Linear Amplification vermittelte PCR - Lokalisierung von genetischen Elementen und Charakterisierung von Unbekannt flankierenden DNA-

Summary

Linear-vermittelte Amplifikation (LAM)-PCR ist eine Abwicklung, die genauen Positionen der Integration von viraler Vektoren in das Genom zu identifizieren Verfahren. Die Technik hat sich weiterentwickelt, um die überlegene Methode zur klonalen Dynamik in der Gentherapie-Patienten, biologische Sicherheit von neuartigen Technologien Vektor, T-Zell-Vielfalt, die Krebsstammzellen Modelle usw. studieren

Abstract

Die lineare Amplifikations-vermittelte PCR (LAM-PCR) wurde entwickelt, um die Hämatopoese in genkorrigierten Zellen von Patienten zu untersuchen, die durch eine Gentherapie mit integrierenden Vektorsystemen behandelt wurden. Aufgrund der stabilen Integration retroviraler Vektoren können Integrationsstellen genutzt werden, um das klonale Schicksal einzelner Zellen und ihrer Nachkommen zu untersuchen. Die LAM-PCR konnte erstmals nachweisen, dass die Leukämie bei gentherapeutisch behandelten Patienten auf eine Provirus-induzierte Überexpression eines benachbarten Proto-Onkogens zurückzuführen ist. Die hohe Sensitivität und Spezifität der LAM-PCR im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der inversen PCR und der Ligationsvermittelten (LM)-PCR wird durch einen initialen Präamplifikationsschritt (lineare PCR von 100 Zyklen) unter Verwendung biotinylierter vektorspezifischer Primer erreicht, die es ermöglichen, nachfolgende Reaktionsschritte an fester Phase (magnetische Beads) durchzuführen. Die LAM-PCR ist derzeit die empfindlichste verfügbare Methode zur Identifizierung unbekannter DNA, die sich in der Nähe bekannter DNA befindet. Kürzlich wurde eine Variante der LAM-PCR entwickelt, die den Restriktionsverdau umgeht und damit den Retrieval-Bias von Integrationsstellen aufhebt und eine umfassende Analyse von Provirus-Lokalisationen im Wirtsgenom ermöglicht. Das folgende Protokoll erklärt Schritt für Schritt die Amplifikation sowohl von 3'- als auch von 5'- Sequenzen, die an den integrierten lentiviralen Vektor angrenzen.

Introduction

Linear-PCR-vermittelte Amplifikation (LAM-PCR) ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von unbekannten flankierenden DNA benachbart zu bekannten DNA beliebigen Ursprungs. Genauer gesagt, LAM-PCR wurde zur viralen Vektor Integrationsstellen zu lokalisieren (IS) innerhalb des Wirtsgenoms ^1,2. Genetische Elemente wie Transposons oder Retroviren integrieren ihr Genom in das Wirtsgenom in einer (halb-) zufälliger Weise ^3-6. In vielen Fällen ist es entscheidend, genau die Position, wo diese Vektoren integriert kennen. LAM-PCR nachgewiesen worden überlegen alternative Techniken wie PCR-vermittelte Ligation ⁷ und seiner Varianten....

Protocol

1. Vorbereitung der Linker-Kassetten (LC)

1. Mischungs 40 ul LC1 Oligonukleotid (Tabelle 1), 40 ul Oligonukleotid LC2 (Tabelle 1, mit der richtigen Restriktionsenzym Hang), 110 &mgr; l Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) und 10 ul 250 mM MgCl _2.
2. Inkubation bei 95 ° C für 5min und ließ die Reaktion abkühlen langsam auf Raumtemperatur. In 300 ul H ₂ O und konzentrieren dsLinker-DNA auf einem Zentrifugation Filter. In 80 ul H ₂ O zu den aliquoten Eluat und 10 ul bereit Linker-Kassette in 0,2 PCR-Röhrchen.

2. Vorverstärkung der Vektor-Genom-Junctions

1. F....

Results

LAM-PCR-Amplifikation resultiert in der Vektor-Genom-Übergänge mit einer definierten Fragmentgröße für jede Kreuzung. Die Größe der einzelnen PCR-Fragmente hängt von der Entfernung zwischen dem Ort der bekannten DNA in das Genom und dem nächsten Restriktionsenzym-Erkennungsstelle. Dies ermöglicht die Visualisierung der Vielfalt der amplifizierten Gänge in analysierten Proben durch Gelelektrophorese, zB. Wenn nur einzelne (monoklonal), mehrere (oligoklonale) oder mehrere (polyklonal) Banden auf dem Gel vorhanden.......

Discussion

Die LAM-PCR-Technik ermöglicht die Identifizierung von unbekannten DNA-Sequenzen, die eine bekannte DNA-Region flankieren. Wegen der hohen Empfindlichkeit von Vorverstärkung der Verbindungen mit spezifischen Primern hybridisiert in der bekannten DNA-Sequenz ergeben, ist es möglich, zu verstärken und zu detektieren, auch seltene Kreuzungen auf Einzelzellebene. Gegenteil, in einem polyklonalen Situation LAM-PCR ist in der Lage, Tausende von verschiedenen Verbindungen in einer einzigen Reaktion zu verstärken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA Polymerase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Alternative Taq Polymerasen können verwendet werden
PCR Puffer	Qiagen	201203	Verwendung dieses Puffers wird empfohlen
dNTP-Mixture	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	oder andere dNTPs
Oligonukleotide (Primer)	MWG Biotech		HPLC gereinigte
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0,1 % Gew./Vol. BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7,5	USB Corporation	22637	oder ein anderer Lieferant
EDTA	Applichem	A1103,0250	oder ein anderer Lieferant
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Hexanukleotidmischung	Roche Diagnostics	11277081001
Restriktionsendonuklease	NEB		oder ein anderer Anbieter
Fast-Link DNA-Ligationskit	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	oder ein anderer Anbieter
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	oder ein anderer Anbieter
FSME-Puffer	Amresco	0658	oder ein anderer Anbieter,
Ethidiumbromid	Applichem	A2273,0005	Ethidiumbromid ist mutagen
100 bp DNA-Leiter	Invitrogen	15628-050	oder eine andere DNA-Leiter
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	oder ein anderer Anbieter
Magna-Sep Magnetpulverabscheider	Life Technologies	K158501	für die Verwendung mit 1,5-ml-Röhrchen
, Magna-Sep Magnetpulverseparator	Life Technologies	K158696	für die Verwendung mit 96-Well-Platten
, Amicon Ultra-0,5, Ultracel-30 Membran	Millipore	UFC503096
Midi S	PeqLab	40-1515	oder anderen Elektrophoresesystemen.
TProfessional 96	Biometra	050-551	oder andere Thermocycler für 96-Well-Platten
Orbitalschüttler KS 260 basic	IKA	2980200	oder andere horizontale Schüttler
PCR Softtubes 0,2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	oder andere 0,2 ml PCR Gefäße
1,5 ml Gefäße	Eppendorf	12682	oder andere 1,5 ml Gefäße
Gel-Dokumentationssystem	PeqLab		oder ein anderes Gel-Dokumentationssystem
Nanodrop ND-1000 Spektralphotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 Fertiggel	Elchrom Scientific	3497
Tauchgelelektrophoresegerät SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Elektrophorese-Bioanalysator	Agilent Technologies	G2939AA