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Methodenartikel

Aip1p Dynamics werden von der R256H Mutation in Actin Altered

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DOI:

10.3791/51551

⸱

30. Juli 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Department of Biochemistry, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, University of Iowa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Krankheitsverursachende Mutationen in Aktin-Zytoskelett-Funktion kann zu verändern. Cytoskeletal Dynamik werden durch Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Proteinen unter Verwendung von internen Totalfluoreszenzmikroskopie quantifiziert. Als Beispiel hat die Zytoskelett-Protein, Aip1p, Lokalisierung und Bewegung in Zellen, die das mutierte Aktin-Isoform exprimieren, R256H verändert.

Zusammenfassung

Mutationen in Aktin verursachen eine Reihe von Krankheiten des Menschen durch spezifische molekulare Veränderungen, die oft ändern Zytoskelett-Funktion. In dieser Studie Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Proteinen unter Verwendung interner Total Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie wird verwendet, um Veränderungen im Zytoskelett-Dynamik zu visualisieren und zu quantifizieren. TIRF-Mikroskopie und die Verwendung von fluoreszierenden Markierungen ermöglicht auch eine Quantifizierung der Änderungen Zytoskeletts durch Mutationen in Aktin verursacht. Unter Verwendung dieser Technik Quantifizierung der Zytoskelett-Funktion in lebenden Zellen wertvoll ergänzt in vitro-Studien der Proteinfunktion. Als Beispiel wurden Missense-Mutationen, die die Aktin-Rest R256 in drei menschlichen Actin-Isoformen hindeutet diese Aminosäure eine wichtige Rolle in regulatorischen Wechselwirkungen identifiziert. Die Wirkungen von Aktin R256H-Mutation auf Zytoskelett Bewegungen wurden unter Verwendung des Hefe-Modell untersucht. Das Protein, AIP1, die bekannt ist, Cofilin in Aktin Depolymerisation zu unterstützen, warmit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert am N-Terminus und in vivo unter Verwendung von TIRF-Mikroskopie verfolgt. Die Rate der Aip1p Bewegung sowohl in Wildtyp-und Mutanten-Stämme wurde quantifiziert. In Zellen R256H-Mutante Aktin exprimieren, ist Aip1p Bewegung eingeschränkt und die Geschwindigkeit der Bewegung ist fast die Hälfte der Geschwindigkeit gemessen in Wildtyp-Zellen (0,88 ± 0,30 um / s in R256H-Zellen im Vergleich zu 1,60 ± 0,42 um / s in Wildtyp-Zellen, S. <0,005).

Einleitung

Aktin ist der Hauptprotein, das das Zellskelett und beteiligt sich an kritische zelluläre Prozesse einschließlich Zellteilung, Organellen Bewegung, Zellbewegung, Kontraktion und Signalisierung. Im Laufe des letzten Jahrzehnts haben krankheitsverursachende Mutationen in Aktin in jeder der sechs menschlichen Actin-Isoformen, die zu einer Reihe von Erkrankungen entdeckt worden, von Myopathien Koronararterienerkrankung 1-7. Die Prozesse, durch die Aktin Mutationen führen zu Krankheit weiter erläutert. Die Hefe-Modell bleibt der Goldstandard, um die biochemischen Auswirkungen von Mutationen auf die Aktin-Funktion aufgrund der Vorteile des Binnen wesentliche Aktin-Isoform, genetische Lenkbarkeit und hohe Erhaltung der Aktin-Sequenz und Funktion zu untersuchen. Studien zeigen, dass einzelne Aktin-Mutationen führen zu spezifischen molekularen Funktionsstörungen mit dominant negative Effekte 8. Zum Beispiel, Taubheit verursachenden Mutationen in γ-Nicht-Muskel-Aktin, die die Lys-118-Rest beeinflussen verändern Regulierung durchdas Aktin-bindende Protein Arp2 / 3 9. Studien häufig in vitro-Analysen beschäftigen Protein-Protein-Interaktionen. Untersuchungen über die Wirkung der Mutationen auf Aktin Zellbiologie und insbesondere Aktin-Bindeproteinlokalisierung in der Zelle begrenzt.

Studien der Hefe Zytoskeletts in vivo konventionell verlassen sich auf Bilder von fixierten Zellen von einem invertierten Fluoreszenzmikroskop 10. Diese Experimente geliefert grundlegende Daten über die Morphologie des Actin-Cytoskeletts. Untersuchungen haben seit dreidimensionalen konfokalen Abbildungs ​​eingebaut, um die komplexen Zytoskelett-Netzwerk 11, 12 sichtbar. Dieses bildgebende ermöglicht die Quantifizierung der Fülle und der relativen Lage der Aktin-Filamente und Patches. Dünnelektronentomographie hat zu Bild verwendet wurde die Morphologie der dichten Fadennetze relativ zu erhalten subzellulärer Strukturen 13. Crowded zellulären sSchritte mit einem kleinen Querschnitt kann in feinen Details mit dieser Technik untersucht werden. Imaging-Studien haben lebende Zellen mit Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie erweitert. Als Bleich Foto-und Hintergrundfluoreszenz moderiert werden, ermöglicht Zeitraffer-Imaging Untersuchungen der Dynamik der Proteine ​​des Zytoskeletts und der Reaktion auf Umweltbedingungen 11, 14. Getrennt davon wurde die Visualisierung der Dynamik von Aktin-Filamenten in vitro durch die Einführung von Total-Innenreflexionsfluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie schoben. Im Vergleich zu Weitfeld-Mikroskopie, TIRF hat den Vorteil der verringerten Hintergrundfluoreszenz und verbesserte Kontrast zu einzelnen Fäden 15, 16 zu überwachen. Mit diesen Eigenschaften ist TIRFM Zellbiologen angepasst worden, um Zellstrukturen an der Plasmamembran 17, 18 zu überwachen. Cellular Ereignisse, einschließlich der Änderungen im Zytoskelett, kannEchtzeit mit niedrigen Phototoxizität, maximaler Kontrast und minimaler Hintergrundfluoreszenz 19 visualisiert werden.

Um die Wirkung der Mutationen auf die Aktin-Bewegung, Lokalisierung und Umsatz von Zytoskelett-Proteine ​​in der Zelle, TIRF-Mikroskopie und Proteinmarkierungs besseren Verständnis verwendet. Hierin sind Verfahren, um die Auswirkungen einer klinisch relevanten Mutation in Aktin auf Zytoskeletts in Saccharomyces cerevisiae untersucht werden beschrieben. Insbesondere ist die Lokalisierung und Bewegung des Aktin-bindendes Protein, Aip1p wurde visualisiert und in Zellen die R256H-Mutation in Actin exprimieren quantifiziert. Diese Techniken ergänzen biochemischen in vitro Studien und ermöglichen ein besseres Verständnis der Protein-Interaktionen und Funktionen.

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Protokoll

1. Klonierung in das Plasmid PB1996

  1. Gestalten und bestellen DNA-Primer von einer Oligonukleotid-Produktionsgesellschaft, die die Zielsequenz flankieren und mit einzigartigen Restriktionsstellen in der ausgewählten Eltern Plasmid. HINWEIS: In diesem Fall Primer wurden entworfen, um die 400 Basenpaare am 5'-Ende des AIP1 Sequenz zu amplifizieren. Die XhoI Restriktionsstelle wurde etwa 20 bp vor dem AIP1 Sequenz in die Primer eingebaut und XmaI enthalten war etwa 20 bp nach dem Ziel AIP1 Folge. Das für die Klonierung verwendete Plasmid war PB1996, die eine 3XGFP Tag für Fluoreszenz, eine URA-Gen für Hefe-Stamm Auswahl und ein Ampicillin-Resistenz-Gen für bakterielle Selektion enthalten.
  2. Reinige die genomische DNA aus einem Hefe-Ura haploiden Stamm. Hinweis: Lesen Sie für ein Diagramm der Abbildung 1 Klonens.
  3. Führen Sie ein Standard-PCR-Reaktion unter Verwendung der beiden Primer und die Hefe genomische DNA, um die Aip1p Gen mit den Restriktionsstellen entweder en verstärkend. Digest das PCR-Produkt und der PB1996 Plasmid mit den Restriktionsenzymen in getrennten Reaktionen pro Hersteller empfohlenen Protokolle. In diesem Fall XmaI und XhoI wurden mit dem zugehörigen Puffer bei 37 ° C für 1 h verwendet.
  4. Ausführen eines 0,8% Agarose-Gel-Elektrophorese, um die verdauten DNA-Fragmente zu trennen. In einem gut, legen Sie eine geringe DNA-Leiter und Masse, in separaten Brunnen, laden die ganze Reaktion von jedem Verdauung. Die Elektrophorese bei 100 Volt für etwa 1 h, bis die Farbstofffront in der Nähe des Ende des Gels. Visualisieren Sie das Gel unter UV-Licht und reinigen Sie das Segment, das an das Protein Segment entspricht und die geschnittene Plasmid.
  5. Ligation der verdauten AIP1 Segment und PB1996 Plasmid. Transformation des Produkts in DH5 &agr;-Zellen unter Verwendung von Protokollen des Herstellers (10 ul DNA mit 100 ul Zellen 30 min auf Eis, Hitzeschock bei 42 ° C für 2 min, wachsen in SOC-Medium für 2 h bei 37 ° C) und die Platte auf Kulturplatten dass das Antibiotikum zur Selektion enthalten, in diesem Fall LB +Amp-Platten. Wählen Sie wachsen und eine Kolonie in Flüssigkultur. Reinige den neu gestalteten Plasmid.

2. Mutant Hefestamm-Generation

  1. Verwenden Sie einen haploiden Hefestamm, in der die Aktin-Allel wurde gestrichen, um eine mutierte Hefestamm bauen. Hinweis: In diesem Fall ist die Elternstamm war ein großzügiges Geschenk von Dr. Peter Rubenstein (University of Iowa) und der Bau wurde von 20 Koch et al Dieser Stamm fehlt die chromosomale Actin-Gens und enthält ein Plasmid, das Wildtyp-Hefe kodiert. Aktin und Uracil.
  2. Verwenden Sie die pRS Plasmid, das Wildtyp-Hefe-Aktin mit einem Trp + Auswahl als Basis für die Mutagenese Plasmid-21.
  3. Führen gerichtete Mutagenese auf der pRS Plasmid, um die Missense-Mutation in Aktin-Ingenieur.
    1. Für die R256H Mutation in Aktin, machen den Primer 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3', die Arg 256 bis 256 Seine ändern. Führen Sie einen Standard-MutagenesePCR Reaktion mit dem Plasmid aus Schritt 2.2.
    2. Transformieren Sie die Mutante Aktin Plasmid aus der PCR in DH5a Zellen. Isolieren der Plasmid-DNA zu sequenzieren und die Aktin-Gen, um die Mutation zu überprüfen.
  4. Transformieren Sie das Plasmid kodiert mutierten Hefe-Aktin in den haploiden Hefestamm aus Schritt 2.1.
  5. Kultur die transformierten Zellen auf Trp-Platten für die Hefe, die den Trp + enthält mutierte Hefe Aktin Plasmid auswählen.
  6. Wählen Sie für die Zellen ohne den ursprünglichen Wildtyp-Plasmid, das Aktin und Uracil (in 2.1 beschrieben) durch Unter Kultivierung von Zellen aus den Trp-Platten auf Platten, die 5-Fluororotsäure (5-FOA) enthalten kodiert. 5-FOA wird der giftige Form, 5-flurouracil umgewandelt, in Yeas Stämme die funktionelle URA3-Gen exprimiert. Die Zellen, die nach der Auswahl schrittweise wachsen wird nur der Mutante Aktin Plasmid enthalten.
  7. Ein Reinigen der Plasmid-DNA aus den neuen Hefestamm. Sequenz, die das Plasmid, um sicherzustellen, das mutierte Gen Aktin vorhanden ist. Verwenden Sie diese strainieren in weiteren Studien. Dieser Vorgang ist in Fig. 2 schematisch dargestellt.

3. Umwandlung der Plasmid in Hefezellen

  1. Verdauen die Aip1p-GFP-Plasmid mit einem Restriktionsenzym, die Integration in den Hefe-Chromosom zu ermöglichen. HINWEIS: Die Restriktionsstelle muss außerhalb des Sequenzblock, der die Fluoreszenz-Tag, das Gen von Interesse und Selektionsmarker enthält. In diesem Fall verwenden 1 ul Restriktionsenzym HpaI mit 8 ul DNA und 1 &mgr; l des beigefügten 10x-Puffer für 1 h bei 37 ° C.
  2. Kultur S. cerevisiae-Zellen (aus Stufe 2.5), die nicht Uracil (Ura-Stamm) über Nacht in 5 ml YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Dextrose) auf einem Rad bei 30 º C zu synthetisieren Spin down 1 ml der Zellen für 5 min bei 1.000 x g.
  3. Machen PLATE Mischung. Machen 10XTE durch Zugabe von 5 ml 1 M Tris pH 7,5 und 2 ml von 250 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 43 ml ddH 2 O. In 0.204 G Lithiumacetat zu 20 ml 1XTE, dann 8 g Polyethylenglykol (PEG) (Molekulargewicht ~ 3300) und sterilfiltriert.
  4. Dekantieren des Überstandes von den Zellen, die in Schritt 3.2 gesponnen und Resuspendieren der Zellen in der verbleibenden Flüssigkeit. Auf die suspendierten Zellen, add 2 ul 10 mg / ml Lachshoden-DNA-Träger. Werden 10 &mgr; l der verdauten Plasmid-DNA aus Schritt 3.1 und Wirbel. In 0,5 ml PLATE und Wirbel. In 20 ul 1 M DTT und Wirbel.
  5. Inkubieren der Mischung für 6-8 Stunden bei 25 ° C. Hitzeschock der Zellen in einem Wasserbad bei 42 ° C für 10 min. Platte 100 ul der Zellen vom Boden des Mikrozentrifugenröhrchens, wo sie sich auf eine-Ura Platte abgesetzt haben. Inkubieren bei 30 ° C für 2-3 Tage oder bis Kolonien bilden.
  6. Wählen Sie einzelne Kolonien und Streifen heraus auf eine Platte-Ura. ANMERKUNG: Diese Zellen enthalten, die das Plasmid mit dem AIP1-GFP und Ura-Gen in das Chromosom integriert, was für das Wachstum. Diese Zellen werden dann in Mikroskopie verwendet werdenpy.

4. Visualisierung der Aip1p Protein Bewegung Mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

  1. Wachsen einer Kultur von Hefe-Zellen mit dem einge Aip1p-GFP in YPD über Nacht auf einem Rad bei 30 ° C. Subculture 1 ml der Übernachtkultur in 9 ml-Ura-Medien. Wachsen die Zellen für weitere 3-4 Stunden auf einem Schüttler bei 30 ° C, um sicherzustellen, dass sie in log-Wachstumsphase sind.
  2. In 3 ul der Zellen auf einen Glasobjektträger und fügen Sie ein Deckglas. Lassen Sie die Zellen auf dem Objektträger für 5 min zu begleichen. Legen Sie die Folie in der Klammer der Tischplatte.
  3. Beachten Sie die Aip1p-GFP-Protein mit einem Totalreflexion (TIRF)-Mikroskop (488 nm) mit einem Öl-Immersion 100X TIRF Ziel und eine digitale CCD-Kamera. Mit Slidebook 5.0 Software, Bilder für 20 Sekunden zu erhalten, mit einer Geschwindigkeit von 5 Bildern / s (Individuelle Rahmen der aufgenommenen Bilder werden in 2A vorgelegt).
    1. Um auf der c konzentrierenEllen, offene Slidebook 5.0-Software und klicken Sie auf den Fokus-Fenster in der Symbolleiste, um die Schwerpunkte steuert den Zugriff. Wählen Sie die Registerkarte Bereich und wählen Sie den 100X-TIRF Ziel. Schalten Sie die Lampe auf und schieben Sie die Lampenleiste, um 15%. Ändern Sie die Einstellung, um Bin 2 x 2. Filter ändern zu Hellfeld.
    2. Auf dem Mikroskop, verwenden Sie die Feinfokus Wahl, um die Zellen in den Fokus zu bringen, wie auf dem Computerbildschirm zu sehen.
    3. Mit den Kontrollen im Fokus Fenster, schalten Sie die Lampe aus, ändern Sie die Filter, um zu leben, und klicken Sie auf die Schaltfläche TIRFM.
    4. Auf der TIRFM Illuminator auf die rechte Seite Port des Mikroskops befestigt, drehen Sie die Laseremission auf On.
    5. Wählen Sie die Registerkarte-Stream im Fokus Fenster, das Kontrollkästchen neben der Aufnahme zu beginnen, und klicken Sie dann auf Hellfeld-Taste.
    6. Auf der TIRFM Illuminator, drehen Sie den Mikrometer, den Einfallswinkel des Lasers anpassen. Dies wird verwendet, um die Fluoreszenzemission von der AIP1-GFP Foci zu optimieren und minimieren die Hintergrundfluoreszenz von derZellen und Rutsche.
    7. Wenn das gewünschte Bild angezeigt wird, drücken Sie Start. Nach 20 Sekunden, drücken Sie Stop. Speichern Sie die Bilder. Unter der Registerkarte Datei auf der Hauptmenüleiste Slide Speichern unter, und geben Sie den Speicherort der Datei und den Namen.
  4. Verwenden Sie ImageJ-Software, um die Bilder zu analysieren. Verwenden Sie den Makro-Plugin "Manuelle Tracker", die Bewegung und die Geschwindigkeit der Fluoreszenz Aip1p Herde zu verfolgen. Ändern Sie den Parameter Zeitintervall auf 0,2 sek.
    1. Mit dem Add Track-Auswahl, wählen und verfolgen eine individuelle fluoreszierende Protein durch vier Minuten vor acht Verbindungsrahmen. Verwenden Sie den Befehl Ende Spur und die Geschwindigkeit der Proteinbewegung zwischen den einzelnen Bildern wird in einem Ergebnisfenster angezeigt.
    2. Bestimmen Sie die Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den einzelnen Bildern mit einer Microsoft Excel-Tabelle. Verwenden der Werte, um die mittlere Geschwindigkeit der Bewegung Aip1p für jede Zelllinie von Interesse zu berechnen. HINWEIS: Ein Streudiagramm der Rate der Aip1p Bewegung und den durchschnittlichen, nicht-lineare Geschwindigkeit in Figu gezeigtre 2B.

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Ergebnisse

Verfahren zur Abbildung der Dynamik von Zytoskelett-Proteine ​​in der Zelle präsentiert wird. Die Aktin-bindende Protein, Aip1p wurde mit GFP markiert. Der Entwurf für das Plasmid, das das markierte Produkt kodiert, ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Plasmid wurde dann in den Hefe-Zellen transformiert. Expression des fluoreszenzmarkierten Aip1p erlaubt die Visualisierung des Verhaltens Protein in der Zelle. Aip1p lokalisiert in der Regel an Aktin-Patches an den Standorten der Endozytose 22. ...

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Diskussion

Eine wirksame Strategie, um die Dynamik des Zytoskeletts und der Nutzen in Untersuchungen auf pathogene Mutationen visualisieren hier beschrieben wurde. Erweiterte bildgebenden Verfahren haben neue Möglichkeiten, um die intrazelluläre Bewegung von Proteinen in der Nähe der Zellmembran verstehen erstellt. Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) ist eine empfindliche Methode für funktionelle Untersuchungen in lebenden Zellen. TIRF verwendet einen abgewinkelten Anregungslaser, ein evaneszentes Feld aufgrund der Diffe...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken Peter Rubenstein für nützliche Diskussion und technische Beratung und David Pellman für die ursprüngliche PB1996-Klon. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der March of Dimes und Finanzierung von der Fahrt für die Kinder unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agaroserpi9012-36-6
Bromphenol BlueAmresco115-39-9
BSANEBB9001S
Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis KitUSB Corporation4166059
CutSmart BufferNEBB7204S
DNA, einzelsträngig aus LachshodenSigma9007-49-2
EDTA pH 7,4Sigma93302
EthidiumbromidInvitrogen15585-011Warnung! Schädliche Reizungen
-/Bakterien-DNA-KitSymo ResearchD6005
HpaINEBR0105S
LithiumacetatAlfaAesar6108-17-4
Low DNA Mass LadderInvitrogen10068-013
NE Buffer #4NEBB7004S
Platinum PCR SuperMix High FidelityInvitrogen12532-016
Miniprep KitQiagen27106Jedes Kit funktioniert
Quick Ligation KitNEBM2200S
NatriumazidSigma26628-22-8
PBSInvitrogen10010-023
PEGAmresco25322-68-3
Tris Base Ultrapurerpi77-86-1
Wizard SV Gel und PCR Clean-Up SystemPromega06.01.2015
XhoINEBR0146S
XmaINEBR0180S
YPD-MedienLabExpress3011-URA
MedienLabExpress3010
PCR-GerätInvitrogen4359659Jedes PCR-Gerät funktioniert
TIRF MikroskopOlympus IX81
Hamamatsu ORCA-R KameraHamamatsu
Pilz

Referenzen

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Schlagwörter

Aktin Mutation R256HTIRF MikroskopieMarkierung mit fluoreszierenden ProteinenZytoskelett DynamikHefemodellsystemAktin DepolymerisationQuantifizierung von ProteinbewegungenLive Cell ImagingGFP Tracking
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