 2 ul Ethidiumbromid-Stammlösung (10 mg / ml) bis ungefähr 100 ml Agarose-Gel, wenn die Agarose wurde auf ca. 60 ° C abgekühlt, um die Visualisierung von RNA unter ultraviolettem (UV) Licht zu ermöglichen.
      Hinweis: Dieses Agarosegel Lösung kann in einem Inkubator von 60ºC gehalten, so dass zukünftige Gele können ohne erneute Schmelzen gegossen werden kann. Achten Sie beim Umgang mit Ethidiumbromid durch potentielle Toxizität.
4. 1 ul DNAseI (RNAse frei grade) zur Transkriptionsreaktion nach der 2-stündigen Inkubation und Inkubieren für weitere 10 min bei 37 ° C, um Matrizen-DNA zu eliminieren.
5. Entfernen 1 ul der Reaktionsmischung aufCheck auf 1% Agarose-TAE-Gel und dem Rest (20 ul) in 80 ul 1% SDS in TE-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), 10 ul 5 M NH ₄ Acetate, und 220 & mgr; kaltem Ethanol. Vortex die Mischung kräftig und zur Seite auf Eis gesetzt, bis die Ergebnisse der RNA Qualitätskontrolle bekannt.
   1. Führen Sie die 1 ul RNA vor der Fällung auf dem 1% Agarose-TAE-Gel entfernt. Um das Laden auf das Gel zu erleichtern, fügen Sie 4-5 ul Wasser und 1 ul der Standardladefarbstoff an die RNA. Sehen Sie sich die RNA auf dem Gel mit Hilfe eines UV-Licht-Transilluminator, um die Qualität der Sonde zu überprüfen (siehe Diskussion).
6. Man fällt die verbleibende RNA, die beiseite auf Eis in Schritt 2.5 durch Schleudern in einer Mikrozentrifuge bei voller Geschwindigkeit für 10 bis 15 min eingestellt wurde. Beziehen Sie den Überstand mit einer Glaspipette herausgezogen und lassen kurz trocknen.
   1. Resuspendieren Fühler mit 1 ml RNA-Hybridisierungspuffer (Tabelle 1) in der Eppendorf-Röhrchen. Vortex und briefly erhitzen das Rohr auf 37 ° C und Wirbel wieder. Übertragen Sie die Sondenlösung auf eine 15 ml Schraubkappe Polystyrolröhrchen und füllen auf 7-10 ml mit RNA-Hybridisierungspuffer. Hinweis: Die Sonde kann weiter verdünnt werden (eine 10-fach weitere Verdünnung noch funktionieren kann) häufig zu geringe Hintergrundfärbung, aber die Reaktionen auch länger dauern.

3. In situ-Hybridisierung

1. Nimm die Embryonen, die -20 ° C Methanol gelagert wurden genommen und auf Raumtemperatur erwärmen. Führen Sie den gesamten Vorgang in den Glasfläschchen. Wenn verschiedene Embryonen aus einer Gruppe werden in Zukunft an die von verschiedenen Sonden betrachtet werden, halten sie in einem einzigen Fläschchen bis kurz vor die Sonden werden hinzugefügt, um die Variabilität und Arbeit am ersten Tag zu reduzieren.
   1. Rehydrieren der Embryonen durch eine Methanolreihe, wie in Tabelle 3 (siehe Tabelle 1 für Wasch Rezepturen) in Vorbereitung für das Hinzufügen der Sonde dargestellt. Leichte Kreisbewegungen ausführen embryos nach jeder Änderung, um sicherzustellen, sie werden nicht an den Wänden zu oder voneinander, und Rock die Embryonen durch die Montage der Ampullen auf einem Kolbenpendel. Bei der Übertragung der Flüssigkeiten, überprüfen Sie das Innere der Kappen zu gewährleisten, dass Embryonen nicht dort gefangen.
   2. Einmal in der Sondenlösung, hybridisieren die Embryos über Nacht, wie in Tabelle 3 beschrieben.
2. Nehmen Sie die Sondenlösung. Speichern Sie die verwendete Sonde durch Lagerung in einem 15 ml Schraubkappe Polystyrolröhrchen, mit Datum und wie oft die Sonde verwendet wurde markiert, bei -20 ° C.
   HINWEIS: Die gleiche Sonde kann viele Male für die nachfolgende in situ Hybridisierungen wiederverwendet werden, bis die kolorimetrischen Reaktionen beginnen, eine ungewöhnlich lange Zeit in Anspruch nehmen, um die gewünschte Intensität zu erreichen.
   1. Sobald die Sonde entfernt wird, bereiten die Embryonen für die Antikörperfärbung gegen die Sonde durch die Reihe von Waschvorgängen in der Tabelle 4 dargestellt. Ändern Sie die Temperatur nach Bedarf (Tabelle 4), indem Sie ter Kolbenpendel, mit Fläschchen von Embryonen angebracht, direkt in Hybridisierungs Öfen, die auf die entsprechende Temperatur eingestellt sind.
   2. Bilden das entsprechende Volumen des MAB + HTSS + BR + anti-Dig-Antikörper (Tabelle 4) zu der Zeit, daß die Embryonen in der MAB inkubiert + HTSS + BR Blockierungslösung, so dass der Antikörper vor der Zugabe zu dem blockierten Embryonen. Stellen Sie die Sperr Lösungen frisch am Tag der Nutzung.
3. Entfernen der Antikörperlösung und beginnen wäscht wie in Tabelle 5 nach Inkubation über Nacht mit Antikörper beschrieben. Führen mindestens zwölf 30minütigen Spülungen, um für die Färbung mit der alkalischen Phosphatase-Substrats herzustellen und reduzieren den Hintergrund, so viel wie möglich. Entweder MAB Puffer oder TBT-Lösung (Tabelle 1) für die Waschschritte.
   HINWEIS: TBT Lösung TTW die 2 mg hat / ml BSA zugegeben.
   1. Ersetzen Sie die letzte Waschlösung mit dem BM Lila alkalische Phosphatase-Substrat. Führen Sie die Färbung reaction entweder bei Raumtemperatur oder 37 ° C.
      HINWEIS: Die Färbung wird bei 37 ° C schneller, aber wenn über Nacht stehen gelassen, unannehmbare Hintergrundfärbung oft eine Folge sein. Die Färbung Reaktionen erfordert häufig über Nacht-Färbung und Raumtemperatur ist am sichersten für diese.
   2. Wenn weitere Färbung erforderlich ist und die BM purple Lösung nimmt eine blaue Farbe, ersetzen Sie die Farblösung mit frischen BM Lila und setzen Sie die Rohre in 37 ° C. Wenn die Ziel-mRNA ist sehr reichlich, legen Sie die Embryonen in der Färbelösung bei 4 ° C über Nacht und verschieben Sie die Embryonen auf Raumtemperatur oder 37 ° C, um eine bessere Überwachung der Farbreaktion zu ermöglichen.
   3. Günstige Mietwagen finden Reaktionen sorgfältig, da die Zeit, um endgültige Ergebnis variiert beträchtlich zwischen den verschiedenen Ziel-RNAs. Aus Gründen der Einheitlichkeit, stoppen Sie die Farbreaktion (siehe 3.4), wenn es keine neuen Seiten des Ausdrucks, die sich mit längeren Inkubationszeiten. Wichtig ist, dass, wenn in situ-Hybridisierung wird nach einer Untersuchung verwendetfür Experimente eine Betrachtung der verschiedenen Behandlungsgruppen, die gleiche Zeit für die Farbreaktionen zwischen Behandlung und Kontrolle Embryonen.
4. Stoppen Sie die Farbreaktion und Vorbereitung der Embryonen für die Lagerung und die Bildaufzeichnung, indem Sie die Flüssigkeiten, wie in Tabelle 6 dargestellt. Die Embryonen rocken Sie zu diesem Zeitpunkt nicht, weil die Entfernung von Flecken kann als lila Färbung des Methanols um die Embryos visualisiert werden.
   HINWEIS: Oft Embryonen haben eine leichte Blaufärbung von der Färbelösung und kaltem Methanol zumindest teilweise zu entfernen, dass, obwohl dies nicht ausreichend ist, um schwere Hintergrund oder Hohlraum Färbung zu entfernen. Kaltem Methanol bezieht sich auf Methanol, das in einem -20ºC Gefrierschrank gehalten wird.
   1. Rehydrieren die Embryonen und befestigen Sie den Fleck mit Mempfa (Tabelle 6). Einmal befestigt, entfernen Sie die Mempfa und waschen Sie die Embryonen mit 25% Methanol.
   2. Nehmen Sie die 25% Methanol und fügen Sie die Bleichlösung, wenn die Entfernung von endogenen Pigmenterforderlich. Achten Sie beim Umgang mit der Bleichlösung, wie es kann zu Verbrennungen führen. Beachten Sie die Bleich eng wie es geschieht relativ schnell, und die Bleichgrad für verschiedene Effekte (2) variiert werden.
   3. Dehydratisieren Embryonen durch eine Methanolreihe bis 100% Methanol für die Langzeitlagerung nach der Aufhellung oder übertragen zu PBS für die kurzzeitige Lagerung und nachfolgende Abbildungs ​​(siehe Tabelle 6).

4. Imaging Embryonen

1. Sobald ein Embryo hat die Färbung abgeschlossen, Bild der Embryo, so dass die Informationen darüber, wo das Gen von Interesse exprimiert wird für ein breiteres Publikum erobert. Verwenden Sie 1% Agarose als Hintergrund zu ungeklärten Embryonen zu sehen.
   HINWEIS: Die Agarose gibt einen blau / grauen Hintergrund, die gut mit dem Embryo und dem Blau des Farbreaktion kontrastiert. Es hilft auch, diffundieren störende Schatten und Reflexionen, die Aufmerksamkeit von der Embryo abzulenken.
   1. Fügen Agarose zu Wasser und dann zum Kochen bringen, bis die Agarose in Lösung und vor dem Einfüllen in die Petrischale abkühlen lassen 50. Wie bei der TAE-Gel-Lösung, speichern Sie die Agarose-Lösung in 55 ° C Inkubator für verschiedene Zwecke verwendet werden. Gießen der Agarose zu einer Tiefe von etwa 2 mm in die Petrischale. Falls erforderlich, stellen Sie die Tiefe von Agarose, ein wenig anders Schatten der Hintergrund ergeben.
   2. Nach der Rehydratisierung durch die Lagerung in Methanol zu einer wässrigen Lösung (PBS oder TTW), unter Verwendung eines Methanol-Reihe, legen die Embryos in einer Petrischale mit dem Agarose-Basis (siehe Tabelle 6). Bewahren Sie die Lösung sauber und, falls erforderlich, verwenden Sie einfache Filterung, um kleine Partikel, die den sauberen Hintergrund der guten Bilder stören können, zu beseitigen.
   3. Um die Bild die Embryonen aus alternative Ansichten, beispielsweise von der Bauchseite, schneiden dünne Kanäle in der Agarose, um den Embryo zu passen mit feinen Pinzette und legen Sie die Embryonen in die Kanäle, für Orientierung (Abbildung 3 ). Achten Sie darauf, in die Manipulation der Embryonen, da sie leicht beschädigt werden.
      HINWEIS: Die meisten Stadien haben eine charakteristische Position, dass sie, wenn sie in Lösung gebracht zu übernehmen. Zum Beispiel neigen Blastula-Embryonen zu Tier Seite nach oben zu sitzen. Sobald die Embryonen beginnen zu verlängern, lagen sie auf ihrer Seite.
2. Verwenden des Faseroptik-Lichtquelle, um das Embryo aus einem flachen Winkel zu beleuchten, wodurch Schatten auf dem Embryo, der Tiefe, um das Bild und helfen erkennen Oberflächenstrukturen. Da Bleich kann Pigment, das nützlich Sehenswürdigkeiten bietet, zu beseitigen verwenden Shadowing für stark gebleicht Embryonen.
3. Deaktivieren der Embryonen zur Bildfärbung, die tief innerhalb des Embryos ist, wie im Notochord, Lunge oder Gehirnregionen, (Figur 4). Um dies zu erreichen, setzen Sie die Embryonen durch eine Methanol-Serie bis in 100% Methanol.
   1. Nach vollständigem Eintauchen in Methanol, Transfer der Embryonen zu einer Lösung aus einem Teil Benzylalkohol und zwei Teile Benzylnzoate (BABB). Die Embryonen werden zunächst auf der Oberfläche schwimmen, sondern als das Methanol vermischt sich mit dem BABB, werden sie in die BABB sinken. Führen Sie jeden Schritt den Umgang mit BABB in Glasfläschchen oder Gerichte; BABB wird jeden Kunststoff oder Lack zu schmelzen.
   2. Einmal gelöscht, zeigen Sie die Embryonen mit Durchlicht von unten kommend den Embryo. Stellen Sie die Intensität des Lichtes als auch die schräg von unten, um den Kontrast zu verbessern und die beste Farbe.
   3. Bei der Anzeige gelöscht Embryonen erhöhen die Glas-Petrischale aus der Basis. Tun Sie dies, indem Sie einfach mit zwei anderen Petrischale Deckel um sie zu erhöhen, so dass die Region der Schale mit Embryonen erhöht ist.
      HINWEIS: Dies hat den Vorteil der Einnahme des Basis unscharf und die Beseitigung der störenden Effekte von Fehlstellen oder Flecken auf dem Mikroskopbasis, die mit dem Bild stören können.

5. Doppelklicken Sie in situ Hybridisierung

1. Um gleichzeitig zu betrachten das Expressionsmuster von two verschiedener Gene in einem einzigen Embryo synthetisieren zwei Sonden, eine für jede der verschiedenen Gene. Synthetisieren einer Sonde mit DIG-11-UTP als Etikett wie oben beschrieben. Verdünnen Sie das Produkt aus der Transkriptionsreaktion in RNA-Hybridisierungspuffer, um eine 3x konzentrierter Sonde ergeben als für einzelne in situ-Hybridisierungen verwendet.
   1. Synthetisieren die andere Sonde von Interesse mit dem gleichen Protokoll wie für DIG markiertem außer dass Fluorescein-12-UTP sondiert muss für DIG-11-UTP ersetzt werden. Verdünnen Sie das Produkt aus der Transkriptionsreaktion in RNA-Hybridisierungspuffer, um eine 3x konzentrierter Sonde ergeben als für einzelne in situ-Hybridisierungen verwendet.
   2. Mischen Sie die beiden konzentrierten Proben in einem Verhältnis 1: 1. Die besten Ergebnisse erzielen, verwenden Sie die fluoreszenzmarkierte Sonde für das Gen, das den stärksten Ausdruck in der einzigen in-situ-Hybridisierung Protokoll zeigt.
2. Verwenden Sie dasselbe in situ Hybridisierung Protokoll beschrieben für Einzel in situ </ Em> Hybridisierungen mit Ausnahme der doppelte Sonde (Sonde, die die 1,5-fach konzentrierten Mischung aus Digoxigenin-markierte und Fluorescein-markierten Sonden) am Ende des ersten Tages an Stelle eines einzigen in situ Hybridisierungssonde.
   1. Folgen der einzigen Hybridisierungsprotokoll am zweiten Tag des Doppel in situ Hybridisierungsprotokoll, mit der Ausnahme, Anti-Fluorescein-AP Fab-Fragmenten bei einer 1: 4.000-Verdünnung anstelle von Anti-DIG-AP Fab-Fragmenten. Waschen Sie die überschüssige Antikörper aus dem Embryo, wie im einzelnen in situ-Protokoll und die Durchführung der ersten Farbreaktion unter Verwendung des BM-Purpur AP-Substrat.
3. Nach der ersten Farbreaktion, inaktivieren die Fluorescein-Antikörper in 0,1 M Glycin, pH 2,0 für 40 Minuten, gefolgt von fünf zehn min Waschen in MAB. Blockieren Sie die Embryonen in MAB + HTSS + BR 90 min. Hinzufügen des Anti-DIG-Antikörper in einer 1: 2.000-Verdünnung in MAB + HTSS + BR und Inkubieren bei 4 ° C über Nacht.
   1. Am folgenden Tag, waschen Sie die Embryonen thoroughly in MAB (12 Wäschen von 30 min), um den überschüssigen Antikörper zu entfernen.
   2. Waschen der Embryos für 10 min in AP-Puffer (Tabelle 1) und dann mit BCIP (0,5 mg / ml in AP-Puffer) zu färben.
      ANMERKUNG: Die in situ-Kombination sollte einen dunklen blau-violett-Färbung für die erste Farbreaktion und eine hellblaue Farbreaktion für die zweite (5) zu ergeben.
   3. Stoppen Sie die letzte Farbreaktion durch Entfernen der AP-Puffer und spülen dreimal mit MAB. Befestigen Sie die Embryonen mit Mempfa 10 min. Mit 5 schnelle Waschungen in MAB oder TBT waschen Embryonen.
   4. Mit dieser Farbkombination, ist die Verwendung von Methanol in den post Färbung Behandlungen nicht mehr möglich ist, da es die BCIP allein Farbe zu beseitigen. Speichern der Embryonen nach dem Färben und Fixieren in PBS mit 0,02% Natriumazid. Färbeintensität kann schwach mit Doppel in Situs sein. Wenn dies ein Problem ist, reduzieren die Wäschen auf vier, die jeweils 2 Stunden Dauer.

Ergebnisse

Die Verwendung von gewebespezifischen Sonden können hervorragende Informationen in Bezug auf den Stand der Entwicklung für spezifische Organe bereitzustellen. In den folgenden Beispielen wird die Stufe des Embryos auf der Nieuwkoop und Faber Staging-Tabelle ¹¹ basieren. Wenn man Sonden Form Gene nach der Differenzierung zum Ausdruck, Troponin I in der ersten Stufe 28 bis 30, zum Beispiel (1C), die Anwesenheit oder die Größe eines differenzierten Organs verwendet, kann zu jedem Zeitpu...

Diskussion

Die Fähigkeit, in situ Hybridisierung verwendet werden, um die Expressionsmuster von spezifischen Genen sichtbar bleibt das am häufigsten verwendete Verfahren zur spezifischen Organen oder Zelltypen in Xenopus Embryo identifizieren. Dies ist wegen der verschiedenen Vorteile, die diese Technik bietet. Die Expression eines Gens spezifischen Strukturen und vor jedem histologischen Zeichen der Differenzierung zu identifizieren, wie die Hülle für Nkx2.5-Expression in den Herz Progenitoren vor einer...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Labguake Röhrchenschüttler	VWR	17-08-2011
VWR Fläschchen	VWR	10-07-2012
L-Cystein	BioShop	CYS342.500
Ribonukleosid-Triphosphat-Set, 100 mM	Roche	11277057001
Digoxigenin-11-UTP	Roche	11209256910
Rnase Inhibator (Rnase OUT)	Invitrogen	10777-019
T7 RNA Polymerase	Fermentas	EPO111
T3 RNA Polymerase	Fermentas	EPO101
SP6 RNA Polymerase	Fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen &	18047-019
Schaf Serum	Wisent	31150
Blockierungsreagenz	Roche	11096176001
BM violett Ap Substrat	Roche	11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb Fragmente	Roche	11093274910
Methanol	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	EM	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	EM	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
Paraformaldehyd	BioShop	PAR070.500
Formamid	VWR	CAFX0420-4
RNA	Roche	10109223001
Maleinsäure	VWR
	BioShop	CIT001
Wasserstoffperoxid (30% ige Lösung)	EM	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
Benzylalkohol	Sigma	B-1042
Benzylbenzoat	Sigma	B-6630
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500