Abstract
É crucial para identificar a infecção por citomegalovírus (CMV) no trato gastrointestinal (TGI) de pacientes imunossuprimidos, dada a sua maior risco de desenvolver infecção grave. Muitos métodos laboratoriais para a detecção de infecção por CMV têm sido desenvolvidos, incluindo sorologia, a cultura viral, e métodos moleculares. Muitas vezes, esses métodos refletem o acometimento sistêmico com CMV e não identificam especificamente o envolvimento do tecido local. Portanto, a detecção de infecção por CMV no tracto GI é frequentemente feito por histologia tradicional de tecidos de biopsia. Hematoxilina e eosina (H & E) em conjunto com a coloração imuno-histoquímica (IHQ) mantiveram-se os principais pilares de examinar essas biópsias. H & E e IHC, por vezes, resultar em atípicos (ambíguos) padrões de coloração, tornando difícil interpretação. Foi mostrado que a polimerase de reacção em cadeia quantitativa (qPCR) por CMV pode ser realizada com sucesso em, tecidos de biopsia (FFPE) em parafina e fixado em formalina para muitoalta sensibilidade e especificidade. O objetivo deste protocolo é para demonstrar como realizar testes de qPCR para a detecção de CMV no tecido biópsia FFPE em um ambiente de laboratório clínico. Este método é susceptível de ser de grande benefício para o paciente, em caso de coloração equívoca para CMV em biópsias GI.
Introduction
Interpretação da infecção por citomegalovírus (CMV) em amostras clínicas é criticamente importante. O CMV é um membro da subfamília Betaherpesvirinae de herpesvírus. Semelhante a outros vírus de herpes, CMV tem a capacidade de estabelecer infecção persistente ou latente caracterizada por uma falta de replicação viral activa 1. A reativação do vírus pode ocorrer durante momentos de estresse ou outra imunossupressão, levando a replicação viral activa caracterizada pela liberação virion, que pode ser acompanhada de manifestações da doença 2-4. Gastrointestinal (GI) os sintomas da doença CMV freqüentemente incluem dor abdominal e / ou fezes com sangue um.
O diagnóstico de CMV gastroenterite por histologia utiliza hematoxilina e eosina (H & E) para identificar CMV inclusões virais. Nos casos em que a suspeita clínica é alta ainda são observados sem inclusões óbvias, imuno-histoquímica (IHQ) é freqüentemente usado como um método de ensaio adjunto. No entanto, IHCtambém pode ser prejudicada pela não-clássicas surgem padrões raros de coloração celular (duvidosos), tornando difícil interpretação (Figura 2) 5. Buscou-se utilizar DNA extraído de fixados em formalina e incluído em parafina (FFPE) tecidos de biópsia GI e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para detectar CMV em biópsias IG. Esta técnica tem mostrado ser útil na detecção de CMV em biópsias GI, e é particularmente útil em casos duvidosos IHC coloração 5,6. Além disso, qPCR também tem sido demonstrado que se correlacionam bem com os dados de teste de CMV clínica adicional, quando ele está disponível 6. Uso de qPCR na detecção de CMV pode levar a um diagnóstico precoce e tratamento nos casos em que a suspeita clínica para CMV é alta, mas H & E e CMV IHC são negativos.
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Protocol
Com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional, foi realizada uma pesquisa no banco de dados do laboratório de eletrônica para identificar fixadas em formalina e incluído em parafina (FFPE) blocos que representam casos de infecção pelo citomegalovírus (CMV) em gastrintestinal (GI) biópsias diagnosticados por histopatologia (hematoxilina e eosina (H & E) e / ou imuno-histoquímica (IHQ)).
1. Processamento de tecidos de biopsia de tecido FFPE GI
- Colete FFPE GI blocos de tecido para biópsia citomegalovírus (CMV) polimerase quantitativa reação em cadeia (qPCR). Estes blocos são armazenados à temperatura ambiente.
- Tubos pré-label 1,7 ml de microcentrífuga com número de identificação único do bloco.
- Trave o volante micrótomo.
- Assente o bloco de tecido para o prendedor de cassete.
- Usando uma lâmina utilizada fresca, alinhar o bloco para o ângulo de faca no micrótomo.
- Ajuste o micrótomo para cortar 10 mm de espessura.
- Desbloquear ªe volante e avanço do bloco na direção da lâmina.
- Corte 5 seções do bloco em 10 mM intervalos de espessura, permitindo que cada corte para rolar em um rolo de tecido. Certifique-se de que cada um pergaminho contém uma representação adequada dos tecidos de biópsia desejados.
- Trave o volante micrótomo.
- Com uma pinça, coloque todos os 5 pergaminhos de tecido para dentro do tubo de centrífuga de pré-rotulados, tendo o cuidado de apenas manipular a rolagem pela parafina, a fim de reduzir o potencial de contaminação cruzada. Encaixe a tampa no tubo e colocá-lo de volta na prateleira.
- Retire o bloco de tecido a partir do micrótomo.
- Retire e deite fora a lâmina.
- Descontaminar todas as superfícies ou instrumentos que possam ter entrado em contato com o tecido anterior.
- Coloque uma lâmina não utilizado fresco no suporte da faca.
- Repita os passos 1,4-1,14 para cada bloco adicional para ser processado. Os tubos de microcentrífuga contendo os rolos de tecido podem ser armazenadas à temperatura ambiente até que o time da extração de DNA.
2. Extração de DNA a partir de Scrolls de FFPE GI biópsia de tecido
NOTA: Este protocolo é uma adaptação da bula do tecido kit FFPE DNA extração (ATENÇÃO: consulte a Ficha de Segurança (MSDS)).
- Adicione 1 ml de xileno (ATENÇÃO: Consulte o MSDS) para cada tubo de microcentrífuga amostra. Fechar a tampa e vortex vigorosamente durante 10 sec.
- Prossiga com a extração de DNA como descrito especificamente na inserção do produto do fabricante com as seguintes modificações.
- Primeiro adicione 6 mL do controle interno (CI) para cada tubo de microcentrífuga.
- Seguindo o ATL / proteinase K incubação de lise a 56 ° C durante 1 hora, incubar a 99 ° C durante 30 minutos, em vez de 90 ° C durante 1 hora.
- Durante o passo final de eluição de ADN, aberto com cuidado a tampa da coluna de purificação de ADN e aplicar 50 ul de ADNase / água livre de ARNase destilada no centro da membrana, em vez de da-manhãr ATE.
NOTA: Consulte a bula para o armazenamento e preparação de reagentes adequados. ADN deve ser extraído a partir de todos os cinco rolos de FFPE. Executar todos os passos de centrifugação à temperatura ambiente (15-25 ° C).
3. QPCR para CMV
- Polymerase Chain Reaction (PCR) Procedimento
- Gerar uma planilha do Excel PCR para o CMV ensaio prazo. Esta planilha Excel calcula a quantidade total de cada reagente necessário para tornar-se o mix principal com Mg. Multiplica-se a quantidade de cada reagente necessária por amostra (listados abaixo) vezes o número de amostras e controlos mais um (para compensar as perdas devido a pipetagem).
- Incluir os seguintes reagentes em cada reação de PCR, no montante indicado:
Reagente0; Quantidade por Amostra
Master mix CMV LC frasco de 12,5 mL
Mg solução amarelo frasco de 2,5 mL
O volume total de 15,0 uL
- Incluir os seguintes reagentes em cada reação de PCR, no montante indicado:
- Incluir em cada ensaio, execute uma água ou nenhum controle de destino (NTC), controle negativo, controle positivo baixo, um controle positivo alto, e quer QS3 ou QS4, e todas as amostras dos pacientes. Os capilares devem ser criados por esta ordem.
- Obter o bloco específico de arrefecimento para o equipamento de PCR em tempo real que está guardado a 4 ° C. Colocar os tubos capilares apropriadas do bloco de arrefecimento. Não toque na superfície dos tubos capilares. Sempre use luvas ao manusear os capilares.
- Configure todas as reações em cadeia da polimerase em uma capa limpa não contaminada com amplificação produçãots.
- Remover o número correto de frascos mestre do kit de PCR para testar todas as amostras dos pacientes, mais 5 controles. Deixe os frascos mestre, solução Mg e PCR degelo água grau no bloco de resfriamento. Cada frasco mestre contém reagentes suficientes para 12 ensaios.
- Suavemente vortex os frascos de mestrado e rápida spin-los na centrífuga à velocidade máxima.
- Combinar o conteúdo de cada recipiente principal para um frasco, e suavemente vortex novamente.
- Combine a mistura principal e solução de Mg nas quantidades indicadas na planilha de PCR em um único tubo de microcentrífuga estéril.
- Misturar suavemente e alíquota de 15 ul de mistura principal com Mg em cada tubo capilar, com excepção do capilar na posição 5, que é o padrão para a quantificação (QS).
- Mova o bloco de arrefecimento, contendo os tubos capilares e master mix com Mg da capa limpa para um capuz processamento.
- Adicione 2 mL de controlo interno (CI) para os restantes 30 mL de mestremisturar com Mg. Misture delicadamente e alíquota de 15 mL para o capilar na posição 5 (posição para o QS).
- Pipetar 10 ml de água, controle de ADN, ou o ADN da amostra no tubo capilar apropriado. Tapar os tubos capilares usando a ferramenta de nivelamento.
- Tome arrefecimento do bloco / amostras para o tempo real instrumento de PCR.
- Gerar uma planilha do Excel PCR para o CMV ensaio prazo. Esta planilha Excel calcula a quantidade total de cada reagente necessário para tornar-se o mix principal com Mg. Multiplica-se a quantidade de cada reagente necessária por amostra (listados abaixo) vezes o número de amostras e controlos mais um (para compensar as perdas devido a pipetagem).
- Programar o tempo real do instrumento de PCR (ver Tabela 1)
- Amplificação e Detecção executada em tempo real o instrumento de PCR
- Efetue logon no computador
- Dê um duplo clique sobre o ícone do instrumento e fazer login no software.
- Ligue o tempo real instrumento de PCR
- Clique em "CMV / EBV" a partir da tela da frente.
- Siga as instruções do assistente de macro.
- Marque a caixa para executar um auto-teste, quando solicitado pelo software. Um auto-teste deve ser realizado uma vez a cada dia o instrumento estiver em uso.
- Nomeie o prazo.
- Ajuste a contagem de amostra localizada na ABL superiort canto da página para a soma de controles e pacientes incluídos no Executar e digite o número de cada amostra de identificação.
- Clique na aba "Abs Quant".
- Em "Tipo de amostra", atribuir o tipo de amostra adequado para o padrão.
- Digite as concentrações esperadas para o padrão de quantificação (QS).
- Retire os tubos capilares a partir do bloco de arrefecimento e colocá-los na posição correspondente no carrossel (arrefecimento do bloco de amostra # 1 deve ser colocado na posição # 1 no carrossel, etc.)
- Coloque o carrossel em centrífuga e começar a pressionar o instrumento.
- Abra centrífuga e remover o carrossel.
- Coloque o carrossel para o instrumento em tempo real, PCR. Feche a tampa.
- Pressione o botão "Start Run".
- A real-time PCR instrumento irá verificar cada posição para uma amostra. Não se afaste do instrumento até que essa verificação tenha sido concluída, especialmente se um dos capilares não é no carrossel. O instrumento vai notar isso e perguntar se a corrida é para ser continuada. Responda sim antes de sair.
- Uma vez que a corrida é completa, feche o relatório que foi gerado.
- Clique em "Absolute quantificação".
- Clique na seta ao lado de Cor de Compensação.
- Clique em "Selecionar cor de Compensação" a partir da caixa drop-down.
- Escolha o arquivo de compensação de cor mais atual para aplicar a fuga.
- Clique em OK quando a caixa aparece.
- Clique na seta por curva padrão.
- Selecione "uso externo" a partir do menu drop-down.
- Selecione o arquivo de curva padrão externo mais atual e clique em OK.
- Olhe para cada curva no menu Absolute Quantificação para garantir que as curvas estão presentes e não linha reta, se uma concentração é atribuída. A quantificação absoluta para o 705/Back 530 é analisado automaticamente.
- Qucontrole ality
- Gerar uma nova curva padrão sempre que um número novo lote de reagentes é recebido, ou a cada seis meses, o que é mais freqüente.
- Adicionar 10 ml de cada uma das normas para a mistura principal com Mg. Considere as normas incluídas no kit de DNA previamente extraído.
- Adicionar 1 ml de controlo interno para cada padrão para a mistura principal com Mg utilizados em gerar a curva padrão, a fim de assegurar uma quantificação precisa. Não adicione IC para a mistura principal com Mg para o modelo de controle n º (NTC).
- Prepare um NTC e três repetições de quantificação Normas QS 4, 3, 2, 1, e uma diluição de 1:10 de QS4 para a corrida para gerar a curva padrão, totalizando em 16 pontos de dados.
- Selecione "idêntico" no menu drop-down para os padrões repetidos
- Escolha canal 530/back nenhum e ligar compensação de cor quando se analisa o prazo,
- Em "Curva padrão (In Run)", selecione "salvar como exexterno "eo nome da curva. Digite o comentário "aplicado como curva padrão" ao salvar.
- Gráfico dos resultados. O coeficiente de linearidade resultante deve ser ≥ 0,81.
- Para corridas diárias, incluir uma cópia do QS3 ou QS4 como um controle na corrida. A curva padrão externa atual podem ser importados para a corrida durante a fase de análise.
- Executar controles: sem controle de DNA, controle negativo, os baixos e os controles positivos altos. Carga viral esperada é determinada e ajustada para cada fornecedor e número de lote.
- Adicionar um IC para cada amostra e controle durante a extração de DNA.
- Se qualquer um dos controles cair fora da faixa, registrar os resultados inaceitáveis e remeter o ensaio para a solução de problemas.
- Frequência dos controlos
- Inclua em cada corrida: a NTC, baixo, alto positivo e padrão de controle positivo negativo.
Nota: os limites aceitáveis para controles. Sem picos deve ser observard para a nenhum modelo (NTC) e controles negativos. Picos deve estar presente no canal 530 e cargas virais esperados são determinadas e ajustadas para cada vendedor e número de lote para os controlos positivos de baixa e alta.
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Representative Results
Um total de 228 blocos de tecido foram testadas por reação de polimerase em cadeia quantitativa (qPCR), que foi composta por 91 citomegalovírus (CMV) casos positivos com base na histologia e imuno-histoquímica positiva (IHC), 18 com equívoco CMV IHC, e 79 controles negativos. Tal como ilustrado na Figura 2, os casos positivos que demonstraram CMV CMV inclusões típicas virais (A) e / ou coloração IHC positivo (B). Casos duvidosos teria demonstrado, não-clássicas surgem padrões de coloração raros (C), enquanto os controles negativos teria mostrado nenhuma histologia suspeita ou IHC coloração 5.
De 91 biópsias positivas para CMV por histopatologia, 88 foram positivas por qPCR (Tabela 2). Com uma verdadeira definição positiva com a histologia tradicional, ou seja, inclusões virais típicas CMV e / ou típico CMV IHC, estes dados resultou em uma sensibilidade de 96,7%.
Quatorze dos 18 (78%) biópsias com equívoco coloração CMV IHC testou positivo para CMV por qPCR 5. Entre esses 18 casos duvidosos, onze tiveram biópsias adicionais tomadas no mesmo dia em que foram positivos para CMV histopatológico. Entre essas 14 amostras positivas qPCR, 10 tiveram biópsias tomado o mesmo dia em que foram positivos para CMV em histopatologia. Das 18 biópsias duvidosos testados, 11 tiveram a informação clínica adicional em relação ao teste CMV em outras amostras apresentadas no ou nos 7 dias da época da biópsia foi tomada. Entre estes 11 casos, 8 (73%) deram positivo para CMV por qPCR. Destes 11 biópsias, 5 (45%) deram positivo por qPCR com amostras adicionais CMV positivas; 3 (27%) testaram positive por qPCR sem espécimes CMV positivas; 3 (27%) apresentaram resultados negativos por qPCR com amostras adicionais CMV negativos.
Além desses estudos mencionados acima, era de interesse para determinar se a obtenção de níveis adicionais hematoxilina e eosina (H & E) seria benéfica em casos onde não inclusões virais são vistos em H & E, inicialmente, e CMV IHC é equívoca. Portanto, H & E níveis 5 vezes para cada um dos 18 blocos com equívoco CMV IHC foram realizados. Dois patologistas cuidadosamente examinados e nestes casos não foi possível identificar inclusões virais discerníveis em qualquer uma das lâminas adicionais (dados não mostrados).
| Parâmetros de reação em cadeia da polimerase em tempo real sugeridas | ||||||
| Leituras de configuração: | ||||||
| Canal Padrão | Procure Temperatura | Max Procure Pos Tipo de aparelho | Capilar Tamanho | |||
| 530 | 30 ° C | 12 | 6 canais | 20 ul | ||
| Nome do Programa: A ativação de enzima | ||||||
| Número de ciclos: 1 | ||||||
| Modo Análise: Nenhum | ||||||
| Alvo ° C | Segure hh: mm: ss | Taxa de rampa | Sec-alvo | Tamanho do Passo | Passo Atraso | Modo de aquisição |
| 95 | 00:10:00 | 20 | 0 | 0 | 0 | Nenhum |
| Nome do Programa: Toque para baixo passo | ||||||
| Número de ciclos: 10 | ||||||
| Modo Análise: Nenhum | ||||||
| Alvo ° C | Segure hh: mm: ss | RAMTaxa de p | Sec-alvo | Tamanho do Passo | Passo Atraso | Modo de aquisição |
| 95 | 00:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | Nenhum |
| 65 | 00:00:20 | 20 | 55 | 1 | 1 | Nenhum |
| 72 | 00:00:15 | 20 | 0 | 0 | 0 | Nenhum |
| Nome do Programa: Amplificação do DNA | ||||||
| Número de ciclos: 40 | ||||||
| Modo Análise: Quantificação | ||||||
| Alvo ° C | Segure hh: mm: ss | Taxa de rampa | Sec-alvo | Tamanho do Passo | Passo Atraso | Modo de aquisição |
| 95 | 00:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | Nenhum |
| 55 | 00:00:20 | 20 | 0 | 0 | 0 | Único |
| 72 | 00:00:15 | 10 | 0 | 0 | 0 | Nenhum |
| Nome do Programa: Cooling | ||||||
| Número de ciclos: 1 | ||||||
| Modo Análise: Nenhum | ||||||
| Alvo ° C | Segure hh: mm: ss | Taxa de rampa | Sec-alvo | Tamanho do Passo | Passo Atraso | Modo de aquisição |
| 40 | 00:00:30 | 20 | 0 | 0 | 0 | Nenhum |
Tabela 1. Os parâmetros listados deve ser usado como um guia para as temperaturas alvo, número de ciclos, e comprimentos de ciclo no set-up em tempo real de reação em cadeia da polimerase para a detecção cytomegalovi rus em fixados em formalina, biópsias gastrointestinais embebidos em parafina. Estes parâmetros podem requerer otimização, dependendo do modelo do instrumento e fabricante.
| Histologia casos positivos | Casos positivos de PCR | Sensibilidade | Histologia casos negativos | PCR casos negativos | Specitivity |
| 91 | 88 | 96,7% | 79 | 78 | 98,7% |
Tabela 2. Sensibilidade (96,7%) e especificidade (98,7%) de tempo-real de reacção em cadeia da polimerase (qPCR) na detecção do citomegalovírus em fixados em formalina, biópsias gastrointestinais embebidos em parafina. Esta tabela foi modificado de McCoy et ai 5.
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Figura 1. Uma microtome típico com o bloco de tecido encaixado corretamente no cassete braçadeira A) como uma seção de 10 mícrons de espessura de tecido da biópsia é cortado é permitido rolar em um rolo de papel B), que é transferida para um tubo de microcentrífuga C). Todos os cinco rolos de tecido da biópsia são colocados em um único tubo de microcentrífuga para extração de DNA.
A) Hematoxilina e eosina, de uma biópsia de cólon mostrando abundantes, inclusões de CMV típicos conforme indicado pelas setas (400X ampliação original) Figura 2.. B) A biópsia de cólon corado com um anticorpo monoclonal contra CMV mostrando o esperado padrão de coloração IHC (original aumento de 400X).
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Discussion
Muitos métodos laboratoriais estão disponíveis para o diagnóstico da infecção pelo citomegalovírus (CMV), incluindo sorologia, cultura viral, ensaios moleculares de viremia, histologia do material da biópsia e, como demonstrado recentemente, ensaios moleculares de, a biópsia fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE) 5,6 tecido. Sorologia, uma vez que um dos pilares do diagnóstico, identifica apenas confiável exposição e não se correlaciona bem com a infecção por CMV aguda 7. A cultura viral, tanto convencional e cedo antigénio concha frasco, é dificultada por longos tempos de ensaio, na melhor das hipóteses de 2-3 dias, no caso do último 8. Os ensaios moleculares de viremia foram desenvolvidos, a maioria tem a vantagem de ser quantitativa com o potencial para a eficácia do tratamento de monitorização 9-11. Infelizmente, quando há uma preocupação clínica de envolvimento local do gastrointestinal (GI), ensaios de viremia refletir envolvimento sistêmico e não identificam especificamente infecção localizada. Portanto, histology tem sido o padrão ouro para a identificação de infecção por CMV do trato GI.
É fundamental identificar infecções ativas CMV trato GI em pacientes imunodeprimidos, como os portadores de HIV / AIDS, em quimioterapia, ou órgão / transplantes de células estaminais, dada a sua maior risco de desenvolver infecção grave. Foi relatado polimerase quantitativa de reacção em cadeia (qPCR) é um método altamente sensível e específico para a detecção de CMV em biópsias IG 5. Resultados semelhantes têm sido apoiados por outros estudos 6.
Apesar de todas as etapas ao longo do processo são importantes, há algumas etapas críticas principais que merecem consideração especial. Durante o processamento do tecido sobre o micrótomo, é imprescindível que a lâmina ser comutada entre cada amostra para reduzir a possibilidade de contaminação cruzada entre as amostras. Da mesma forma, a descontaminação de áreas no micrótomo o tecido pode ter entrado em contacto com o uso de um limpador adequado recrecomendada pela fabricante micrótomo também irá reduzir esse risco.
Um passo chave adicional durante o protocolo é a adição de um controlo interno IC (passo 2.3) para a amostra durante a extracção do ADN, o qual actua como um controlo para o processo de extracção e de amplificação. A amplificação e a detecção da IC não interfere com a amplificação de CMV, porque a detecção do vírus CMV ocorre no canal 530, ao passo que a detecção do IC ocorre no canal 705. Cada laboratório deve estabelecer uma gama aceitável para o CI. Após a extração, a qualidade do DNA não precisa ser avaliada. Em outras palavras, a determinação espectrofotométrica da concentração de ADN não é rotineiramente realizado a seguir ao isolamento do ADN. Se adicionado antes da extracção do ADN, o IC actua como um controlo para o processo de extracção. Alternativamente, um pi de IC podem ser adicionados a cada mistura principal com Mg frasco. Se adicionado à mistura principal com Mg, o IC actua apenas como uma amplificação control.
É também imperativo que durante o set-up de todas as reações de qPCR que um capuz limpo (incluindo pipetas e pontas) ser usados para reagente configurar. Esta capa não deve ter quaisquer produtos de amplificação, ou seja, pós-tempo real ou PCR convencional, manipulado dentro dele. Estes produtos de amplificação pode se tornar em aerossol e contaminar as reações de qPCR posteriormente preparados levando a falsos resultados positivos. Muitos laboratórios até mesmo ir tão longe como designando exaustores e equipamentos para pipetagem de reagentes ácidos nucléicos e não uma segunda capa e equipamentos para a adição de amostra e controlar ácido nucleico. Laboratórios individuais devem decidir o que funciona melhor dadas as suas limitações de espaço individuais.
Solução de problemas resultados inesperados podem ser necessários durante o procedimento. Se não há nenhuma evidência de amplificação do IC (isto é, linha plana) de uma amostra, é recomendado que a primeira repetição da reacção qPCR do extracti DNA originalpara garantir um erro de pipetagem não ocorreu durante a preparação de reacção da amostra. Se o IC permanece em uma linha reta sobre a reação da repetição e há tecido biópsia suficiente restante, uma segunda extração de DNA podem realizada, lembrando de acrescentar o IC durante o processo de extração. Se esta amostra re-extraiu-se também demonstra uma linha plana IC, é provável que seja um inibidor da reacção presentes nas amostras originais. Neste caso, o resultado do teste seria indeterminado para a detecção de CMV uma vez que o controlo da reacção de qPCR não realizar de forma adequada.
Se a água, sem controle de destino (NTC) demonstra a amplificação do alvo, é aconselhável primeiro a analisar a taxa de positividade do prazo. Se a corrida tem um maior do que o índice de positividade normal, seria recomendável a realização de testes de furto de áreas onde qualquer manipulação de reagentes é realizada para identificar qualquer potencial contaminação do ambiente. Se a poluição ambiental seja descartada, usar umcontrole da água recém-inaugurado junto com os controles positivos habituais. Se o controlo de água recentemente aberta não mostram um produto de amplificação, é provável que o controlo de água anterior foi contaminada com a sequência alvo. No entanto, se este novo controle da água é novamente contaminado, levanta a possibilidade de qualquer ou de todos os reagentes ou capuzes sendo contaminados com seqüência alvo. Neste caso, seria melhor para descontaminar todos os capuzes utilizados durante o processo e, em seguida, usar todos os novos reagentes na execução de um novo conjunto de controles (positivo e água). Se o problema persistir, uma reavaliação do fluxo de trabalho nas áreas de processamento e capuzes, bem como entrar em contato com os fabricantes do produto deve ser feito.
Se os padrões de qualidade (QS) incluído no prazo não demonstram o número de cópia adequada durante a amplificação, é aconselhável que primeiro executar todo o QS (4, 3, 2, 1, e uma diluição de QS4 1:10). Se esses padrões estão dentro dos intervalos adequados, em seguida, repitaas amostras como anteriormente especificados com os controlos apropriados. Se os QS não caem dentro dos intervalos adequados, em seguida, gerar uma nova curva padrão, tal como descrito na secção do protocolo (3.4) de controlo de qualidade. Se o problema persistir, pode ser tentada a geração de uma curva padrão novo com QS recém-inaugurado da atual ou um número novo lote. Se estes passos não forem bem sucedidos, entrar em contato com o fabricante seria justificado.
Embora a sensibilidade e especificidade de qPCR para detecção de CMV em biópsias IG com base em cálculos usando métodos convencionais (H & E e IHC) como padrão-ouro não demonstram imediatamente uma vantagem de diagnóstico, utilizando o método de qPCR analiticamente mais sensíveis como o padrão ouro melhora muito a estes Cálculos 5. Além disso, 14 (78%) das 18 biópsias ambíguos testado positivo para CMV por qPCR no presente estudo. Considera-se estes pontos de apoio da noção de que qPCR é muito mais sensível do que qualquer um de H &E sozinho, ou em conjunto com IHC na detecção de CMV em material de biópsia do GI. Além disso, em casos duvidosos com padrões de coloração IHQ, a obtenção de níveis adicionais é improvável que seja de qualquer benefício adicional em relação aos métodos convencionais atuais.
Tomados em conjunto, qPCR é altamente sensível e específico para detectar a infecção por CMV em tecido biópsia FFPE GI. Particularmente útil é o desempenho da qPCR em biópsias GI com padrões ambíguos coloração CMV IHC ou clinicamente altamente suspeito para CMV. Em comparação com a histologia tradicional, o teste qPCR de material de biópsia GI pode facilitar um diagnóstico preciso em um curto período de tempo, levando assim a mais cedo e uma gestão mais eficaz ao paciente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos Amy Thomasson por sua assistência com a preparação deste manuscrito, e Fredrik Skarstedt e Ryan Christy por seus esforços na preparação das figuras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| Serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μl Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| Blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
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