Das Ziel dieses Protokolls ist es, mittels elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR) überwachter Redox-Titrationen verschiedene Cofaktoren von Saccharomyces cerevisiae Nar1 zu identifizieren. Redox-Titrationen bieten eine sehr robuste Möglichkeit, Mittelwertpotentiale verschiedener redoxaktiver Cofaktoren in Enzymen und Proteinen zu erhalten.
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Methodenartikel
EPR Wachte Redox-Titration der Cofaktoren von
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Elektronenspinresonanz (EPR) überwacht Redoxtitrationen sind eine leistungsfähige Methode, um die Mittelpunktpotential von Kofaktoren in Proteinen zu bestimmen und in ihrer nachweisbaren Redoxzustand Identifizierung und Quantifizierung der Cofaktoren.
Die Technik ist komplementär zur direkten Elektro (Voltammetrie) nähert, wie sie geben keine Information über Elektronentransferraten, aber die Identität und Redoxzustand der Cofaktoren in die untersuchte Protein. Das Verfahren ist allgemein anwendbar auf jedes Protein, das eine paramagnetische Elektronenresonanz (EPR) nachweisbar Cofaktor.
Eine typische Titration benötigt 2 ml Protein mit einem Cofaktor-Konzentration im Bereich von 1-100 uM. Das Protein wird mit einem chemischen Reduktionsmittel (Natriumdithionit) oder Oxidationsmittel (Kaliumferricyanid), um die Probe bei einer bestimmten Potential poise titriert. Ein Platindraht und eine Ag / AgCl-Referenzelektrode auf ein Volt angeschlossenMessgerät, das Potential der Proteinlösung zu messen. Ein Satz von 13 verschiedenen Redoxvermittler verwendet, um zwischen den Redox-Cofaktoren des Proteins und den Elektroden zu äquilibrieren. Proben werden bei verschiedenen Potentialen und der Elektronenspinresonanz-Spektren, charakteristisch für die verschiedenen Redox-Cofaktoren in die Protein gezogen, werden gemessen. Die Handlung der Signalintensität gegenüber dem Potential der Probe wird unter Verwendung der Nernst-Gleichung, um das Mittelpunktpotential des Cofaktors zu bestimmen.
Einleitung
Auffällig ist, dass die grundlegenden chemischen Prozesse Erhaltung des Lebens auf diesem Planeten, die Photosynthese, die Stickstoff-Fixierung und die Atmung, werden von großen Proteinkomplexen, die eine breite Palette von organischen und anorganischen Redox-Cofaktoren katalysiert. Es wurde geschätzt, dass etwa 30% aller Proteine eines oder mehrere Metall-Cofaktoren enthalten. 1,2 Identifizierung und Charakterisierung der Redox-Cofaktoren können durch direkte Elektrochemie (zB Proteinfilm Voltammetrie) oder Redox-Titration festgestellt werden. Die beiden Techniken ergänzen sich in ihrer Art und Anwendbarkeit. Voltammetrie bietet schnelle Bestim....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Einrichtung und Lösungen
- Bereiten Pufferlösung, die 100 mM Tris, 250 mM NaCl und 10% Glycerin bei pH 8,5. Entlüften Sie die Puffer durch Spülen mit Argon. Führen Sie den Puffer in einer anaeroben Kammer.
- Teilen Sie den Puffer in zwei Bereiche. Zu einer Portion (Puffer A) in 1 mM DL-Dithiothreit (DTT, M r 154.25 g / mol) und 1 mM L-Cystein. Der andere Teil (Puffer B) enthält keine Reduktionsmittel.
- Bereiten Oxidations- und Reduktionslösungen. Auffüllen auf 1 ml Lösung von 2, 20 und 200 mM Kaliumferricyanid (FIC, M r 329,26 g / Mol) und Natriumdithionit (SD, M r 174.11 g / mol) in anaer....
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Ergebnisse
Die Redox-Titration des Eisen-Schwefel-Cluster-enthaltenden Proteins Nar1 aus Saccharomyces cerevisiae, führte zur Identifizierung von drei verschiedenen Kofaktoren: Nar1: a [3Fe 4S] -Cluster, a [4Fe-4S] Cluster und eine einkernige Fe entfernt (Figur 1) . Die EPR-Signale werden durch ihre g-Werte gekennzeichnet: für die [3 Fe-4S] + g z 2.01 g Crossover 2,00 (1B); für die [4Fe-4S] +, g z 2,02 g y 1,93, g x
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Diskussion
Die Reihe von 13 Redoxmediatoren ermöglicht eine Redoxgleichgewicht in der Lösung im Bereich von -0.45 bis +0,3 V gegen SHE (Tabelle 1 und Abbildung 3). Weit oberhalb und unterhalb dieser Potentiale alle Mediatoren entweder vollständig reduziert oder vollständig oxidiert und somit keine weitere Äquilibrierung mit den redox-aktiven Zentren des Proteins erfolgen kann. Dies ist ein wichtiger Begriff, wie in der Literatur manchmal Redoxtitrationen sind mit nur zwei oder drei Vermittler durc.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium von der Dutch National Research School Kombination, Katalyse durch Chemical Design (NRSC-Katalyse) Kontrollierte unterstützt. Dr. HY Steensma und Dr. GPH van Heusden an der Universität Leiden sind für ihre Unterstützung bei der rekombinanten Expression von S. anerkannt cerevisiae Nar1.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Referenzelektrode (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemikalien | Sigma-Aldrich | ||
| EPR-Spektrometer | Bruker | ||
| N,N,N',N' -Tetramethyl-p-phenylendediamin (TMPD) & Middot; (HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-Dichlorphenol-Indophenol (DCIP), Natriumsalz | 620-45-1 | ||
| Phenazin-Ethosulfat (PES) | 10510-77-7 | ||
| Methylenblau | 122965-43-9 | ||
| Resorufin, Natriumsalz | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonat (Indigokarmin) | 860-22-0 | ||
| 2-Hydroxy-1,4-naphtachinon | 83-72-7 | ||
| Anthrachinon-2-sulfonat Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Phenosafranin | 81-93-6 | ||
| Safranin O | 477-73-6 | ||
| Neutralrot | 553-24-2 | ||
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | ||
| Methyl viologen | 1910-42-5 |
Referenzen
- Lippard, S. J., Berg, J. M. Principles of Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. (1994).
- Bertini, I. Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. 611(1994).
- Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzym....
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Nachdrucke und Genehmigungen
