Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing

Summary

Extrazellulären Vesikeln spielen eine wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs oder als potentielle therapeutische Mittel bei der Arzneimittelabgabe oder der regenerativen Medizin. Dieses Protokoll stellt Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe isoliert und nicht-isoliert extrazellulären Vesikeln in verschiedenen Flüssigkeiten mit abstimmbaren Widerstandspulsmessung.

Abstract

Extrazellulären Vesikeln (EVS), einschließlich "Mikrovesikeln" und "Exosomen", sind sehr reichlich in Körperflüssigkeiten. Die letzten Jahre haben einen enormen Anstieg der Zinsen in EVs erlebt. EVs sind gezeigt worden, um eine wichtige Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs. Darüber hinaus haben EVs Potential als therapeutische Mittel, beispielsweise als Arzneimittelabgabevehikel oder der regenerativen Medizin. Aufgrund ihrer geringen Größe (50 bis 1.000 nm) genaue Quantifizierung und Größe Profilierung der Elektrofahrzeuge ist technisch anspruchsvoll.

Dieses Protokoll beschreibt abstimmbaren Widerstandserfassungsimpuls (TRP)-Technologie unter Verwendung des qNano System kann verwendet werden, um die Konzentration und Größe EVs bestimmen. Das Verfahren, das durch eine Nanoporengröße auf der Detektion von EVs auf ihre Übertragung beruht, relativ schnell ist, reicht die Verwendung von kleinen Probenmengen und nicht PUR erfordernkation und Konzentration von Elektrofahrzeugen. Neben dem regulären Betrieb Protokoll ein alternativer Ansatz beschrieben, unter Verwendung von Proben gespickt mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Größe und Konzentration. Diese Echtzeit-Kalibrierungstechnik kann verwendet werden, um technische Hürden überwunden werden, die auftreten, wenn die Messung direkt EVs in biologischen Flüssigkeiten.

Introduction

Vesikel aus zellulären Ursprungs sind sehr reichlich in Körperflüssigkeiten ^1. Diese sogenannten extrazellulären Vesikeln (EFD) (50 - 1.000 nm in der Größe) werden entweder durch Fusion von Mehr vesikulären Körper mit der Zellmembran oder durch eine direkte außen knospe der Zellmembran gebildet. In den letzten Jahren hat das wissenschaftliche Interesse an Elektrofahrzeugen stark erhöht, was zu einer Fülle von EV orientierte Publikationen, in denen neue Funktionen und Eigenschaften von Elektrofahrzeugen werden beschrieben ^1. EVs sind nun angenommen, dass in einer breiten Palette von physiologischen und pathologischen Prozessen wie Signaltransduktion, Immunregulation und Blutgerinnung ^1-4 einbezogen werden. Bei Krebs, Elektrofahrzeuge scheinen eine Rolle bei der Bildung von ^5,6 premetastatic Nischen, die Übertragung von Pro-Krebs Inhalt ^7,8 und Anregung der Angiogenese ⁸ zu spielen. Daneben werden EVs als Zusteller von Therapeutika ⁹ erforscht.

Trotz dieser deEntwicklungen bleibt zuverlässige Quantifizierung von Elektrofahrzeugen eine Herausforderung. Traditionell sind indirekte Verfahren zur Quantifizierung verwendet, die auf der Bestimmung des Gesamtproteingehalts oder spezifischen Proteinen beruhen. Obwohl allgemein verwendet, müssen diese Techniken nicht für die Protein-per-EV Unterschiede ausmachen, und nicht zwischen gefährdend Proteinaggregate und Proteinen in EVs unterscheiden. Darüber hinaus erfordern diese Techniken Isolierung von Elektrofahrzeugen, die in vielen Fällen einen Vergleich der EV-Konzentrationen in biologischen Proben, nicht möglich ist.

Daher werden Anstrengungen unternommen, um neue Methoden, die für mehr präzise und direkte Messung EV ¹⁰ erlauben zu entwickeln. Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von einstellbaren Pulswiderstandserkundung (TRP) für eine zuverlässige Quantifizierung und Größe Profilierung der Elektrofahrzeuge.

Derzeit ist die qNano Gerät an (Abbildung 1a) ist das einzige kommerziell verfügbare Plattform für trpS. In TRP, punktiert eine nicht-leitende elastische Membran witen einer Nano-Poren trennt zwei Fluidzellen. Einer der Fluidkammern ist mit der interessierenden Probe gefüllt, während die andere Zelle mit partikelfreien Elektrolyten gefüllt. Durch Anlegen einer Spannung wird ein Ionenstrom / elektrischem Strom geschaffen, das bei der Übertragung von Teilchen durch die Poren verändert wird (Abbildung 1b). Die Stärke dieses Stroms Blockade ("resistive pulse") ist proportional zu dem Volumen des Teilchens ¹¹ (Figur 1c). Die Blockade Dauer kann verwendet werden, um das Zeta-Potential der Teilchen, die auf die Partikeleigenschaften wie Ladung oder die Form ¹² verlässt bewerten. Größe Profilierung unbekannter Partikel kann durch Vergleich der Widerstandsimpulse, die durch den unbekannten Teilchen mit den Widerstandsimpulse, die durch Kalibrierung Teilchen mit einem bekannten Durchmesser verursacht geführt werden. Neben der Größe einer Blockade Fall wird die Rate von denen diese auftreten, gemessen. Diese Zählrate relies von der Partikelkonzentration. Da die Konzentration und die Geschwindigkeit der Blockaden linear proportional ^13, unter Verwendung eines einzigen Kalibrierungsprobe mit Partikeln bekannter Konzentration und Teilchengrße ermöglicht die Messung der Konzentration ¹⁴ und Größenverteilung ¹¹ einer unbekannten Probe.

Die Bewegung der Teilchen durch die Nanopore wird elektro kinetisch (elektrophoretische und elektroosmotische) und Fluidkräfte ¹⁵ bestimmt. Durch Verwendung der variablen Druckmodul (VPM) eine Druckdifferenz zwischen den Fluidzellen können als zusätzliche Kraft induziert werden. Aufbringen von Überdruck erhöht sich die Strömungsrate der Teilchen, die von Nutzen sein können, wenn die Partikelkonzentration niedrig ist. Auch kann Druck aufgebracht werden, um die Wirkung der elektrokinetischen Kräfte zu reduzieren. Dies ist besonders wichtig bei der Verwendung von Nanoporen mit relativ kleinen Porendurchmesser (NP100, NP150 und NP200 möglicherweise) so oft für den Nachweis von EVs verwendet.Für diese Nanoporen, auch bei der Anwendung erheblichen Druck, die elektrokinetische Kräfte, je nach Partikeloberflächenladung, bleiben nicht vernachlässigbare ^16. Durch die Messung der Partikelrate bei Mehrfachbelastungen, ein elektro kinetisch korrigiert und damit genauer, kann EV-Konzentration berechnet werden.

Hier werden detaillierte Protokolle bereitgestellt, um die Größenverteilung und Konzentration von Elektrofahrzeugen zu ermitteln. Neben dem regulären Betrieb Protokoll wird ein alternativer Ansatz beschrieben, bei dem Proben mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Größe und Konzentration ¹⁷ versetzt. Diese Echtzeit-Kalibrierungsverfahren kann verwendet werden, zu überwinden einige der technischen Probleme auftreten, wenn die Messung EVs direkt in biologischen Flüssigkeiten, wie Urin, Plasma und Zellkulturüberstand, oder wenn die Stabilität der Nanopore über einen langen Zeitraum der Messzeit kann nicht sichergestellt.

Protocol

1. Standard Operating Protocol

1.1 Einstellungen und Probenvorbereitung

1. Schließen Sie das Gerät an einen Computer mit dem Izon Control Suite-Software installiert.
2. Wählen Sie die Nanoporengröße zu verwenden: für die Größe und Konzentrationsmessung von Elektrofahrzeugen ein NP150 (Zielgrößenbereich von 85 bis 300 nm) oder NP200 (Zielgröße Bereich 100 - 400 nm) werden am häufigsten verwendet. Beim Arbeiten mit Elektrofahrzeugen, die isoliert wurden, unter Verwendung eines Protokolls, das die Entfernung von größeren EVs beispielsweise beinhaltet, indem die Probe durch einen 220 nm-Filter, ein Poren NP100 (Zielgrößenbereich von 70 bis 200 nm) verwendet werden. Beim Arbeiten mit Elektrofahrzeugen in einer biologischen Probe oder EVs isoliert mit einem anderen Protokoll kann die NP200 verwendet werden, da es weniger häufig verstopft. Andere Nanoporen wie der NP300 (Zielgrößenbereich von 150 bis 600 nm) oder der NP400 (Zielgröße 200 - 800 nm) oder sogar größer Nanoporen, für größere Arten von Elektrofahrzeugen verwendet werden.
3. Wählen Sie die Polystyrol-Abgleichation Teilchen, die im Schritt 1.1.2 ausgewählt Nanopore ergänzen. Für eine NP100, NP150 und NP200 Nanopore verwenden Sie die CPC100, CP100 und CPC200 Partikel auf. Für eine genaue Größenabschätzung, sicherzustellen, dass die Kalibrierung Partikel haben eine ähnliche Größe wie die unbekannten Teilchen.
4. Um eine gute Homogenität der Kalibrierungspartikeln Wirbel kurz (30 Sekunden) zu gewährleisten. Optional gelten Beschallung, um Aggregate zu entfernen.
5. Verdünne die Eichpartikel in PBS auf die Zielkonzentration in einem Volumen von mindestens 40 ul. Hinweis: Die Zielkonzentration variiert in Abhängigkeit von dem in Schritt 1.1.2 ausgewählt Nanopore basiert. Zielkonzentrationen sind mit den Nanoporen geliefert.
6. Anzuwenden und direkt entfernen 78 ul PBS auf der unteren Flüssigkeitszelle; Diese Benetzung der unteren Fluidkammer verringert die Gefahr von Luftblasenbildung unter der Nanopore, wenn die Anwendung eines Elektrolyten auf der unteren Fluidkammer, wenn der Nanopore in Position ist.
7. Platzieren Sie die Nanopore auf die Arme 4 des Instruments. Verwendungdie digitale Messschieber, um den Abstand zwischen zwei gegenüberliegenden Armen messen, und geben Sie den Abstand in mm in den "Stretch" Eingabefeld ein und klicken Sie auf "Kalibrieren strecken", um die Nanoporen-Strecke zu kalibrieren.
8. Strecken die Nanopore 47 mm, durch Drehen der Seitenscheibe und somit der Abstand zwischen den gegenüberliegenden Armen des Gerätes, bevor Sie das 78 ul PBS in der unteren Fluidzelle.
   Hinweis: Elektrische Störungen können die Qualität der Messungen wesentlich beeinflussen. Bei Verwendung eines Laptops, um die Izon Control Suite Software ausführen, stellen Sie sicher, dass der Laptop an das Stromnetz mit einer geerdeten Steckdose und Stecker. Mobiltelefon gehalten wird nahe dem Instrument kann auch eine Quelle für elektrische Störungen sein. Elektrische Störungen als ständig wiederholt Spitzen in der Baseline-Strom beobachtet, oft mit Root Mean Square (RMS) Lärm> 10 pA.
   Hinweis: Fast alle Puffer kann verwendet werden, um die Kalibrierung Teilchen und EVs für trpS CHARAKTERI verdünnenrung. Die Anwesenheit von Salzen ist eine Voraussetzung für die Errichtung eines elektrischen Stroms. EV-Messungen verwenden PBS als Puffer. Kalibrierung Partikel sollten immer in dem gleichen Puffer verdünnt werden, da die Elektrofahrzeuge, um genaue Messungen zu gewährleisten.

1.2. Bestimmen Sie die optimalen Einstellungen für Mess

Hinweis: Vor der Aufnahme ist es wichtig, eine optimale Messeinstellungen festzulegen. Die Blockade Größenordnung von einem Teilchen, das durch die Nanopore verursacht ist abhängig von der aufgebrachten Dehnung und der angelegten Spannung. Für zuverlässige Messungen sollte der RMS-Rauschen 0,1 nA <10 pA und der Modus Blockade Größenordnung sollte>.

1. Legen Sie den oberen Flüssigkeitszelle und Schutzkäfig auf der Nanoporen-und einzuführen 40 ul verdünnt Kalibrierung Teilchen in der oberen Flüssigkeitszelle. Verwenden Sie die VPM zu ≥0.8 kPa Überdruck anzuwenden.
2. Reduzieren Sie die aufgebrachte Dehnung langsam in Richtung 44 mm, während die Analyse der Ereignisse Blockade durch die Kalibrierung verursachtPartikel. Hinweis: Wenn man den Porendurchmesser die Bewegung von Partikeln durch die Nanopore wird weniger wahrscheinlich, und somit die Partikelgeschwindigkeit abnehmen. Jedoch aufgrund der erhöhten relativen Blockade der Poren einen größeren Blockade Ereignis eintreten wird, was zu verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Erhöhung der Spannung kann weiter die Blockade Größenordnung zu erhöhen, sondern können auch die RMS-Rauschen zu erhöhen.
3. Reduzieren Sie die Strecke, bis geeignete Blockade Ereignisse (Abbildung 1c) werden im Bedienfeld "Signal Trace" beobachtet. (Modus> 0,1 nA) und die entsprechende Partikelrate> 100 / min. Anmerkung: Die Partikelgeschwindigkeit eine weniger strenge abgeschnittenen jedoch als Messungen von mindestens 500 Teilchen eignen, werden Partikelgeschwindigkeiten von <100 / min führen Aufzeichnungsdauer von mindestens 5 min. Partikelraten über 2.000 / min in weniger genaue Messungen ergeben (wenn vorhanden, sollte die Probenverdünnung durchgeführt werden).

1.3 Messung der KalibrierungPartikel, Waschen der Uper Fluidzelle und Probenmessung

1. In diesem Abschnitt EVs aus dem Zellkulturüberstand des Glioblastoma multiforme Zelllinie U87-MG / EGFRvIII sind gekennzeichnet. Die Isolierung und Herstellung dieser EVs wurde zuvor beschrieben und visualisiert ^18.
2. Legen die Eichpartikel in der oberen Fluidzelle. Druck ausüben (zum Beispiel 0,8 kPa) unter Verwendung des VPM und Rekord> 500 Partikel.
3. Bei Durchführung einer Multi-Druckmessung, erhöhen Sie den Druck (zum Beispiel auf 1,0 kPa) und nehmen Sie eine zweite Kalibrierungsdatei. Anmerkung: Ein Minimum von 0,2 kPa Differenz erforderlich.
4. Entfernen Sie die Eichstichprobe aus der oberen Flüssigkeitszelle. Waschen Sie die obere Fluidkammer 3 mal mit 100 ul PBS, um Restpartikel zu entfernen. Vor der Einführung der Probe in der oberen Flüssigkeitszelle, verwenden fusselfreien Tuch, um restliche PBS von der oberen Flüssigkeitszelle zu entfernen.
5. Einführung der Probe in den oberen Fluidzelle. Sicherzustellen, dass die Ausgangsstrom innerhalb 3% beobachtet bei der Messung der Eichpartikel Ausgangsstrom. Wenn nicht innerhalb von 3%, gelten die unten beschrieben, um die Basislinienstrom stabilisieren Strategie. Übernehmen Sie die genaue Druck, um den Eichpartikel aufgebracht und notieren Sie die Beispieldateien.
   Hinweis: Die Partikelrate Grundstück sollte konstant Partikeldetektion (Abbildung 2a) anzuzeigen. Im Fall einer plötzlichen Unterbrechung der Partikelerkennung, einem plötzlichen Abfall des Ausgangsstroms oder eine plötzliche Zunahme der RMS-Rauschen kann die Poren verstopft werden; damit die Aufzeichnung unterbrochen werden. Um die Grundlinie, tippen Sie auf Wiederherstellung oder verdrehen die Schirmkappe, gelten den Kolben oder vollständig zu entfernen die Nanoporen und waschen Sie es mit VE-Wasser und ersetzen Sie es auf dem Instrument.
   Hinweis: Alternativ erhöhen die Nanopore Strecke bis 47 mm in Kombination mit maximalen Druck von der VPM für etwa 5 min.

1.4 Datenanalyse

1. Klicken Sie auf "; Registerkarte Analysieren von Daten ", um den Analyseteil der Software geben. Verarbeiten die Kalibrierung und Beispieldateien mit der rechten Maustaste auf das "Unverarbeitete Dateien" und wählen Sie "Dateien verarbeiten".
2. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen neben der Probe in der Spalte "kalibrierte" zu koppeln, die Beispieldateien auf der Eichaufnahmen. Wählen entsprechenden Probe und Kalibrierungsdateien und klicken Sie auf "OK". Hinweis: Wenn Sie die Option Multi-Druckkalibrierung wählen Sie die "Multi-Druck Kalibrierung" Registerkarte auf der linken Seite zu koppeln mehrere Proben auf mehrere Kalibrierungsdateien.
3. Einmal erfolgreich gekoppelt, wird der Izon Control Suite Software verschiedene Proben Eigenschaften wie Größenverteilung zeigen (Abbildung 2b), Baseline-Laufzeiten, Halbwertsbreite (FWHM) und eine Konzentrationsanalyse. Optional: Für jede Probe, einzelne Datenpunkte können exportiert werden als kommagetrennte Datei.

2.lternative Protocol - Spick Proben mit Kalibrierungskügelchen

Hinweis: In der Regel können die Standard-Betriebsverfahren bei der Arbeit mit isolierten Elektrofahrzeugen verwendet werden. Bei der Arbeit mit nicht-isolierten Elektrofahrzeuge in biologischen Proben, oder isoliert EV Vorbereitungen mit großen Proteinaggregaten kontaminiert ist, mit dem Instrument kann eine Herausforderung sein. Diese Herausforderungen bestehen vor allem aus einer hohen Rate von Nanoporen-Sperrung (plötzlicher Abfall der Ausgangsstrom), die Unfähigkeit, Baseline-Ströme innerhalb von 3% der Kalibrierungsmessung oder signifikante Unterschiede in der Partikelraten zwischen identischen Proben (Abbildung 3a) erholen. Für Proben, die Anzeige dieser Schwierigkeiten ein alternatives Protokoll zu quantifizieren wurde EVs ¹⁷ entwickelt. Diese Methodik beruht auf der Einführung von größeren Polystyrol-Kalibrierung Perlen in der Probe von Interesse (Bild 3b). Ein detailliertes Verfahren für diese alternative Protokoll wird unten diskutiert.

2.1. ProbeVorbereitung

Hinweis: Bei der Herstellung von Proben mit der alternativen Methode, ist es wünschenswert, einen EV-zu-Wulst-Verhältnis von rund 1. Auch zu etablieren, ist es wichtig, eine "Perle der Kalibrierung nur" umfassen Probe, um eine genaue "Gating" der erlauben Kalibrierungsperlen und die Anzahl der Hintergrundpartikel (zB Proteinaggregate) im Puffer vorhanden bestimmen.

1. Zentrifuge 100 ul Zellkulturüberstand für 7 min bei 300 xg
2. Fügen Sie 20 ul der Überstand auf 20 ul PBS und 10 ul 75 fach verdünnt 335 nm Polystyrol-Kügelchen (Aktien 7E10 / ml).

2.2. Probenmessung

1. Verwenden Sie die in Abschnitt 1.2 beschriebene Strategie, um die optimalen Geräteeinstellungen zu bestimmen.
2. Messen Sie den 'Kalibrationsbeadsets nur "Probe zuerst. Sicherzustellen, dass die Hintergrunderkennung von kleinen nicht-Bead-Partikel so niedrig wie möglich ist (<10% der Kügelchen).
3. Messen Sie jeden einzelnen sample einmal vor der Aufnahme repliziert, um Schwankungen in Nanoporen-Bedingungen gleich auf die verschiedenen Proben zu verteilen. Messung mindestens 3 Wiederholungsversuche für jede Probe.
4. Wiederholen Sie die 'Perle der Kalibrierung nur "Probe nach Beendigung der Aufnahme aller Proben.

2.3. Datenanalyse

Hinweis: Bei Verwendung der alternativen Protokoll, hat die exklusive Nutzung des Izon Control Suite Software, die nicht für die Berechnung der Konzentration ausreichen. Zusätzliche Tabellenkalkulationssoftware erforderlich ist. Tabelle 1 zeigt ein Beispiel für die Berechnung der Konzentration der in 3 dargestellten Muster.

1. Öffnen Sie die "Perle Kalibrierung nur" Probe und ein oder mehrere Beispieldateien.
2. Bestimmen Sie, welche Blockade Ereignisgröße (in nA) als Cut-off für EVs und Unterscheidung zwischen Polystyrolkügelchen verwendet werden kann. Bestimmung der Blockade Wert (NA) entsprechend dem linken Fuß des Polystyrolkügelchen Population ( Abbildung 3b). Hinweis: die Gleich Einstellung der bin-Größen aller Messungen (in 'ViewSettings ", die durch Klicken auf die" Pop-up "Button" Individuelle Blockade Trace "zugegriffen wird, eingestellt werden).
3. Rufen Sie die Werte der Gesamtpartikelzahl für jede Probe, indem Sie auf das "Particle Analysis Summary" Reiter der Probe.
4. Filtern Sie die Datensätze mit Hilfe der Cut-Off-Wert in Schritt 2.3.2 bestimmt. durch die Auswahl der "Datenfilterung" Pop-up. Display nur Partikel kleiner als die cut-off.
5. Rufen Sie die Werte der EV Zahl für jede Probe aus der "Particle Analysis Summary".
6. Subtrahieren der Menge an Elektrofahrzeugen aus der gesamten Teilchen, die Menge von Kalibrierungsperlen zu bestimmen.
7. Bestimmen Sie die EV-zu-Wulst-Verhältnis durch Division EV Zahl durch Kalibrationsbeadsets Zahl.
8. Bestimmen Sie die durchschnittliche Hintergrundverhältnis durch Mittelung der Verhältnisse für jede & bestimmt# 8220; Wulst nur "Eichprobe. Ziehen Sie diesen Wert aus jeder einzelnen Probe.
9. Multiplizieren Sie die eingestellte EV-zu-Wulst-Verhältnis durch die Konzentration der Kalibrierung Perlen, um die Konzentration von Elektrofahrzeugen für jede Probe zu bestimmen.
10. Multiplizieren Sie die Konzentration in Schritt 2.3.9 von der durch die Zugabe von Kalibrierungsperlen auf die Probe eingeführt EV EV Verdünnungsfaktor gefunden. Hinweis: Im Beispiel Probe-Setup, die Gesamt Verdünnung der Probe in PBS und Kalibrierung Perlen ist 2,5-mal und damit die Konzentration in Schritt 2.3.9 wurde, sollten von 2,5 multipliziert, um die Roh-EV Probenkonzentration zu bestimmen.
11. Statistiken berechnen, wie die Durchschnittswerte, Standardabweichung und der Standardfehler des Mittelwerts für jede Gruppe von Wiederholungen.
    Hinweis: In einigen Fällen überlappen zwischen EVs und Stachel Polystyrol-Kügelchen beobachtet. Wenn die Korrektur für die Unterschätzung der EV Konzentration, die erforderlich ist, sollten die Proben ohne Stachel Polystyrol-Kügelchen gemessen werden. Verwenden Sie die gleiche Schneidab, wie in Schritt 2.3.2 entschlossen, einen "Wulst zu EV"-Verhältnis zu bestimmen, um das Verhältnis von Elektrofahrzeugen, die im Bereich der Stachel Polystyrol-Kügelchen fallen zu berechnen. Dieser Wulst-zu-EV-Verhältnis sollte dem EV-zu-Kügelchen-Verhältnis in Schritt 2.3.8 bestimmt zugesetzt werden.

2.4. Optional: EV Größe Verteilung über die alternative Methode.

1. Zweimal öffnen Sie eine Sample-Aufnahme in der Control Suite-Software.
2. Stellen Sie die Filtermöglichkeiten von einer der Proben nur aus Teilchen größer als der Cut-off-oben bestimmt. Dies wird die Kalibrierung Partikel nur anzuzeigen.
3. Stellen Sie die filtrierte Probe zu "Kalibrierungsdatei" und geben Sie den Modus Größe der Kalibrierung Perlen.
4. Koppeln die Beispieldatei und die "Kalibrierung" in Schritt 2.4.3 erstellt, wie in 1.4.2 beschrieben. Die Beispieldatei zeigt nun eine Größenverteilung von beiden EVs und Kalibrierung Perlen auf der Basis der Stachel Kalibrierung Perlen.
   Hinweis: Die Standard-Operting-Protokoll wird meist genügen für die Bestimmung der Größe-Distributionen von Elektrofahrzeugen. Manchmal jedoch sind exakte Pufferkomponenten unbekannt (zum Beispiel in Plasma oder Urin), die es unmöglich ist, eine Probe der Kalibrierung Perlen in dem gleichen Puffer wie die Elektrofahrzeuge von Interesse vorzubereiten macht. Für EV Größe Schätzung in diesen besonderen Bedingungen kann eine EV Probe mit Partikeln versetzt Kalibrierung verwendet werden.

Results

Um trpS Instrument weist eine nichtleitende Nanopore auf die Arme 4 der Maschine (1a) angeordnet werden und eine Spannung (Abbildung 1b) aufgebracht werden. Sobald eine elektrische Ausgangsstrom hergestellt ist, werden resistive Impulse, die durch Partikel, die durch die Pore verursacht erkannt werden, wie in Abbildung 1c veranschaulicht.

EVs wurden aus dem Zellkulturüberstand der Glioblastom-Zelllinie U87-MG / EGFRvIII durch Ultrazentrifugation gereinigt. Eine stabile Partikelrate-Grundstück wird beobachtet, wenn die Messung der isolierten Elektrofahrzeuge (Abbildung 2a) auf einem NP100 Nanoporen. Diese stabile Partikelrate-Grundstück ist für eine zuverlässige EV Konzentrationsmessung erforderlich. Nach der Kopplung der EV-Sample-Aufnahme auf einer Aufnahme von 115 nm Polystyrol-Kalibrierung Perlen, eine Größenverteilung (Abbildung 2b) und Konzentration Schätzung der EV-Probe erhalten werden (Daten nicht gezeigt).

(Figrue 3a). Dies führt zu ungenauen Schätzungen EV Konzentration. Durch Aufstocken der Probe mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Konzentration und Größe kann eine EV-zu-Wulst-Verhältnis bestimmt werden. 3b veranschaulicht die nach Spick Zellkulturüberstand mit Polystyrol-Kügelchen von 335 nm groß erzielten Ergebnisse. Zwei klare Populationen beobachtet. Die Partikel induzieren eine Blockade von weniger als 0,46 nA sind entschlossen EVs, die größeren Partikel bestimmt Polystyrol-Kügelchen. Das Verhältnis von Elektrofahrzeugen zu Polystyrol-Kügelchen, die das Ausgangskonzentration von Elektrofahrzeugen (Tabelle 1) zu berechnen. 3c veranschaulicht die Größenabschätzung der beiden Populationen auf der Basis der Stachel Polystyrol-Kügelchen. Die Nanoporen-Setup verwendet Wiederkonsultiert bei der Erkennung von EVs> 140 nm groß. Dies kann durch Verringerung der Nanoporenöffnung gesenkt werden, jedoch wird dies auch in mehr Verstopfung Ereignissen führen.

Abbildung 1: qNano Instrument und Betriebsmodus. (A) Foto des Instruments. Ein Nanopore auf dem Instrument angeordnet ist, Abtrennen eines unteren Flüssigkeitszelle von einem oberen Fluidzelle. Die Fluidzellen werden aus Umwelt elektrische Störungen durch die Schirmkappe (B) Illustration skizziert abstimmbaren Widerstandspulserkennung (TRP) geschützt.. Eine nicht-leitfähige elastische Nanopore zwischen zwei Fluidkammern. Durch Anlegen einer Spannung ein elektrischer Strom durch die Pore in der Nanopore punktiert hergestellt. Als extrazelluläre Vesikel durch die Nanopore bewegen, wird der Ionenstrom verändert und als Widerstandsimpuls erkannt. In trpS die Öffnungsgröße der Nanopore kann durch Strecken der Nanopore, indem der Abstand zwischen den gegenüberliegenden Armen des Instruments oder Verringerung dieses Abstandes eingestellt werden (verringert oder erhöht). (C) Ausführungsbeispiel der Widerstandsimpulse. Die Größe eines einzelnen Widerstands Impuls ist proportional zum Volumen des Partikels. Größere Impulse geben größere Teilchen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Partikelanzahl-Grundstück und Größenverteilung von Mess isoliert EVs von U87-MG / EGFRvIII Zellkulturüberstand (A) erhaltenen Partikelzahl-Plot zeigt insgesamt konstanten Partikelerkennung.. Kurze Reduzierung der insbesonle Detektion wurde zwischen 80 und 100 Sekunden der Aufzeichnung beobachtet. Nach Unterbrechung der Aufzeichnung und die Erschließung der Abschirmung Kappe, stabilisierte sich die Partikelrate nach dem wurde die Aufnahme fortgesetzt. (B) Die Größenverteilung der isolierten Elektrofahrzeuge wird nach der Kalibrierung der unbekannten Probe (EVS) bis 115 nm Polystyrol-Kalibrierung Perlen aufgetragen. (5 nm bin Größe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: trpS Quantifizierung von Elektrofahrzeugen in Zellkulturüberstand mit dem alternativen Protokoll. (A) Typische Partikelrate Parzellen erhalten bei der Messung von Elektrofahrzeugen direkt in einer biologischen Flüssigkeit. Porenverstopfung verursacht kurze Unterbrechungen und Schwankungen in der Rate der Partikelerkennung. JederGrundstück stellt eine Wiederholungsmessung der gleichen Probe. (B) drei Wiederholungsgrößenverteilung Graphen nach Spick Zellkulturüberstand mit 335 nm Polystyrol-Kalibrierung Perlen erhalten. Alle Partikel induzieren eine Widerstands Puls von weniger als 0,46 nA als EVs ausgewählt. (C) Die Stachel Polystyrol-Kügelchen kann eine Größenverteilung der Probe zu erhalten. (5 nm bin Größe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Messung	Kalibrierung nur # 1	Kalibrierung nur # 2	Überstand # 1	Überstand # 2	Überstand # 3
Durchschnittsstrom (NA)	117	120	116	118	120
Partikelgeschwindigkeit	172	194	250	246	196
Cutoff verwendet (na)	0,46	0,46	0,46	0,46	0,46
Gesamtpartikel	303	317	489	488	454
Extrazellulären Vesikeln	3	1	213	215	213
Stachel Kalibrierung Perlen	300	316	276	273	241
EVs / Kalibrierung Perlen	0,01	0,003	0,772	0,788	0,884
Probe - Hintergrund			0,765	0.781	0,877
Extrazelluläre Vesikel (10 7) / Ml			7.14	7,29	8.18
Probe 2.5x verdünnt
Raw Konzentration EVs (10 7) / ml			17.85	18.22	20,46

Tabelle 1:. Beispiel Berechnung des EV-Konzentration mit dem alternativen Protokoll Ein Cut-off-Wert ist entschlossen, EVs von der Kalibrierung Perlen zu unterscheiden. Anschließend kann die Gesamtzahl der EVs und Perlen abgerufen werden. Für jede Messung wird die EV-zu-Kügelchen-Verhältnis berechnet wird. Die Höhe der Hintergrund-Teilchen im Elektrolyten (zB Proteinaggregate) wird durch Mittelung der EV-zu-Wulst-Verhältnis für die einzelnen Messungen der "Kalibrierung Perlen nur" Probe berechnet. Für jede Probe der Hintergrund-Verhältnis von dem erhaltenen Verhältnis subtrahiert. Diese adjusted-Verhältnis wird durch die Konzentration der Kalibrierungskügelchen in der Probe (: 9.33e7 / ml in diesem Beispiel) multipliziert. Um die rohen Konzentration von Elektrofahrzeugen zu ermitteln, wird die erhaltene Konzentration durch die Gesamt EVs Verdünnungsfaktor (2,5 in diesem Beispiel) multipliziert.

Discussion

Die in diesem Angebot Manuskript Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe EVs mit trpS beschriebenen Protokollen. Die wichtigsten Vorteile der trpS Plattform sind die geringen Stichprobengröße relativ kurze Messdauer und das Fehlen der erforderlichen Probenmanipulation.

Voraussetzung für eine genaue Messung ist trpS gleichen Bedingungen zwischen Kalibrierung und Probenmessungen zu halten. Dies umfasst die Verwendung von identischen Puffern sowie identische Geräteeinstellungen, wie beispielsweise Nanoporengröße, Spannung und Druck aufgebracht. Die ursprüngliche VPM fehlt ein Mechanismus für die exakte Einstellung der aufgebrachte Druck, wodurch kleine Unterschiede in der angewandten Druck zwischen den Proben verursacht. Außerdem kann die Verdampfung der Flüssigkeit in der Grundierung VPM geringe Druckdifferenzen zu induzieren, wenn die Messung zu unterschiedlichen Zeitpunkten und das VPM daher oft neu grundiert werden. Diese Einschränkungen haben möglicherweise durch die Einführung des VPM2, gelöst worden, diehat einen Klick-basierte Skalierung und Luftdruck.

Die in diesem Manuskript beschrieben alternatives Protokoll ist besonders geeignet für die Messung von EVs in nicht gereinigten biologischen Proben ^17. Wir glauben, daß Pufferkomponenten, wie beispielsweise Zucker, Lipide, Proteine ​​und andere Grobschmutz kann in einigen Fällen die Messbedingungen zu viel für das Standardprotokoll beeinflussen anwendbar. Neben der Kalibrierung Perlen auf die Probe und nicht den Vergleich von zwei separaten Messungen führt "Echtzeit-Kalibrierung '. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere bei einem Vergleich Proben (zB Blutplasma von verschiedenen Spendern), die verschiedene und / oder unbekannten Fluidhintergrundgehalte haben. Obwohl die Unterschiede zwischen Elektrofahrzeugen und Polystyrol-Partikel (zB Partikeldichte und Oberflächenladung), theoretische Modelle als auch experimentelle Daten vorhanden sind unterstreichen die Benutzerfreundlichkeit von Polystyrol-Kügelchen für die Quantifizierung und Größe Profilierung von Elektrofahrzeugen,unter der Voraussetzung, dass erhebliche Druck ausgeübt wird, ^15,19. Um den Einfluss von elektrokinetische Kräfte zu minimieren, ist die Nutzung der relativ größeren NP150 / NP200 Nanoporen und signifikant positiven Druck geraten.

EVs und Kalibrierung Perlen werden nach Größe unterschieden. Folglich hat der Nanopore durch Anlegen Strecke bis zu einem Durchmesser, bei dem Nachweis beider EVs und die größeren Partikel Kalibrierung beobachtet geöffnet werden. Seit der Eröffnung des Poren wird die Empfindlichkeit in Richtung kleinerer Partikel zu verringern, EVS nur größer als eine bestimmte Größe aufgezeichnet (oft EVs> 120 nm bei Verwendung eines 335 nm Kalibrationsbeadsets). Die Nachweisgrenze für Elektrofahrzeuge auf etwa 90 nm verringert werden kann, mit 203 nm Kalibrierung Perlen auf einer NP150 Nanoporen. Dies kann jedoch nicht lebensfähig sein, wenn Setup größeren EVs induzieren häufige Verstopfung der Nanoporen. Das Vorhandensein dieser Behinderung EVs kann die Verwendung einer Einrichtung zwingen, wenn eine Population von EVs, zu klein, um reach die Detektionsschwelle, werden nicht erkannt.

Die Schwierigkeit für den Betrieb des Systems erhöht sich, wenn versucht wird, die kleiner als 100 nm Größe zu messen. In solchen Fällen kann der Nachweis durch Erhöhung der Salzkonzentration des Elektrolyten verbessert werden. Eine erhöhte Ionenkonzentration relativ erhöht Blockade Grßen für kleine Teilchen (größeres Signal-zu-Rausch-Verhältnis) zu induzieren. Die Lebensfähigkeit dieser Technik für Messungen von Elektrofahrzeugen muss aber überprüft werden, da erhöhte Salzkonzentrationen kann die Lautstärke von Elektrofahrzeugen beeinflussen.

Abschließend kann trpS Plattform für den direkten Quantifizierung und Charakterisierung von Elektrofahrzeugen Größe verwendet werden. Da keine Isolation oder EV Manipulation (Antikörper-Bindungs ​​oder Fluoreszenzmarkierung) erforderlich ist, ist die Plattform für die direkte Quantifizierung EV in biologischen Flüssigkeiten. Eine alternative Protokoll vorgesehen ist, die vorteilhaft für Proben werden kann, wo Pufferkomponenten induzieren signifikante Poren clogging Ereignisse, so dass zuverlässige Nutzung des Standard-Protokoll nicht lebensfähig.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qNano-Instrument	Izon Science Ltd.	N/A
Modul mit variablem Druck	Izon Science Ltd.	N/A
Nanopore	Izon Science Ltd.	NP100, NP200	Die Wahl der Nanopore variiert je nach Zielpartikel. Für unterschiedliche Targetgrößen stehen unterschiedliche Nanoporen zur Verfügung.
Kalibrierung Partikel	Izon Science Ltd.	CPC100, CPC200, CPC400	Kalibrierpartikel sind in verschiedenen Größen erhältlich.
Beschallungsbad	Mehrfach verfügbar		Basis-Beschallungsbad ist ausreichend
(Mini) Vortexer	Mehrfach verfügbar
Lift-freies Gewebe	Mehrfach verfügbar
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Mehrfach verfügbar
Windows-basierter Computer
Izon Control Suite 2.2	Izon Science GmbH	N/A
Tabellenkalkulationssoftware	Mehrere verfügbar	N/A