Entwicklung von Amelogenin-Chitosan-Hydrogel für In-vitro- Emaille Nachwachsen mit einem dichten Schnittstelle

Zusammenfassung

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung eines amelogenin-Chitosan-Hydrogel für oberflächliche Zahnschmelz Wiederaufbau. In-situ-Wachstum von Apatitkristalle in dem Hydrogel Organisiert bildeten einen dichten Schmelz-Wiederherstellung-Schnittstelle, die die Wirksamkeit und Haltbarkeit von Restaurationen zu verbessern.

Zusammenfassung

Die biomimetische Schmelzrekonstruktion ist ein bedeutendes Thema in der Materialwissenschaft und Zahnheilkunde als neuartiger Ansatz zur Behandlung von Karies oder Erosion. Amelogenin hat sich als kritisches Protein für die Kontrolle des organisierten Wachstums von Apatitkristallen erwiesen. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die oberflächliche Schmelzrekonstruktion unter Verwendung eines neuartigen Amelogenin-Chitosan-Hydrogels vor. Im Vergleich zu anderen konventionellen Behandlungen, wie z. B. topischem Fluorid und Mundwasser, hat diese Methode nicht nur das Potenzial, die Entwicklung von Zahnkaries zu verhindern, sondern fördert auch eine signifikante und dauerhafte Wiederherstellung des Zahnschmelzes. Die organisierte schmelzartige Mikrostruktur, die durch Amelogenin-Anordnungen reguliert wird, kann die mechanischen Eigenschaften von geätztem Zahnschmelz erheblich verbessern, während die dichte Schmelz-Restaurations-Grenzfläche, die durch ein In-situ-Nachwachsen von Apatitkristallen gebildet wird, die Wirksamkeit und Haltbarkeit von Restaurationen verbessern kann. Darüber hinaus ist Chitosan-Hydrogel einfach anzuwenden und kann bakterielle Infektionen unterdrücken, die der Hauptrisikofaktor für das Auftreten von Karies sind. Daher ist dieses biokompatible und biologisch abbaubare Amelogenin-Chitosan-Hydrogel als vielversprechendes Biomaterial für die Vorbeugung, Wiederherstellung und Behandlung von defektem Zahnschmelz.

Einleitung

Zahnschmelz ist die harte, mineralisierte Oberfläche menschlicher Zähne. Es besteht aus zahlreichen nadelartigen Apatitkristallen, die in organisierten, parallelen Prismen gebündelt sind, um die einzigartige mechanische Festigkeit und den biologischen Schutz zu gewährleisten, den der Zahnschmelz^{bietet 1-2}. Im Gegensatz zu anderen mineralisierten Geweben wie Knochen und Dentin ist reifer Zahnschmelz azellulär und kann sich nach erheblichem Mineralverlust^1-2, der häufig als Karies oder Erosion auftritt, nicht selbst regenerieren. Im Handel erhältliche Produkte wie fluoridhaltige Lacke, Zahnpasten und Mundspülungen sind wirksam bei der Remineralisierung des Zahnschmelzes, aber keines von ihnen hat das Potenzial, die Bildung von organisierten Apatitkristallen zu fördern. Klinisch handelt es sich bei der konventionellen Behandlung der Schmelzreparatur um ein Füllungsverfahren mit künstlichen Materialien wie Amalgam, Keramik oder Kompositharz ³. Diese Materialien verbinden sich jedoch in der Regel nicht gut mit dem natürlichen Gewebe, das die Läsion umgibt, da sich ihre Strukturen, Komponenten und Eigenschaften vom natürlichen Zahnschmelz unterscheiden. Dadurch entsteht häufig im Laufe der Zeit Sekundärkaries an der Grenzfläche zwischen Zahn und Fremdmaterialien. Daher ist das in situ Nachwachsen von Zahnschmelz mit einer dichten Grenzfläche ein attraktives Ziel für die Bereiche Materialwissenschaften und Stomatologie. Ein besonders vielversprechender Weg, um dieses Ziel zu erreichen, ist die biomimetische Synthese von schmelzartigem Material auf der Schmelzoberfläche. In jüngster Zeit wurden zahlreiche In-vitro-Versuche unternommen, schmelzähnliche Materialien mit biomimetischen Systemen herzustellen, die Nano-Apatiten oder verschiedene organische Zusätze ^{enthalten 4-12}. Die Entwicklung der optimalen biomimetischen Strategie zur Förderung von Remineralisierungskristallen, um eine perfekte dichte Grenzfläche zu erreichen, ist jedoch immer noch eine Herausforderung.

Während der Schmelzmineralisierung wird das orientierte Wachstum und die Dehnung von Apatitkristallen durch eine amelogeninreiche Matrix ^1,13-14 reguliert. Um die organische Matrix bei der Entwicklung des Zahnschmelzes nachzuahmen, beschreiben wir hier ein detailliertes Protokoll zur Herstellung eines Amelogenin-Chitosan (CS-AMEL) Hydrogels für das In-situ-Nachwachsen des Zahnschmelzes auf einer säuregeätzten Schmelzoberfläche, das als Modell für erosive Läsionen verwendet wird. Als "das vielseitigste Wachstumsmedium" für die Kristalle ¹⁵ haben Hydrogel-Matrizen einen Vorteil gegenüber einem Lösungssystem, da sie klinisch einfacher zu handhaben sind. Darüber hinaus ist CS-AMEL biokompatibel, biologisch abbaubar und verfügt über einzigartige antimikrobielle und adhäsive Eigenschaften, die im Vergleich zu anderen biomimetischen Systemen für dentale Anwendungen günstig sind ¹⁶. Wichtig ist, dass die in situ Mineralisierung von Apatitkristallen auf der Schmelzoberfläche eine dichte Grenzfläche zwischen der reparierten Schicht und dem natürlichen Zahnschmelz bildet, was die Haltbarkeit von Restaurationen verbessern und die Bildung neuer Karies am Rand der Restauration verhindern kann.

Protokoll

Die menschliche Molaren wurden nach den Standardverfahren zur Extraktion bei der Ostrow School of Dentistry der University of Southern California extrahiert und mit Zustimmung des Institutional Review Board behandelt.

1. Vorbereitung der geätzten Zahn Scheibe

1. Wählen Sie einen menschlichen dritten Molaren ohne restauriert Karies.
2. Entfernen der Wurzelabschnitt des molaren, und schneiden die Krone des molaren Längsrichtung in Scheiben von 2 mm Dicke unter Verwendung einer wassergekühlten Niedergeschwindigkeits-Diamantsäge. Diese Scheiben reinigen mit Ultraschall für 2 Minuten und dann spülen Sie mit VE-Wasser 3-mal.
3. Um Erosionen zu simulieren, ätzen die Zahnscheiben mit 30% Phosphorsäure für 30 Sekunden, dann sie sofort gründlich mit VE-Wasser.
4. Ultraschall reinigen die Scheiben geätzt für 2 Minuten und dann spülen Sie mit VE-Wasser 3-mal.

2. Vorbereitung der Amelogenin-Chitosan-Hydrogel

1. Präparaten von Chitosan-Stammlösung
   1. Man löst 1% (w / v) Chitosan (mittleres Molekulargewicht 75-85% deacetyliertes) in einer 1% (v / v) Essigsäure-Lösung, gefolgt von Rühren bei 80 ° CO / N
   2. Nach Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur filtriert man das Chitosan-Lösung unter Verwendung eines 0,45 &mgr; m. Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 durch Zugabe von 1 M NaOH-Lösung.
2. Herstellung von Calcium-und Phosphat-Stammlösung (0,1 M)
   1. Abwiegen Calciumchlorid (CaCl ₂₎ und bereiten eine 0,1 M Lösung, dann mischen mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Einstellen des pH-Werts auf 11 durch Zugabe von 1 M NaOH-Lösung.
   2. Abwiegen Natriummonohydrogenphosphat (Na ₂ HPO ₄₎ und bereiten eine 0,1 M Lösung, dann mischen mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist.
3. Expression und Reinigung von rekombinantem Amelogenin ^17-18
   Das rekombinante voller Länge Schweine amelogenin (rP172) welche hier hat 172 Aminosäuren und ist ein analoges VollLängen-Nativschweine P173, aber nicht über die N-terminale Methionin sowie eine Phosphatgruppe auf Ser16 ^18.
   1. 20 g Lysogenität Brühe (LB)-Agar-Pulver in 500 ml VE-Wasser, die Lösung im Autoklaven bei 121 ° C (flüssiger Einstellung) für 20 min. Lassen Agar cool zu ~ 55 ° C, fügen Ampicillin (100 ug / ml) in Agar-Lösung.
   2. Übertragen Sie die Agar-Lösung auf Petrischalen, lassen jede Platte abkühlen, bis es fest ist, dann drehen, um Kondensation auf dem Agar zu vermeiden. Speicher Platten in Kunststoffbeutel bei 4 ° C.
   3. Streak die LB-Agar-Platte mit rekombinanten Zellen (E.coli-BC21) von der Glycerin-Stamm (-80 ° C). Die Platten O / N bei 37 ° C.
   4. Vorbereitung 50 ml NZCYM-Medium und das Medium autoklaviert bei 121 º C für 30 min. Ermöglichen, dass die Medien abkühlen, 50 &mgr; l 100 &mgr; g / ml Ampicillin für die 50 ml Medium.
   5. Impfen eine einzige Kolonie von der LB-Agar-Platte in den Medien mit 50ml NZCYM ampicill ergänztin. die Zellen O / N bei 37 ° C inkubieren in einem Schüttelinkubator
   6. Herstellung von 1 l NZCYM-Medien und autoklavieren Medien bei 121 ° C für 30 min. 1 ml 100 mg / ml Ampicillin bis 1000 ml Medium. Nehmen Sie eine optische Dichte (OD) als Rohling mit einem UV-Vis-Spektrophotometer. HINWEIS: Werfen Sie diese nach der ersten Lesung.
   7. Beimpfen von 10 ml der Zellkultur von Schritt 2.3.5 in 1000 ml Medium aus Schritt 2.3.6. Messen der optischen Dichte bei 595 nm unmittelbar nach Inokulation. Nehmen Sie die optische Dichte Lese regelmäßig zu verfolgen, das Wachstum zu halten. HINWEIS: Lesen Sie die leere jedes Mal die OD genommen wird.
   8. Induziert mit 700 &mgr; l Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG, 1 M), wenn das bakterielle Wachstum erreicht, bis etwa 0,75 bis 0,8 OD bei 595 nm auf.
   9. Ernten Sie die Zellen, wenn die OD erreicht 1.1. Den Inhalt des Kolbens in 6 Kunststoffflaschen. Balancieren und wiegen die Flaschen vor der Verwendung der Zentrifuge. Zentrifugieren für 20 min bei 8.554 × g bei 4 ° C.Halten des Zellpellets in der -20 ° CO / N
   10. Nehmen Sie die Zellpellets und kombinieren sie in einem 50-ml-Tube. In 3,5 ml 4 M Guanidin-HCl pro Liter der Gärung. Ultraschallbad 2-3 mal auf Eis, 30 Sek. jedes Mal, mit 1-Minuten-Intervallen.
   11. Machen 6x Verdünnungen des Zellvolumens mit 0,5% Ameisensäure und lassen Sie es im Kühlraum für 2 h rühren. Zentrifugieren für 30 min, 8.554 x g bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand. In 20% Gesättigte Ammoniumsulfat mit der gesättigten Stammlösung und Aufsehen in der kalten Raum, O / N.
   12. Zentrifugieren für 30 min, 8554 × g bei 4 ° C und halten die Pellets. Rekonstitution der Pellets in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), Last auf eine C4-Säule (10 x 250 mm, 5 &mgr; m) und Fraktionierung unter Verwendung eines linearen Gradienten von A = 0,1% TFA und B = 60% Acetonitril in TFA, bei einer Durchflussrate von 1,5 ml · min ^-1.
   13. Einfrieren der Proteinlösung auf Trockeneis und lyophilisiert die gefrorene Probe O / N.
4. Vorbereitung der amelogenin-Chitosan (CS-AMEL) HYDROGel (Fig. 1A)
   1. In 200 ug rp172 in ein Röhrchen mit 960 ul 1% Chitosan-Lösung, dann mit einem Vortex mischen, bis die Lösung klar ist.
   2. In 25 ul 0,1 M CaCl _2-Lösung, gefolgt von 15 ul 0,1 M Na ₂ HPO ₄ Lösung des amelogenin haltigen Chitosan-Lösung, dann mischen mit einem Vortex für 5 min.
   3. Den pH-Wert des CS-AMEL Lösung auf 6,5 durch vorsichtige Zugabe von 1 M NaOH-Lösung. CS-AMEL Hydrogel zu bilden, wenn der pH-Wert 6,5 erreicht.

3. Emaille Nachwachsen in Amelogenin-Chitosan-Hydrogel

1. Herstellung von künstlichen Speichellösung
   1. Man löst eine bestimmte Menge von Magnesiumchlorid (MgCl _2, 0,2 mM), Calciumchlorid (CaCl _2, 1 mM), Kaliumdihydrogenphosphat (KH ₂ PO _{4, 4} mM), Kaliumchlorid (KCl, 16 mM) und Ammoniumchlorid ( NH ₄ Cl, 4,5 mM) in 20 mM HEPES(4 - (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethan-sulfonsäure)-Puffer ^12.
   2. PH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH und speichern die künstliche Speichellösung bei 4 ° C.
   3. Vor der Verwendung der Lösung werden Natriumfluorid (NaF, 300 ppm).
2. Anwendung von CS-Hydrogel AMEL
   1. Gelten etwa 20 &mgr; l CS-AMEL Hydrogel auf die geätzte Zahnscheibe mit einer Spritze (Abbildung 1B).
   2. Trocknen Sie die Hydrogel-bedeckten Zahnscheibe in einem Exsikkator bei RT für 2 Stunden.
   3. Übertragen der Zahnscheibe in ein Becherglas, das 30 ml Lösung künstlichen Speichels. Das Becherglas mit Aluminiumfolie, und dann halten Sie den Becher in einem Ofen bei 37 ° C für 7 Tage.
   4. Entfernen Sie die Zahnscheibe und trocknen Sie sie in einem Trockenschrank bei RT.

4. Charakterisierung der Schnittstelle zwischen neu gewachsenen Schicht und Emaille

Die Mikrostruktur der Grenzfläche zwischen dem neu gewachsenen Schicht und Emaille Beobachdurch Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und hohen Drehtransmissionselektronenmikroskopie (HR-TEM) ved. Die TEM-Probe wurde unter Verwendung eines fokussierten Ionenstrahls (FIB)-Technik, die für die Schritte sind wie folgt hergestellt.

1. Legen Sie die Probe in ein FIB-SEM Instrument und beenden Sie alle Ausrichtungen nach der Betriebsanleitung. HINWEIS: Z Feineinstellung sollte mindestens 2 mal durchgeführt werden.
2. Abscheiden einer Kohlenstoffschicht (15 × 3 &mgr; m) auf der Probe, um die darunterliegende Struktur (2A) zu schützen.
3. Mühle die Probe vorsichtig an den oberen, unteren und rechten Seite der Kohlenstoffschicht, ein dünnes Stück Probe herzustellen, und dann schneiden Sie die untere Seite dieser dünnen Stück. HINWEIS: Überprüfen Sie die Ionenstrahl-Ausrichtung vor jedem Schleifschritt (Abbildung 2B).
4. Weld ein Pt-Spitze auf dem dünnen Stück und schneiden Sie die linke Seite, um das Probestück (3C) zu trennen. HINWEIS: Überprüfen Sie die Ionenstrahl-Ausrichtung vor dem Schweißschritt.
5. Heben Sie tPT er mit der Probe langsam kippen, und montieren Sie die Lamellen Probe auf einem Lift-out-TEM-Gitter.
6. Nehmen Sie die Spitze aus der Probe und die Probe dünn, bis seine Dicke weniger als 100 nm (Abbildung 3D). Entfernen der Probe aus dem Gerät, um die TEM-Beobachtung durchzuführen. HINWEIS: Überprüfen Sie die Ionenstrahl-Ausrichtung vor jedem Verdünnungsprozess.

5. Beurteilung der Bindung und mechanische Eigenschaften der neu gewachsenen Schicht

1. Die Bindungsfestigkeit wird durch Ultraschallbehandlung beurteilt. Halten Sie die reparierte Zahnscheibe in einem Ultraschallreiniger (42 kHz, 100 W) für 10 min und dann beobachten, die Schnittstelle zwischen der Schicht und repariert natürlichen Zahnschmelz mit einem Rückstreuelektronen-REM-Analyse.
2. Messung der Härte und der Elastizitätsmodul bei 20 Testpunkte für jedes repariert Schmelzoberfläche (n = 3) durch eine Nanoindenters mit einer Berkovich-Spitze.

6. Immunfluoreszenzfärbungen

1. Waschen Sie die Zahnscheibe mit Tris buffer Kochsalzlösung (TBS) für 15 min.
2. Blockieren mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in TBS für 15 min.
3. Entfernen Sie die Flüssigkeit und Inkubation der Probe O / N 1 ° Ab (1:500 Huhn Anti-Amelogenin) in TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100) verdünnt.
4. Waschen Sie die Probe mit TBS für 30 min und Inkubation O / N mit 2 ° Ab (1:100 Anti-Huhn FITC) in TBS verdünnt.
5. Waschen Sie die Probe mit TBS für 30 min und zu verlassen, um für weitere 30 Minuten trocknen.
6. Beachten durch Fluoreszenz-Mikroskop.

Ergebnisse

Die Wirksamkeit der hier beschriebenen Protokoll wird durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM), Bereichsbeugung (SAED) und Röntgenbeugung (XRD)-Analyse bewiesen. Nach der Reparatur von Amelogenin-Chitosan (CS-AMEL) Hydrogel für 7 Tage wurde ein emailartigen Schicht mit einer Dicke von 15 um auf der geätzten Zahnschmelzoberfläche ist. Die neu gewachsene Schicht von hochgeordneten Anordnungen von Kristallen mit einem Durchmesser von ~ 50 nm, wächst vorzugsweise entlang der c-Achse, senkrecht zur Oberfläche (Pfeile in

Diskussion

Während der Mineralgehalt des Schmelz Hoch macht es das härteste mineralisiertem Gewebe im menschlichen Körper, ist dieses biokeramischen anfällig Entmineralisierung Prozesse, die oft auftreten, wie Karies oder Erosion. Genmutationen können auch dazu führen, dünnen oder weichen Zahnschmelz, was zu einer Reihe von Erbkrankheiten der Schmelzfehlbildungen genannt Amelogenesis imperfecta ^20. Oral Gesundheitsprodukten Fluorid oder CPP-ACP enthalten, sind auf dem Markt seit mehreren Jahren (dh, La...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dritter Backenzahn des Menschen	Ostrow School of Dentistry der University of Southern California	N/A	Die menschlichen Backenzähne wurden nach den Standardverfahren für die Extraktion an der Ostrow School of Dentistry der University of Southern California entnommen und mit Genehmigung des Institutional Review Board behandelt.
Rekombinantes Pocin-Amelogenin	Expression und Reinigung  im Labor	N/A	rP172, in voller Länge
Chitosan	Sigma-Aldrich	448877	Mittleres Molekulargewicht, 75-85% deacetylierte
Phosphorsäure	VWR	AA033266
Essigsäure Gletscher	VWR	A036289
Natriumhydroxid	VWR	BDH9292
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	223506
Dibasisches Natriumphosphat wasserfrei	VWR	BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP	Agilent Technologies Inc.
Ammoniumsulfat	VWR	BDH8001
Trifluoressigsäure	VWR	AAAL06374
Acetonitril	VWR	BDH1103
Magnesiumchlorid	VWR	BDH0244
Kaliumdihydrogenphosphat	VWR	BDH9268
Kaliumchlorid	VWR	BDH0258
Ammoniumchlorid	VWR	AAAA15000
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure)	VWR	AAA14777
Natriumfluorid	VWR	AA11561
Tris-gepufferte Kochsalzlösung	Bio-Rad	170-6435	10-fach; TBS
Rinderserumalbumin	EMD Millipore	12659	CalBioChem, Albumin, Rinderserum, Fraktion V, niedrige Schwermetalle
Triton X-100	EMD Millipore	TX1568-1
Hühner-Anti-Amelogenin	N/A	N/A	Ein Geschenk von Prof. Malcolm Snead, University of Southern California
Rinder-Anti-Hühner-IgY-FITC	Santa Cruz Biotechnologie	Sc-2700
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-System	Agilent Technologies Inc.	Varian Prostar 210
C4 Säule	Phänomen;	Jupiter 5μ 300A
Rasterelektronenmikroskopie	JEOL	JSM-7001
FIB-SEM	JEOL	JIB-4500
Transmissionselektronenmikroskopie	JEOL	JEM-2100F
Digitale Diamantsäge mit niedriger Geschwindigkeit	MTI Corporation	SYJ-150
Fluoreszenzmikroskopie	Leica	DMI3000 B
Ultraschallreiniger	Branson	2510	42 kHz, 100 W
Nano-Eindringkörper	Agilent Technologies Inc.	MTS XP