Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

Zusammenfassung

Synthese und Herstellung von elektro langen Fasern sich über eine größere Ablagefläche über einen neu gestalteten Sammler aus einem neuartigen biologisch abbaubaren Polymer namens Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PGD) wurde berichtet. Die Fasern waren in der Lage, das Wachstum von pluripotenten Zellen aus Maus-Stammzellen zu unterstützen.

Zusammenfassung

Für Tissue-Engineering-Anwendungen ist die Herstellung von biologisch abbaubaren und biokompatiblen Stützgerüste der wünschenswerteste aber schwierige Aufgabe. Von den verschiedenen Herstellungsverfahren, ist die Elektro attraktiv wegen ihrer Einfachheit und Vielseitigkeit. Zusätzlich elektrogesponnene Nano imitieren die Größe der natürlichen extrazellulären Matrix gewährleistet zusätzliche Unterstützung für das Überleben der Zelle und Wachstum. Diese Studie zeigte, die Lebensfähigkeit der Herstellung von Langfasern sich über eine größere Ablagefläche für eine neuartige biologisch abbaubare und biokompatible Polymer namens Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PGD) ¹ unter Verwendung einer neu entwickelten Kollektor für Elektro. PID zeigt einzigartige elastischen Eigenschaften mit ähnlichen mechanischen Eigenschaften von Nervengewebe, somit geeignet für neuronale Gewebe-Engineering-Anwendungen ist es. Die Synthese und Herstellung Set-up für die Herstellung von Fasergerüstmaterial war einfach, sehr gut reproduzierbar und kostengünstig. BiokompatibilitätTests könnten Zellen aus embryonalen Stammzellen der Maus abgeleitet zu haften und wachsen an den elektro PGD Fasern. Zusammenfassend dieses Protokoll ein vielseitiger Herstellungsverfahren für die Herstellung von PGD elektrogesponnenen Fasern um das Wachstum von embryonalen Maus-Stammzellen abgeleitete neuronale Linie Zellen unterstützen.

Einleitung

Elektrospinnen ist eine der wirksamsten Methoden, um die Verarbeitung der Mikro-zur Nanometer-Größe Fasergerüste herzustellen. Das Grundprinzip der Elektro beinhaltet eine Taylor-Konus der Lösung, die an der Öffnung der Nadel durch Anlegen einer Hochspannung zwischen der Nadelspitze und einem geerdeten Kollektor gehalten wird. Wenn die elektrostatische Abstoßung in der Lösung überwindet die Oberflächenspannung, wird eine geladene Flüssigkeitsstrahl von der Nadelspitze ausgestoßen wird, durch die Luft mit Lösungsmittelverdampfung, und wird schließlich auf der geerdeten Kollektor abgeschieden. Die Spritzenpumpe stellt einen kontinuierlichen Fluss von Lösung aus der Spinndüse austretende und damit mehrere Kopien der elektrogesponnenen Fasern in kurzer Zeit hergestellt werden. Im Verlauf Verlassen der Spinndüse zu dem Kollektor zu gelangen, wird der geladene Strahl durchlaufen Dehnung und Schlag nach einer Anzahl von Parametern, die die Viskosität und die Oberflächenspannung der Polymerlösung enthalten, die elektrostac Kraft in der Lösung, und die Wechselwirkung des externen elektrischen Feldes, usw. ^2.

In der Elektrospinnverfahren dient ein Sammler als ein leitfähiges Substrat, wo die Mikro-bis Nanometer-Fasern abgelagert werden könnte. In dieser Studie wurde eine neue Art von Fasersammler wurde entwickelt, um Fasermatten mit der gewünschten Größe (Länge x Breite) zu erhalten. Traditionell wird die Aluminiumfolie als Kollektor verwendet, aber es ist schwierig, die Fasern von der flachen Oberfläche an ein anderes Substrat zu übertragen. Die Schwierigkeiten bei der Ernte eine intakte Fasermatte von einem traditionellen Sammler war vor allem aufgrund der Tatsache, dass die elektrogesponnenen Fasern legen stark an die Sammler-Oberfläche. Daher modifizierten wir die Sammler durch Falten ein Stück Aluminiumfolie zu einem rechteckigen Streifen und Befestigung senkrecht zu einer flachen Metallplatte. Die elektrogesponnenen Fasern in dem Bereich zwischen der Spitze des Streifens und der Metallplatte, die leicht auf einen anderen übertragen werden können substrat gestrecktE.

Das Interesse an thermisch vernetzten elastomeren Polymeren wächst schnell, weil der Pionierarbeit von Robert Langer-Gruppe, die Poly (Glycerin Sebacat) (PGS), ein Polyester, der analog zu vulkanisierten Kautschuks in 2002 ^3. Ähnlich PGS eingeführt wurde, haben wir erfolgreich entwickelt Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PID) durch thermische Kondensation von Glycerin und Dodecandisäure und demonstriert seine einzigartige Formgedächtniseigenschaft ^ein. Im Gegensatz zu steiferen synthetischen Materialien Poly (Hydroxybutyrat) oder Poly (L-lactid) (Young-Modul von 250 MPa und 660 MPa) aufweist PGD elastomere Eigenschaft wie Gummi, mit einem Young-Modul von 1,08 MPa, wenn die Temperatur über 37 ° ist C, die eine enge Übereinstimmung mit der in-situ peripheren Nerven (0,45 MPa) ist. Darüber hinaus ist die PID biologisch abbaubar und die Abbauzeit kann durch Variation des Verhältnisses von Glycerin und Dodecandisäure fein abgestimmt werden. Dodecandisäure ist ein Zwölf-Kohlenstoff-UnterPosition mit zwei endständigen Carboxygruppen, HOOC (CH _{2) 10} COOH. Auch nummeriert Dicarbonsäuren wie Sebacinsäure und Dodecandisäure kann metabolisiert werden zu Acetyl-CoA und geben Sie den Tricarbonsäurezyklus (TCA) / (Zitronensäure-Zyklus). Das Stoffwechselprodukt von Dicarbonsäuren, Succinyl-CoA, ein gluconeogenetischen Vorläufer und Zwischen der TCA-Zyklus ^4. So schlugen einige Studien, dass sie als alternativer Kraftstoff Substrat für die enterale und parenterale Ernährung, insbesondere bei der pathologischen Bedingungen verwendet werden. Außerdem weist eindeutige PID Formgedächtnis weil ihre Glasübergangstemperatur 31 ° C, so zeigt es verschiedene mechanische Eigenschaften bei Raumtemperatur und Körpertemperatur. In der Summe ist die PID biologisch abbaubare, biokompatible, Ausstellen einzigartigen elastischen Eigenschaften mit ähnlichen Nervengewebe mechanische Eigenschaften; Daher ist es ein geeignetes Material für Nervengewebe Technik. In diesem Protokoll wird die elektrolange Fasern überspannt eine große Ablagefläche wurden über die neu gestalteten Sammler aus PGD hergestellt. Die Fasergerüste können mit der Maus pluripotente Stammzellen Wachstum und die Differenzierung zu unterstützen.

Protokoll

1. Elektrospinning Collector Setup-

1. Schneiden die Aluminiumfolie in einem rechteckigen Stück.
2. Falten Sie das rechteckige Stück in einen rechteckigen Streifen, und befestigen Sie es senkrecht zu einer flachen Metallplatte mit Klebeband (Abbildung 1). Hinweis: Die Größe der Fasermatte hängt von der Länge und Breite des Streifens. Somit kann die Bandabmessungen nach Bedarf eingestellt werden.

2. Polymere Herstellung der Lösung

1. Mischen Glycerin und Dodecandisäure (DDA) in einem Molverhältnis von 1:1 in einem Becherglas bei 120 ° C für 100 h PGD-Polymer zu erhalten.
2. Auflösen Poly (ethylenoxid) (PEO) und Gelatine in 65% Ethanol mit einem Gewichtsverhältnis von 1.5:3:95.5 in einem 15 ml-Röhrchen, den Verschluss und die Mischung in einem Ofen bei 60 ° C für 1 h unter Rühren bis es eine homogene Lösung (Grundlösung).
3. Für Elektro, mischen Sie die PID-Polymer und die Grundlösung in 4.06 Gewichts-Verhältnis. Hinweis: PID-Konzentration hat eine big Wirkung auf Faserdurchmesser. 30% -50% Prozent PID akzeptabel Fasern mehr als 5 cm mit einer erhöhten Faserdurchmessern zu erzeugen.
4. In 0,1% Riboflavin der Polymerlösung und gut mischen.

3. Elektrospinning

1. Feed der Polymerlösung in eine 5 ml Standardspritze mit einer 18 G abgestumpft Nadel aus Edelstahl.
2. Legen Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe.
3. Befestigen des geerdeten Anschluß eines Hochspannungsleistungsquelle mit der Metallplatte und dem positiv geladenen führen zu der Nadel.
4. Den Abstand zwischen der Nadel und der Aluminiumfolienband 15 cm.
5. Zeigen die Spritzenpumpe in einem Winkel von etwa 15 ° mit der Horizontalen, um die Aggregation der Fasern an der Vorderseite des Streifens zu verhindern.
6. Schalten Sie die Spritzenpumpe und die Durchflussrate der Pumpe bis 0,6 ml / Std.
7. Schalten Sie die Hochspannungsquelle und stellen Sie die Betriebsspannung von 14,6 kV.

4.Faserverarbeitung

1. Nach Abschluss der Sammlung ist, setzen die Fasermatte mit UV-Licht für 60 min für die Vernetzung.
2. Übertragen der Fasermatte aus der Aluminiumfolienstreifen auf eine 100 mm Petrischale, und setzen diese mit UV-Licht für weitere 20 min zur Sterilisation.
3. In einer biologischen Sicherheitsschrank, schneiden Sie die Fasermatte in runde Stücke der gleichen Größe mit einem Skalpell und legen Sie die Stücke in eine 24-Well-Platte.
4. Für Zellvorge Impfbehandlung tauchen Faserproben in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und bei 37 ° C über Nacht.
5. Am folgenden Tag, sorgfältig absaugen PBS, 1 ml Differenzierungsmedium (DMEM/F12, N2 und FGF2) (siehe Rezept in der Materialtabelle) in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 3 Stunden.
6. Saugen Differenzierungsmedium vorsichtig, fügen 0,2 ml Matrigel jedem Faserprobe und bei 37 ° C für 30 min. Hinweis: Laminin kann auch für Faserbeschichtung verwendet werden. 0,2 ml von 20 ug / ml Lamininan die Faser und Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 Stunden.
7. Über Matrigel vorsichtig aus jedem Well. Spülen mit 2 ml Differenzierungsmedium einmal. Anmerkung: Die Faserproben sind bereit für die Zellkultur.

5. Zellaussaat auf Fibers

1. 1 ml der Accutase auf der MES-Zellkulturschale und Inkubation für 10 min bei 37 ° C
2. Nach 10 min werden die MES-Zellen von der Kulturschale abgelöst. 4 ml Differenzierungsmedium mit der Platte. Sammeln Sie die schwimmenden MES-Zellen in ein 15-ml-Tube und Pipetten Zellen nach oben und unten, um Kolonien (ca. 15x) zu brechen.
3. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min und resuspendieren Zellen in 4 ml Differenzierungsmedium.
4. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Transfer von 200 &mgr; l der Zellsuspension in ein 15 ml-Röhrchen und verdünnte es 10x mit Differenzierungsmedium. Übertragen 15 &mgr; l der verdünnten Zellsuspension in eine Kammer auf der Zählkammer mit einem Deckglas vorhanden. Zählendie Zellen in der Mitte Platz 1 mm und die vier Ecken Quadrate der Zählkammer unter dem Mikroskop. Hinweis: Zelle pro ml = die Durchschnittszahl pro Quadrat x Verdünnungsfaktor x 10 ⁴
5. Legen Sie ca. 5 x 10 ⁴ MES-Zellen auf jede gut. Langsam fallen die Zellsuspension auf die Mitte der Faserproben, statt ein Abrutschen auf die Seite des Brunnens, die Lösung aus dem Ablassen der Fasermatte zu verhindern.
6. 1 ml Differenzierungsmedium in jede Vertiefung, und halten Sie die Platte in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO _2, um Zellen Befestigung, Wachstum und Differenzierung zu ermöglichen.
7. Saugen Sie das alte Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen jeden zweiten Tag mit 1 ml frischem Differenzierungsmedium.

6. Zellviabilitätsmessungen

1. Saugen Sie das alte Medium aus jedem Well.
2. Mischen ^1/10 Volumen von Resazurin Fluoreszenz-Reagenz mit Kulturmedium und Zugabe von 1 ml in jede Vertiefung.
3. Incubaß bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 4 Stunden, vor Licht geschützt.
4. Nach 4 Stunden, dann 100 ul 3x des Reagenz aus jeder Vertiefung in eine 96-Well-Platte und dann die Proben sind bereit, auf einem Fluoreszenz-Spektralphotometer mit 560EX nm/590EM Filtereinstellungen gemessen werden.

7. Real Time PCR

1. Nach 14 Tagen Kultur hinzufügen Lyse-Puffer zu den Proben zu isolieren, und die Gesamt-RNA aus den Zellen an der Faserproben.
2. Verwenden Sie 4 ul von Gesamt-RNA in cDNA in 20 ul Reaktions Skalen Synthese durch reverse Transkription.
3. Die PCR-Reaktionsgemisch in jedem optischen Röhre: 10 ul Master Mix (2x), 0,2 &mgr; l Farbstoff, 8 &mgr; l Nuklease-freiem Wasser, 1 &mgr; l cDNA und 1 ul Primer (Primer in dieser Studie sind in Tabelle 1 aufgeführt).
4. Stellen Sie das PCR-Programm: ein. 95 ° C 2.20 min, 1 Zyklus b. 95 ° C 3 sec → 60 ° C 1 min, 40 Zyklus c. 95 ° C 15 s, 1 d-Zyklus. 60 ° C 1min, 1 Zyklus e. 95 ° C 15 sec, 1 Zyklus. Wählen Vergleichs C _T-Methode, um die relative Genexpression zu bestimmen.
5. Nach der PCR beendet ist, analysieren die Echtzeit-PCR-Ergebnisse mit StepOne-Software und exportieren Sie die Ergebnisse in Excel.

Ergebnisse

Die Hauptkomponenten der Elektro sind in Abbildung 1 dargestellt. Ein großer Größe Fasermatte wurde in der Regel durch die senkrecht befestigt Aluminiumfolienstreifen und einer flachen Metallplatte erhalten. Abbildung 2 zeigt die Kollektordesign und die Elektrofasermatte. Die Breite und Länge kann für unterschiedliche Anwendungen angepasst werden. Die Länge der Faser mit PID-Grundlösung und Polymermischung hergestellt ist, bis zu 10 cm. Die Morphologie der elektrogesponnenen Fasern ist ...

Diskussion

Die Grenzen der einfachen Kollektoren oder die Komplexität der Drehkollektoren, die derzeit zum Elektro erhöhen die Beschränkung der Erhalt der gewünschten Länge und Größe der Fasermatte für einige Anwendungen verwendet werden. Zusätzlich Übertragen Fasern aus dem Erdkollektor in die Kulturschale oder anderen Substraten ⁵ ist eine Herausforderung. In diesem Bericht wird ein neu gestalteten Sammler, durch das Hinzufügen einer Aluminiumfolienstreifen mit der geerdeten Kollektor hergestellt, konnte die große Fas...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Glycerin	Sigma-Aldrich	G7757
Dodecandisäure	Sigma-Aldrich	D1009
Gelatine	Sigma-Aldrich	D1890
Poly(ethylenoxid) (PEO)	Sigma-Aldrich	182028
Riboflavin	Sigma-Aldrich	132350250	0,10
embryonale Stammzellen	der MausGlobalStem	GSC-5002
Matrigel	Becton Dickinson	356234
DMEM/F12	Thermo Scientific	SH30272.02
N2 Supplement	Invitrogen	17502048	1%
FGF2	Stemgent	03-0002	10 ng/ml
Accutase	Invitrogen	A11105-01
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Invitrogen	10010-031
Resazurin-Fluoreszenzfarbstoff	Sigma-Aldrich	62758-13-8
SV Gesamt-RNA-Isolationssystem	Promega	Z3100
GoScript Reverse Transkriptionssystem	Promega	A5000
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001
Spritzenpumpe	Fisher scientific	14-831-200
Hochspannungs-Stromquelle	Spellman High Voltage Electronics Corporation		SL30
UV-Licht	Philips	308643	15W/G15T8
Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader	BioTek
Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600	Perkin Elmer	8488
StepOne Real-time PCR System	Applied Biosystems	4376357

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