Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Zusammenfassung

Zebrafisch-Embryonen sind ein mächtiges Werkzeug für große Screening kleiner Moleküle. Transgene Zebrafisch, die fluoreszierende Reporter-Proteine ​​exprimieren, werden häufig verwendet, um Chemikalien, die die Genexpression modulieren. Chemische Bildschirme, die Fluoreszenz-in-Live Zebrabärblingtest verlassen sich oft auf teure Spezialausrüstung für High Content Screening. Wir beschreiben ein Verfahren, mit einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Bühne, um automatisch Bildzebrafischembryonen und erkennen Gewebe-spezifische Fluoreszenz. Mit transgenen Zebrafisch, die Östrogen-Rezeptor-Aktivität berichten über die Expression von GFP, entwickelten wir eine semi-automatische Verfahren für Östrogen-Rezeptor-Liganden, die die Reporter in einem Gewebe-spezifisch aktivieren screenen. In diesem Video beschreiben wir Verfahren zum Ordnen von Zebrafisch-Embryonen von 24-48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) in einer 96-Well-Platte und das Hinzufügen von kleinen Molekülen, die Östrogen-Rezeptoren binden. Bei 72-96 hpf, Bilder von jedem gut ausdie gesamte Platte, werden automatisch gesammelt und manuell für Gewebe-spezifischen Fluoreszenz untersucht. Dieses Protokoll zeigt die Fähigkeit, Östrogen-Rezeptoren, die in Herzklappen zu aktivieren, aber nicht in der Leber zu erkennen.

Einleitung

Transgene Zebrafisch entwickelt worden, die zur direkten Visualisierung der Aktivität in Signalwege, wie beispielsweise Fibroblasten-Wachstumsfaktoren ^{1, 2} Retinsäure und Östrogene ^3, lebenden Embryos zu ermöglichen. Solche Werkzeuge ermöglichen Screening für Chemikalien, die Signalwege zu stören (wie Änderung der Fluoreszenzintensität analysiert wurde) oder Chemikalien, die Signalgebung modulieren in einer gewebespezifischen Art und Weise (Änderung der Fluoreszenzlokalisierungs) ^4. Automatisierte Bildaufnahme erhöht den Durchsatz der chemischen Bildschirme dramatisch ^5,6. Bildschirme, die automatisch im Live-Test Fluoresze....

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von der Universität von Alabama in Birmingham Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Zebrafisch-Zucht-und Ei-Sammlungen

1. Drei Tage vor Beginn der Einwirkung von Chemikalien, montieren Zuchtbecken mit Unterteilungen, getrennte Männer und Frauen. Füllen Sie jeden Tank zur Hälfte mit Wasser Aquakulturanlage. Mit einem Netz, übertragen Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 Fisch Zuchtbecken, indem zwei Männer und 3 Frauen in jedem Tank durch einen Teiler getrennt. Legen Sie einen Deckel auf jedem Behälter und Etikett mit Datum und Stämme gekreuzt werden.
2. Am f....

Ergebnisse

Fig. 1 zusammengesetzte Bilder aus einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Jedes zusammengesetzte Bild wird von 59 Einzelbildern mit 5% Bildüberlappung besteht. Beachten Sie, dass die Live-Zebrafisch sind zufällig in jedem gut orientiert, aber wir sind in der Lage, um die Fluoreszenz im Herzen von der Leber zu unterscheiden. Hell Bilder sind als Verweise auf Zebrafisch-Orientierung zu beurteilen und zu visualisieren, morphologische Veränderungen (1A und 1C). Automated Imaging mit e.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um automatisch Bild Gewebe-spezifischen Fluoreszenz in Zebrafischembryonen. Das Protokoll wurde mit einem Zeiss Axio Observer entwickelt. Z1 mit Zen-Blau-2011-Software, aber die Technik kann mit jedem inversen Mikroskop mit einem motorisierten Mikroskop Bühne und Steuerungssoftware, die Fliesen durchführen, um zusammengesetzte Bilder erstellen angepasst werden. Das Ausrüsten eines inversen Mikroskops mit einem motorisierten Stufe kann eine praktische, preiswerte Alterna.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Transferpipetten aus Kunststoff; mit breiter Bohrung	Fisher	13-711-23
Transferpipetten aus Kunststoff; feine Spitze	Fisher	13-711-26
96-Well-Platten mit rundem Boden	Fisher	21-377-203
Platten mit 100 x 35 mm	Fisher	08-757-100D
Platten mit 35 x 60 mm	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 feine Pinzette	Fine Science Tools	11254-20	Spitzenmaße 0,05 x 0,01 mm, zur manuellen Entnahme von Chorionen aus Embryonen
Tricain Methansulfonat	Sigma Aldrich	A5040-25G	siehe Zebrafisch Buch für Rezept (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	20 mM Vorrat vorbereiten (100x) und bei 200 μm verwenden; M in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protokoll erfordert ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Tisch
20x Objektiv mit langem Arbeitsabstand	Carl Zeiss		Wir verwenden ein Objektiv mit 0,4 NA und 8,4 mm Arbeitsabstand
Axiocam HRm Digitalkamera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 Mikroskopsteuerungssoftware	Carl Zeiss		Das Protokoll erfordert eine Automatisierungs- und Steuerungssoftware für die Mikroskopie, um die Aufnahme von gekachelten Bildern mit einem motorisierten Tisch
zu ermöglichen Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 Gramm	ergeben eine 2%ige Lösung in RO-Wasser zur Verwendung in E3B (unten)
E3B			60X E3 LÖSUNG: NaCl                                      - 17,2 Gramm KCl                                            - 0,76 Gramm CaCl2-2H2O        - 2,9 Gramm MgSO4-7H2O  - 4,9 Gramm oder MgSO4 - 2,39 Gramm In 1 Liter Milli-Q Wasser auflösen; In steriler 1-Liter-Flasche aufbewahren. 1X E3B LÖSUNG FÜR ZEBRAFISCHE: 60X E3          150 ml 2% Methylenblau        100 μ l  Mit Milli-Q Wasser auf 9 Liter bringen