Linear Amplification vermittelte PCR - Lokalisierung von genetischen Elementen und Charakterisierung von Unbekannt flankierenden DNA-

Summary

Linear-vermittelte Amplifikation (LAM)-PCR ist eine Abwicklung, die genauen Positionen der Integration von viraler Vektoren in das Genom zu identifizieren Verfahren. Die Technik hat sich weiterentwickelt, um die überlegene Methode zur klonalen Dynamik in der Gentherapie-Patienten, biologische Sicherheit von neuartigen Technologien Vektor, T-Zell-Vielfalt, die Krebsstammzellen Modelle usw. studieren

Abstract

Die lineare Amplifikations-vermittelte PCR (LAM-PCR) wurde entwickelt, um die Hämatopoese in genkorrigierten Zellen von Patienten zu untersuchen, die durch eine Gentherapie mit integrierenden Vektorsystemen behandelt wurden. Aufgrund der stabilen Integration retroviraler Vektoren können Integrationsstellen genutzt werden, um das klonale Schicksal einzelner Zellen und ihrer Nachkommen zu untersuchen. Die LAM-PCR konnte erstmals nachweisen, dass die Leukämie bei gentherapeutisch behandelten Patienten auf eine Provirus-induzierte Überexpression eines benachbarten Proto-Onkogens zurückzuführen ist. Die hohe Sensitivität und Spezifität der LAM-PCR im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der inversen PCR und der Ligationsvermittelten (LM)-PCR wird durch einen initialen Präamplifikationsschritt (lineare PCR von 100 Zyklen) unter Verwendung biotinylierter vektorspezifischer Primer erreicht, die es ermöglichen, nachfolgende Reaktionsschritte an fester Phase (magnetische Beads) durchzuführen. Die LAM-PCR ist derzeit die empfindlichste verfügbare Methode zur Identifizierung unbekannter DNA, die sich in der Nähe bekannter DNA befindet. Kürzlich wurde eine Variante der LAM-PCR entwickelt, die den Restriktionsverdau umgeht und damit den Retrieval-Bias von Integrationsstellen aufhebt und eine umfassende Analyse von Provirus-Lokalisationen im Wirtsgenom ermöglicht. Das folgende Protokoll erklärt Schritt für Schritt die Amplifikation sowohl von 3'- als auch von 5'- Sequenzen, die an den integrierten lentiviralen Vektor angrenzen.

Introduction

Linear-PCR-vermittelte Amplifikation (LAM-PCR) ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von unbekannten flankierenden DNA benachbart zu bekannten DNA beliebigen Ursprungs. Genauer gesagt, LAM-PCR wurde zur viralen Vektor Integrationsstellen zu lokalisieren (IS) innerhalb des Wirtsgenoms ^1,2. Genetische Elemente wie Transposons oder Retroviren integrieren ihr Genom in das Wirtsgenom in einer (halb-) zufälliger Weise ^3-6. In vielen Fällen ist es entscheidend, genau die Position, wo diese Vektoren integriert kennen. LAM-PCR nachgewiesen worden überlegen alternative Techniken wie PCR-vermittelte Ligation ⁷ und seiner Varianten oder inversen ^PCR-8 sein. Die Empfindlichkeit und Robustheit dieses Verfahrens ergibt sich aus der anfänglichen Vorverstärkung der Vektor-Genom Gänge und magnetische Auswahl amplifizierte PCR-Produkte. Wie die genannten alternativen Verfahren beruht LAM-PCR auf der Verwendung von Restriktionsenzymen, die Einführung eines Bias in Abrufkapazität ^9-11. Folglichnur ein Teil des IS-Repertoire (die integrome) in einer Reaktion nachgewiesen werden. Diese Vorspannung wird durch die parallele Analyse einer gegebenen Probe mit optimalen Kombinationen von Restriktionsenzymen ⁹ minimiert. Kürzlich wurde eine Variante der Technik bezeichnet nicht einschränkenden LAM-PCR (nrLAM-PCR) entwickelt worden, die die Verwendung von Restriktionsenzymen umgeht und ermöglicht unvoreingenommene genomweiten Analyse einer Probe in einem einzigen Reaktions ^9,12.

In der Vergangenheit LAM-PCR wurde zur Identifizierung der Verursacher retroviralen IS, die zu Leukämie bei einigen Patienten in der klinischen Gentherapie-Versuche ^13-15. Seitdem LAM-PCR wurde angepasst, um zu identifizieren, ist von anderen Integrationsvektoren (lentiviralen Vektoren, Transposons) sowie Integrationsmuster passiv integrierende Vektoren wie Adeno-assoziierten Vektoren (AAV) oder Integrase-defekt lentiviralen Vektoren (IDLV) identifizieren ^{16 -21.} Anwendungen der LAM-PCR sind weit verbreitet: traditionellely, die Technik ist weit verbreitet, um die klonale Zusammensetzung von Gen-veränderten Zellen bei Patienten, die Gen-Therapie unterzogen haben oder studieren, um die biologische Sicherheit von neuartigen Vektorsysteme mit der Entschlüsselung ihrer Integration ^15,16,22-24 Verhalten zu beurteilen. Kürzlich LAM-PCR aktiviert Bestimmung Spezifität und Off-Target-Aktivität von Designer-Nukleasen durch eine IDLV Trapping-Assay ^25.

Darüber hinaus ermöglicht LAM-PCR, um leicht folgen das Schicksal einer Zelle transduziert im Laufe der Zeit in einem Organismus. Dies erlaubt es, Proto-Onkogene als auch Tumor-Suppressor-Gene zu identifizieren und auch zu Blutbildung oder Krebsstammzellbiologie ^26-28 studieren. Nicht zuletzt, LAM-PCR wurde an T-Zell-Rezeptor-Diversity beim Menschen ²⁹ (unveröffentlichte Daten) zu studieren.

Die Eigenleistung der Technik wird durch die Verknüpfung der Methode, um tiefe Sequenzierungstechnologien, die Charakterisierung von Millionen von unbekannten flankierenden DNA mit Einzel-Nukleotid-r erlauben verstärkteSOLUTION in ganzer Genome. In dem folgenden Protokoll beschreiben wir Schritt für Schritt die Amplifikation und Identifizierung von unbekannten DNA-flankierenden exemplarisch zu identifizieren Lentivirusvektor IST. Oligonukleotide in dem Protokoll verwendet wird, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Heraus DNA oder cDNA von jeder Quelle kann als DNA-Matrize für LAM-PCR und nrLAM-PCR verwendet werden.

Protocol

1. Vorbereitung der Linker-Kassetten (LC)

1. Mischungs 40 ul LC1 Oligonukleotid (Tabelle 1), 40 ul Oligonukleotid LC2 (Tabelle 1, mit der richtigen Restriktionsenzym Hang), 110 &mgr; l Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) und 10 ul 250 mM MgCl _2.
2. Inkubation bei 95 ° C für 5min und ließ die Reaktion abkühlen langsam auf Raumtemperatur. In 300 ul H ₂ O und konzentrieren dsLinker-DNA auf einem Zentrifugation Filter. In 80 ul H ₂ O zu den aliquoten Eluat und 10 ul bereit Linker-Kassette in 0,2 PCR-Röhrchen.

2. Vorverstärkung der Vektor-Genom-Junctions

1. Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
   1. Bestimmen Konzentration der DNA-Proben. Pipette x ul (1-1000 ng für LAM/100-1, 000 ng für nrLAM) von DNA in eine 0,2 ml PCR-Röhrchen. Volumen der DNA sollte in jeder Probe und in der ran gleich seinge von 0,5 bis 25 &mgr;.
   2. Vorbereitung PCR Master Mix, wie in Tabelle 2 beschrieben Mix (50 - x). &mgr; L Mastermix mit jeder DNA-Probe in 0,2 ml PCR-Röhrchen.
2. Preamplify Vektorgenom Kreuzungen mit PCR-Bedingungen in Tabelle 2 veranschaulicht. Nach Abschluss der PCR mit 0,5 ul Taq-Polymerase zu jedem PCR-Röhrchen und erneut PCR-Programm. PCR-Produkte können bei 4 ° C für bis zu 4 Tage oder langfristig bei -20 º C gelagert werden

3. Magnetische Trennung von PCR-Produkt

1. Vorbereitung der Magnetic Beads
   1. Je 20 ul (200 ug) von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen in ein 1,5-ml-Röhrchen und setzen für 1 min auf dem Magnet Partikelabscheider (MPS) bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen.
   2. Röhrchen aus MPS und resuspendieren magnetischen Kügelchen in 40 ul PSB / 0,1% BSA (pH 7,5). Expose MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
   3. Wash Perlen witen 20 ul 3 M LiCl-Lösung (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) aussetzen MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Resuspendieren Perlen in 50 ul 6 M LiCl-Lösung (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
2. Mix gesamten PCR-Reaktion aus Schritt 2.2 mit 50 ul hergestellten magnetischen Kügelchen. Inkubieren auf einem Horizontalschüttler (300 rpm) mindestens 2 h bei Raumtemperatur. Dieser Schritt ermöglicht die Bindung von biotinylierten PCR-Produkt zu beschichteten Kügelchen (DNA-Bead-Komplex) Streptavidin. DNA-Bead-Komplex auf dem Schüttler über Nacht inkubiert und bei 4 ° C für 4 Tage aufbewahrt werden.
3. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min bei Raumtemperatur entfernen Überstand und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 100 ul H ₂ O. Sofort mit Schritt 4 für LAM oder Schritt 5 für nrLAM fortzufahren.

4. LAM-Verfahren

1. Doppelstrang-DNA (dsDNA) Synthese (LAM nur)
   1. Expose DNA-Bead-Komplex aus Schritt 3,3 bis 1 min und dis MPSKartenstand. Hinzufügen 8,25 ul _{H &sub2;} O, 1 &mgr; l 10 × Puffer Hexanukleotid, 0,25 ul dNTPs (10 mM) und 0,5 ul (2 U) Klenow-Polymerase. Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde.
   2. Hinzufügen von 90 &mgr; l H ₂ O und aussetzen MPS für 1 min. Überstand verwerfen und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 100 ul H ₂ O.
2. Beschränkung Digest
   1. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Add 8,5 ul H _{&sub2; O,} 1 ul 10x Restriktionsenzym-Puffer und 0,5 ul Restriktionsenzym inkubieren Reaktion für 1 Stunde. Wiederholen Sie Schritt 4.1.2.
      HINWEIS: Inkubieren Reaktion bei der Temperatur, die vom Hersteller des Restriktionsenzyms empfohlen. Stellen Sie sicher, dass es innerhalb von nicht vorhanden oder nach der Primer-Bindungsstelle für die Vorverstärkung in der DNA von Interesse verwendet Restriktionsstelle. Für die Wahl des geeigneten Restriktionsenzymen / Restriktionsenzym-Kombinationen beziehen sich auf ^neun.
3. Ligation von ds Linker (LK)
   1. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Mit 5 &mgr; l H ₂ O, 1 ul 10x Fastlink-Puffer, 1 ul ATP (10 mM), 2 &mgr; l Linker Kassette aus Schritt 1.2 und 1 ul Fast-Link-DNA-Ligase (2 U / ul). Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Wiederholen Sie Schritt 4.1.2.
4. Denaturierung von Synthesizer-dsDNA
   1. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 5 ul 0,1 N NaOH. Inkubiere 5 min bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler.
   2. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und sammeln vorverstärktes Vektor-Genom-Übergang Überstand in neue 1,5 ml Röhrchen mit. Sofort mit Schritt 6 oder speichern Stand gehen bei -20 ° C

5. NrLAM-Verfahren

1. Ligation von Einzelstrang-Linker (SSLC) (nrLAM nur)
   1. Expose DNA-Bead-Komplex aus Schritt 3.3 MPSfür 1 min und Ablagestand. Add 6,5 ul _{H &sub2;} O, CircLigase 1 ul 10x Reaktionspuffer, 0,5 &mgr; l MnCl ₂ (50 mM), 0,5 ul ATP (1 mM), 1 ul ssLinker Oligonukleotid und 0,5 ul CircLigase (100 U / ul). Inkubieren bei 60 ° C für 1 Stunde.
   2. Hinzufügen von 90 &mgr; l H ₂ O und aussetzen MPS für 1 min. Überstand verwerfen und waschen DNA-Bead-Komplex in 100 ul H ₂ O. Wieder zu MPS für 1 min, Ablagestand und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 10 ul H ₂ O. aussetzen

6. Exponential Amplification ich

1. Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
   1. Pipette 2 ul Template-DNA (aus Schritt 4.4.2 (LAM) oder 5.1.2 (nrLAM)) in ein 0,2 ml PCR-Röhrchen.
   2. Bereiten PCR Master Mix, wie in Tabelle 3 beschrieben. Hinzufügen 48 ul der Master-Mix zu jeder Probe aus Schritt 6.1.1 und verstärken Vektorgenom Gänge durch PCR conditions in Tabelle 3 veranschaulicht. PCR-Produkte bei 4 ° C für bis zu 4 Tage oder langfristig bei -20 º C gelagert werden,

7. Magnetische Trennung von PCR-Produkt

1. Bereiten magnetischen Kügelchen wie in den Schritten 3.1.1 Beispiel - 3.1.3. Resuspendieren Perlen in 20 ul (LAM) oder 50 &mgr; l (für nrLAM) von 6 M LiCl-Lösung (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Mischungs 20 ul (LAM) oder 50 ul (nrLAM) der PCR-Reaktion aus Schritt 6.1.2 mit vorbereiteten magnetischen Kügelchen (Schritt 7.1) und Inkubation auf einem Horizontalschüttler (300 rpm) für 2 h bei Raumtemperatur. DNA-Bead-Komplex auf dem Schüttler über Nacht inkubiert und bei 4 ° C für 4 Tage aufbewahrt werden.
2. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min, entfernen Stand und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 100 ul H ₂ O. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen.
3. Resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 20 ul (LAM) oder 5 ul (nrLAM) 0,1 N NaOH. IncuDebatte für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler, aussetzen MPS für 1 min und sammeln amplifizierte DNA-haltige Überstand in neues 1,5-ml-Tube. Sofort mit Schritt 8.1 oder speichern Stand gehen bei -20 ° C

8. Exponential Amplification II

1. Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
   1. Pipette 2 &mgr; l Matrizen-DNA (aus Stufe 7.3) in 0,2 ml PCR-Röhrchen.
   2. Vorbereitung PCR Master Mix, wie in Tabelle 4 beschrieben. In 48 &mgr; l Mastermix zu jeder Probe aus Schritt 8.1.1 und verstärken Vektorgenom Gänge von PCR-Bedingungen in Tabelle 4 veranschaulicht. PCR-Produkte bei 4 ° C für bis zu 4 gespeichert werden, Tage-oder langfristig bei -20 ° C
2. Zu visualisieren (nr) LAM-PCR-Produkte, Last 10 ul des PCR-Produkts aus Schritt 8.1.2 auf einem 2% Agarosegel. Wenn Banden sichtbar sind, zu analysieren 10 ul der LAM-PCR-Produkt auf hochauflösenden Gel. ACHTUNG: Ethidium Bromid ist mutagen. Arbeiten Sie sehr sorgfältig und immer eine geeignete Schutzhandschuhe.

9. Vorbereitung für die Hochdurchsatz-Sequenzierung

1. Reinigung von (nr) LAM-PCR-Produkte
   1. Mischen Sie 40 ul PCR-Produkt von Schritt 8.1.2 mit 44 ul der Raumtemperatur AMPure XP Magnetic Beads. Inkubiere 5 min bei Raumtemperatur ausgesetzt werden, um MPS für weitere 2 min.
   2. Überstand verwerfen und zweimal waschen mit 200 ul 70% EtOH auf den MPS.
   3. Überstand verwerfen und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 30 ul H ₂ O. 1 min inkubieren und Überstand in frische 0,2 ml-Tube. Bestimmen Konzentration von DNA gereinigt.
2. Fusionprimer PCR-Sequenzierung, um spezifische Adapter hinzufügen.
   1. Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
   2. Pipette x ul (40 ng) von DNA in eine 0,2 ml PCR-Röhrchen. Volumen von DNA sollte in jeder Probe und in dem Bereich von 0,5 bis 25 &mgr; gleich sein.
   3. Bereiten PCR Master Mix, wie in Tabelle 5 beschrieben hinzufügen (50 - x). Ul Master Mix zu jeder Probe aus Schritt 9.2.2 und Sequenzierung einzuführen Adapter (nr) LAM-PCR-Produkte von PCR-Bedingungen in Tabelle 5 PCR-Produkte veranschaulicht. bei 4 ° C für bis zu 4 Tage oder langfristig bei -20 º C gelagert werden
   4. Um Fusionprimer-PCR-Produkte sichtbar Last 10 ul des PCR-Produkts aus Schritt 9.2.3 auf einem 2% Agarosegel. Reinige verbleibenden PCR-Produkt wie in den Schritten 9.1.1 - 9.1.3. Analysieren 1 ul gereinigte PCR-Produkt aus Schritt 9.4 auf einem automatisierten Hochauflösung Elektrophorese-Gerät genau zu quantifizieren, Konzentration und Fragmentgröße von Fusionprimer-PCR-Produkte.

Results

LAM-PCR-Amplifikation resultiert in der Vektor-Genom-Übergänge mit einer definierten Fragmentgröße für jede Kreuzung. Die Größe der einzelnen PCR-Fragmente hängt von der Entfernung zwischen dem Ort der bekannten DNA in das Genom und dem nächsten Restriktionsenzym-Erkennungsstelle. Dies ermöglicht die Visualisierung der Vielfalt der amplifizierten Gänge in analysierten Proben durch Gelelektrophorese, zB. Wenn nur einzelne (monoklonal), mehrere (oligoklonale) oder mehrere (polyklonal) Banden auf dem Gel vorhanden...

Discussion

Die LAM-PCR-Technik ermöglicht die Identifizierung von unbekannten DNA-Sequenzen, die eine bekannte DNA-Region flankieren. Wegen der hohen Empfindlichkeit von Vorverstärkung der Verbindungen mit spezifischen Primern hybridisiert in der bekannten DNA-Sequenz ergeben, ist es möglich, zu verstärken und zu detektieren, auch seltene Kreuzungen auf Einzelzellebene. Gegenteil, in einem polyklonalen Situation LAM-PCR ist in der Lage, Tausende von verschiedenen Verbindungen in einer einzigen Reaktion zu verstärken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA Polymerase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Alternative Taq Polymerasen können verwendet werden
PCR Puffer	Qiagen	201203	Verwendung dieses Puffers wird empfohlen
dNTP-Mixture	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	oder andere dNTPs
Oligonukleotide (Primer)	MWG Biotech		HPLC gereinigte
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0,1 % Gew./Vol. BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7,5	USB Corporation	22637	oder ein anderer Lieferant
EDTA	Applichem	A1103,0250	oder ein anderer Lieferant
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Hexanukleotidmischung	Roche Diagnostics	11277081001
Restriktionsendonuklease	NEB		oder ein anderer Anbieter
Fast-Link DNA-Ligationskit	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	oder ein anderer Anbieter
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	oder ein anderer Anbieter
FSME-Puffer	Amresco	0658	oder ein anderer Anbieter,
Ethidiumbromid	Applichem	A2273,0005	Ethidiumbromid ist mutagen
100 bp DNA-Leiter	Invitrogen	15628-050	oder eine andere DNA-Leiter
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	oder ein anderer Anbieter
Magna-Sep Magnetpulverabscheider	Life Technologies	K158501	für die Verwendung mit 1,5-ml-Röhrchen
, Magna-Sep Magnetpulverseparator	Life Technologies	K158696	für die Verwendung mit 96-Well-Platten
, Amicon Ultra-0,5, Ultracel-30 Membran	Millipore	UFC503096
Midi S	PeqLab	40-1515	oder anderen Elektrophoresesystemen.
TProfessional 96	Biometra	050-551	oder andere Thermocycler für 96-Well-Platten
Orbitalschüttler KS 260 basic	IKA	2980200	oder andere horizontale Schüttler
PCR Softtubes 0,2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	oder andere 0,2 ml PCR Gefäße
1,5 ml Gefäße	Eppendorf	12682	oder andere 1,5 ml Gefäße
Gel-Dokumentationssystem	PeqLab		oder ein anderes Gel-Dokumentationssystem
Nanodrop ND-1000 Spektralphotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 Fertiggel	Elchrom Scientific	3497
Tauchgelelektrophoresegerät SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Elektrophorese-Bioanalysator	Agilent Technologies	G2939AA