In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Zusammenfassung

Unmodifizierten und hyperphosphoryliertem Tau-Proteine ​​wurden in zwei In-vitro-Aggregationstests verwendet, um die Hyperphosphorylierung abhängige schnell Aggregationskinetik offenbaren. Diese Assays ebnen den Weg für weitere Bildschirme für Verbindungen, die die Neigung von hyperphosphoryliertem Tau modulieren kann zur Bildung von Fibrillen, die das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit zugrunde bilden.

Zusammenfassung

Die Alzheimer-Krankheit gehört zu einer großen Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen, die als Tauopathien bekannt sind und sich durch die neuronalen Ablagerungen des hyperphosphorylierten Tau-Proteins in Form von neurofibrillären Tangles (NFTs) manifestieren. Die Dichte von NFT korreliert gut mit kognitiven Beeinträchtigungen und anderen neurodegenerativen Symptomen, was zu dem Bestreben führte, auf Tau-Aggregation basierende Therapeutika zu entwickeln. Bisher verwenden Tau-Aggregationsassays jedoch rekombinantes oder synthetisches Tau, das frei von den pathologischen Phosphorylierungsmarkierungen ist. Hier beschreiben wir zwei Assays, bei denen rekombinantes, hyperphosphoryliertes Tau als Subjekt verwendet wird. Diese Assays können für Hochdurchsatz-Screenings nach Verbindungen skaliert werden, die die Kinetik oder Stabilität von hyperphosphorylierten Tau-Aggregaten modulieren können. Neuartige Therapeutika für die Alzheimer-Krankheit und andere Tauopathien können möglicherweise unter Verwendung hyperphosphorylierter Tau-Isoformen entdeckt werden.

Einleitung

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine von einer großen Sammlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Tauopathien bekannt. Die Quintessenz der zugrunde liegenden Pathologie Tauopathie um die Neurofibrillen, NFTs, in Neuronen, Astrozyten und Mikroglia ^1-4. Die NFT Dichte korreliert mit kognitiver Beeinträchtigung ^3,5 und Verlust von Nervenzellen ^6. NFT enthält in erster Linie hyperphosphoryliertem Tau-Protein (im Folgenden als "p-tau" fortan genannt), die direkt oder gepaarten helikalen Filamenten (PHF) ^7,8 bildet. Tau ist ein Mikrotubuli-assoziierten Protein vermutlich axonalen Transport, die für neuronale Signalübertragung u....

Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Aggregationspuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Lagern Sie bei RT, über Monate stabil. Supplement 1 mM Dithiothreitol (DTT) vor dem Gebrauch.
   HINWEIS: a HEPES-basierten Puffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) erzeugt auch ähnliche Ergebnisse in Tau-Aggregation.
2. Bereiten Thioflavin T oder Thioflavin S-Stammlösung (3 mM, in Aggregationspuffer) und Filter von 0,22 um sterile Filtereinheit. Bei -20 ° C in einem Röhrchen mit Aluminiumfolie abgedeckt, über Monate stabil.
3. Bereiten Heparin-Stammlösung (300 & mgr; M in Aggregationspuffer). Lagerung bei -20 ° C, für Monat....

Ergebnisse

Unter Verwendung rekombinanter tau und p-tau (Abbildung 1), haben wir zwei verschiedene Protokolle, die Kinetik der Aggregation von Tau und p-tau zu vergleichen, unter Ausnutzung der starken Fluoreszenzemission ThT THS bei Bindung an amyloide Protein-Aggregate, einschließlich tau und p-tau (Abbildung 2). Mit oder ohne dem Fluoreszenzfarbstoff in der Aggregationsreaktion beobachteten wir konsequente Weiterentwicklung der Tau-Aggregation durch Hyperphosphorylierung (Figuren 3-5).<.......

Diskussion

Dieses Protokoll zeigt unterschiedliche Assaybedingungen und Instrumente, die phosphorylierungsabhängige schnell tau Aggregationskinetik erkennen. Im Terminal Assay wird der Fluoreszenzfarbstoff ThT zu einem Teil der Reaktionsmischung aus dem Master zu jedem Zeitpunkt entfernt, hinzugefügt. Amyloid-bindende-induzierte Fluoreszenz wird gemessen ^26. In der zweiten, mit Farbstoff Modus Tau-Aggregation in Gegenwart von ThT oder ThS geführt, wodurch diese Art von Reaktion geeignet für automatischen Echtzeit-Beurte.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Trizma  base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Feinchemikalien	MAL-7581-06
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Dunkel gelagert
Thioflavin S	Sigma	T1892	Dunkel
Heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Gelagert bei 4 > C
96-Well-Platte	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Maus Anti-Tau Monoklonaler Antikörper	R& D Systems	MAB3494	Gespeichert um – 80°; C